Abstract
Elektrofysiologische eigenschappen van de cellen worden vaak bestudeerd in vitro, na hen te distantiëren van hun eigen omgeving. Echter, de studie van elektrische transmissie tussen verre cellen in een organisme nodig vivo-artefact vrij opnames van cellen ingebed in hun eigen omgeving. De overdracht van elektrische signalen van gewonden naar verwonde gebieden in een fabriek heeft sinds lange gewekt het belang van de botanici. Het floëem, de levende deel van de plant vasculatuur die is verspreid over de plant, is voorgesteld als een belangrijke weefsel in elektrische transmissie in planten. Het gebrek aan geschikte elektrofysiologische werkwijzen tal van uitdagingen voor de studie van de elektrische eigenschappen van het floëem cellen in vivo. Hier presenteren we een nieuwe benadering voor intracellulaire elektrofysiologie van zeef elementen (SE) dat levende luizen of andere phloem geeft Hemipteran insecten gebruikt, geïntegreerd in de elektrische penetratie graph (EPG) circuit. De veelzijdigheid, robuustheid en nauwkeurigheid van deze methode was het mogelijk om op te nemen en in detail het wond geïnduceerde elektrische signalen in SE centrale aderen van de modelplant Arabidopsis thaliana 1. Hier laten we zien dat EPG-elektroden gemakkelijker uitvoerbaar voor intracellulaire elektrofysiologische opnames van SE's marginale aders, alsmede het vermogen van SE antwoorden met elektrische signalen naar verschillende externe stimuli bestuderen. De EPG benadering toegepast op intracellulaire electrofysiologie SE kan worden toegepast om een grote verscheidenheid van plantensoorten, in een groot aantal planten / insecten combinaties, en voor veel onderzoek gericht.
Introduction
Het vermogen om interlokale elektrische signalen te produceren, is een voordelige eigenschap van meercellige organismen waarmee efficiënte reacties op externe stimuli. Dit kenmerk is onafhankelijk geëvolueerd in planten en dieren, en vormt derhalve een geval van convergerende evolutie. Aangezien de elektrische signalen zijn gekoppeld met belangrijke functies bij dieren als neurale transmissie en spiercontractie, de moleculaire basis, het overdrachtmechanisme en functies van stimulus geïnduceerde elektrische signalen bij dieren zijn onderwerp van intensief onderzoek. In tegenstelling, heeft-stimulus geïnduceerde elektrische signalering in planten weinig onderzoek aandacht gekregen. Hoewel planten geen zenuwen of spieren, lijkt er voldoende bewijs om aan te nemen dat de stimulus geïnduceerde elektrische signalen in planten spelen een belangrijke rol in hun reactie op omgevingsfactoren.
Het floëem, de levende component van de installatie vasculatuur, is voorgesteld als een belangrijke subStrate voor de overdracht van stimulus opgewekte elektrische signalen, gestimuleerde / beschadigd ongestimuleerde / onbeschadigde gebieden 2. De belangrijkste cellen van het floëem de zeef elementen (SE), relatief eenvoudig, langgerekte cellen. De uiteinden SE zijn verbonden met andere SEs, die een continue lage weerstand, zeef buissysteem dat is verspreid over de fabriek. Er zijn echter maar weinig studies over de elektrische eigenschappen van deze zeer gespecialiseerde cellen. In deze eerdere studies, onderzoekers toegankelijk SE met ofwel glas micro-elektroden 3 of met glazen elektroden die werden gekoppeld aan planten-ingebracht stiletten van bladluizen, na stylectomy (snijden) 4. Glas micro-elektroden zijn gemaakt uit glas capillairen die worden getrokken aan één uiteinde met warmte in dunne stift kleiner dan 1 micrometer in diameter, en vervolgens gevuld met een KCl-oplossing. Een Ag / AgCl of platina draad ingebracht in het KCl-gevulde glaselektrode wordt dan verbonden met de versterkeringang, en een referentelectrode wordt in het bad rond de cel van belang, het circuit te voltooien. Deze opstelling wordt het verschil in potentiaal tussen de extracellulaire referent elektrode en de intracellulaire meetelektrode, dwz de membraanpotentiaal van de cel 5. Met deze methode Umrath maakte de eerste intracellulaire opname van een plantencel met de algen Nitella 6,7. Nitella is een relatief eenvoudig organisme grote cellen, en daarom vatbaar voor intracellulaire elektrofysiologie experimenten. In tegenstelling, het inbrengen van intracellulaire glazen elektroden in de kleine cellen van meercellige, driedimensionale landplanten is technisch veeleisend, is zeer bekwaam onderzoeker, evenals geavanceerde visualisatie, micromanipulatie en anti-vibratie apparatuur. Hoewel glaselektroden geschikt opnemen van oppervlakkige cellen in planten, zoals wortel- epidermiscellen 8, intracellulaire recordings uit cellen diep ingebed in de plant weefsel, zoals SE, zeer waarschijnlijke oorzaak-schade geïnduceerde responsen, verwarrende resultaten. In 1989, Fromm en Eschrich melding gemaakt van het gebruik van een andere methode, genaamd het "bladluis methode, waarbij glazen elektroden gekoppeld bladluis stylets na stylectomy 4. De bladluis methode is minimaal invasieve, omdat flexibele stiletten niet leiden tot weefsel of celschade als glaselektroden doen. Bladluis stiletten zijn van de natuur geweldige uitvinding voor de plantaardige penetratie en bladluizen zijn aanzienlijk meer ervaren dan mensen in het vinden van SE. Helaas is deze bladluis methode is ook zeer veeleisend op het gebied van technische expertise en apparatuur. Bovendien is het succes van elk experiment dat deze techniek implementeert volledig afhankelijk van de bladluis zich in voedingsmodus - de stylet stabiel ingebracht in een SE ten tijde van stylectomy. Denken in retrospectief, kan men zien dat de kans op succes van deze techniek kon ik geweestETER door aan de experimentele opstelling van een instrument om de identificatie of de bladluis stilet in het SE bij de toepassing stylectomy.
In 1964, McLean en Kinsey beschreven een 'elektronische controlesysteem' voor de studie van het eetgedrag van bladluizen in real time 9,10. In dit systeem, de bladluis en de stylet doorgedrongen plant werden opgenomen in een elektrisch circuit. Later, in 1978, Tjallingii bedacht een gemodificeerde versie van het systeem, genaamd het "Electrical Penetration Graph (EPG) -systeem 11,12. Dat het oorspronkelijke elektronische controlesysteem was gevoelig voor de resistentie afkomstig potentialen slechts met EPG systeem, de elektromotorische kracht (EMK) afkomstig potentialen, bijvoorbeeld, geproduceerd in de fabriek of het insect zou kunnen zijn naast potentialen verband met geregistreerde weerstand (R) in het insect. Dit is een belangrijke verbetering, omdat beide signaalcomponenten, emf en R,bieden biologische relevante informatie over gebeurtenissen tijdens planten binnendringen door bladluizen. Wat de EPG voorversterker gevoelig voor de R-componenten is de relatief lage ingangsweerstand van 1 GQ, dat dicht bij het gemiddelde van de plant / luisresistentie. Een kleine offset spanning (figuur 1, V) van ongeveer 100 mV wordt op de plant, die vervolgens wordt verdeeld over planten- en insectencellen enerzijds, en de ingangsweerstand anderzijds. De spanningen en hun veranderingen worden gemeten op een punt (figuur 1 A, B) tussen het insect en de ingangsweerstand. Daarom is de R-componenten vertegenwoordigen fabriek-luisresistentie modulaties van de offset spanning, terwijl de EMF-componenten zijn een bepaalde fractie van plantaardige potentials aan de stilet tip en mogelijkheden als gevolg van de insecten. De plant potentials - het meest relevant hier - zijn vooral membraanpotentialen van de plantencellen doorboord door de bladluis stiletten. Het insect potentialen lijken vooralstreaming potentials veroorzaakt door vloeiende bewegingen binnen de twee stylet kanalen, dat wil zeggen, het eten en de speekselklieren kanalen; geen interne zenuw of spier potentials worden opgenomen in de EPG. In de praktijk is de stilet punt functioneert als een elektrode. Alle plantencellen negatief geladen in ten opzichte van de positieve buitenkant van de cel. De elektrische stroom (dat wil zeggen, de beweging van geladen ionen in waterige oplossing) stroomt van binnen naar buiten en vice versa is zeer beperkt vanwege de hoge weerstand van het celmembraan. Normaal wordt de rustpotentiaal wordt constant gehouden. Echter, wanneer negatieve ionen verhuizen of positieve ionen bewegen door het celmembraan, wordt de membraanpotentiaal af, daarom, het depolariseert. Depolarisatie treedt op bij cel excitatie. Ionen bewegen dan in of uit wanneer specifieke ionkanalen in het membraan worden geopend of wanneer het membraan beschadigd is en ionen lekken in en uit. Alle cellen hebben ionenkanalen en pompen in tHij plasmamembraan dat de membraanpotentiaal zijn rustniveau meenemen herstel van de oorspronkelijke concentratie van verschillende ionen in de cel. De rustpotentiaal en de veranderingen emf onderdelen, en derhalve de EPG techniek is geschikt om deze te meten.
Figuur 1. EPG-elektroden. De EPG-elektrode is een levende bladluis geïntegreerd in de elektrische Penetration Graph (EPG) circuit, waarvan stilet in een zeef element (SE) in stabiele voeding modus wordt geplaatst. Indien het stilet gespietst SE in rust (paneel A), de spanning in het circuit opgenomen door EPG, stabiel en op rustpotentiaal niveau (Paneel C, Rest). Indien de SE wordt bekrachtigd, het membraan depolariseert (panel B), die wordt gevisualiseerd in de EPG een geleidelijke verhoging van de spanning (paneel C, depolarisatie). Aangezien de ionenbalans in de SE terug te rusten, dat wil zeggen het repolarizes, de spanning opgenomen door EPG geleidelijk af naar de rest potentiële niveau (Panel C, repolarisatie). In paneel C, "A" en "B" verwijzen naar de in panelen A en B, respectievelijk scenario. V = Instelbare offset spanningsbron. Ri = Input weerstand. Parallel aan de 1 GQ externe weerstand, de versterker een inwendige (in de OpAmp) 1,5 TΩ hoge weerstand (kaders A en B, in grijs). Met de afstandsbediening van de schakelaar de EPG pre-amp kan worden veranderd van normaal tot, die het mogelijk maakt het verkrijgen van zeer nauwkeurige spanning waarden-modus EMF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In de volgende paragraaf geven we de lezer met een eenvoudige protocol voor het uitvoeren van EPG experimenten dat geldig is voor zowel insecten-gericht en plant gerichte studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bladluis Rearing
Opmerking: De keuze van de planten en bladluissoorten voor EPG opnames afhankelijk van het onderzoeksdoel. Voor studies op Arabidopsis thaliana, de bladluis melige koolluis geschikt is.
- Achter B. brassicae bladluizen in een kas Brassica oleracea. Houd de planten die voor bladluis fokken in kooien om verontreinigd andere planten. Keep-bladluis fokken van planten en experimentele installaties (in ons geval B. oleracea en A. thaliana) in aparte kamers, om besmetting van de experimentele planten met bladluizen voorkomen.
- Transfer bladluizen om verse planten ongeveer elke 2 weken, voordat het veroorzaken aanzienlijke schade plant, of het bereiken van overbevolking. Transfer 10-20 volwassen bladluizen om een frisse opfok plant om een nieuwe kolonie te starten.
- Monitor opfok planten regelmatig op verontreiniging door ongewenste soort bladluis, andere insecten, herbivoren, bladluis sluipwespen en fungi dat de gezondheid van de bladluiskolonie kunnen beïnvloeden.
- Verzamel volwassene, vleugelloze bladluizen tot een week na hun laatste molt voor EPG opname.
- Na de experimenten, de terugkeer van de experimentele planten die niet werden gebruikt om de groeikamer, aangezien zij vaak een aantal nakomelingen dat tijdens de opname, die onverwacht kan verontreinigen andere planten is geproduceerd.
2. Insect bedrading voor EPG-opname
- Insecten elektroden te verkrijgen messingsschakelaar pennen (nagels, Ø 1,2 mm), dunne koperdraad (Ø 0,2 mm), zeer dunne gouden draad (Ø ca. 20 urn), op waterbasis zilver lijm, een eenvoudige kleine soldeerbout met solderen vloeistof en met hars gevulde solderen draad, stereomicroscoop met 10x vergroting, kleine schaar of scalpel, twee fijne tang en een piepschuim plaat of doos. Opmerking: Een vortex mixer kan nuttig zijn. Opmerking: De stap-voor-stap protocol elektroden maken is in figuur 2.
- Voor bladluishandling en lijmopdracht verkrijgen: een zachte borstel aquarel camelhair (maat 2 of kleiner) en insecten kunnen bijvoorbeeld die gebruikt voor insect verzamelingen, hoewel een fijne naald of tandenstoker kunnen eveneens werken. Stap 4 laat zien hoe de EPG-opname te starten.
- Stap 1.
Opmerking: Stappen 1 en 2 hieronder laten zien hoe insect elektroden minus de bladluis te bereiden. Stap 3 laat zien hoe een bladluis aan te sluiten op de elektrode. Vacuüm fixatie van de bladluis wordt aanbevolen tijdens de bedrading, maar niet altijd nodig is voor langzaam bewegende soorten (bv B. brassicae).- Schakel de soldeerbout en smelt sommige soldeerdraad op de punt (Figuur 2A). Bevochtig het hoofd van de koperen connectorpen met enkele solderen vloeistof (Figuur 2B) en dompel het in de gesmolten solderen metaal (figuur 2C).
- Breng een mantel van gesmolten soldeer metaal op een uiteinde van een 1-2 cm lang stuk van de dunne koperdraad (Fig2D). Breng dan de pen- en koperdraad samen tegen de hete bout (Figuur 2E) bewegen en ze samen weg afkoelen en stollen (figuur 2F).
- Stap 2.
- Grondig schudden (of vortex) de flacon met zilver lijm voor enkele minuten tot een gladde emulsie wordt getoond. Cut (schaar of scalpel) een paar stukken van de gouddraad (ongeveer 1,5 cm) op het object plaat van de stereomicroscoop (figuur 2G).
- Neem een koperen pin met gesoldeerde koperdraad (in paragraaf 2.3) en dompel het vrije uiteinde van de koperen draad in de kleine zilveren lijm reservoir dat zal hebben verzameld aan de binnenkant van het deksel van de flacon na het openen (figuur 2H). Opmerking: Slechts een kleine druppel nodig.
- Verplaats de lijm gedompeld eind van de koperdraad om het stuk van gouddraad, terwijl het opheffen van het ene uiteinde om te voorkomen vegen de lijm op de stereomicroscoop object plaat. Probeer coppe overlappenr en gouddraad enkele mm (figuur 2I), het verdelen van de lijm langs de overlap van de twee draden.
- Wacht tot de lijm is voldoende om de draden verenigde houden gedroogd. Controleer de lijm contact na het drogen en voeg wat verse lijm met een kleine pin of een ander stuk koperdraad als sommige delen van de aangesloten draden tonen lijmvrije onderdelen.
- Na het insect elektrode gereed, slaan, bijvoorbeeld ingebracht in een stuk piepschuim.
Opmerking: De lengte van de gouddraad zal de vrijheid van verkeer van de bladluis te bepalen: als het is te kort (minder dan 5 mm), de bladluis kan voelen beperkt en zal niet normaal te gedragen; als het te lang (> 2 cm), wordt de bladluis vrij bewegen. Bladluizen hebben de neiging om te verhuizen naar de adaxiale kant van de bladeren, indien toegestaan om. Als de gouden draad raakt het blad, zal het signaal worden kortgesloten.
- Stap 3.
- De bladluis kan op zijn plaats worden gehouden door het zuigen met behulp van een vacuüm; In dit geval, installeert thij zuigen apparaat onder de stereomicroscoop. Plaats de zuigopening in het midden van het veld.
- Grondig Schud de flacon met zilver lijm voor enkele minuten (of vortex) tot een gladde emulsie wordt gevormd. Verzamel een bladluis met het borsteltje.
- Schakel de zuiginrichting en monteer de bladluis bij de zuigopening (Figuur 2J), met de achterkant van de buik zich tot de experimentator. Met het fijne penseel, verwijder elk oppervlak was uit de buik (overvloedig in kool bladluizen).
- Open de lijm flesje en nat een pen met een zeer kleine druppel zilver lijm (figuur 2K). Breng de druppel van het zilver lijm op de achterkant van de bladluis buik (Figuur 2L-M). Laat deze druppel volledig droog gedurende enkele minuten krachtig weer schud de lijm flacon en voeg een tweede druppel zilver lijm op de top van de eerste. Opmerking: Terwijl de zilveren lijm is een elektrische geleider, is het niet veroorzaken significantbeschadiging cuticula van het insect.
- Na het sluiten van de lijm flesje, plaatst het vrije uiteinde van de gouden draad in de natte druppel en houdt de draad stil terwijl de lijm volledig drogen (Figuur 2N). Vermijd vegen lijm op poten of antennes en een bladluis weggooien als dit is gebeurd.
- Schakel de zuig fixatie apparaat en til het insect (figuur 2O). Indien nodig, gebruik dan een fijn penseel om te helpen bij de opheffing van de bladluis van de zuiginrichting.
Opmerking: bedrading B. brassicae geen vacuüm nodig, omdat ze kunnen worden aangesloten op een stuk van een precisie laboratorium weefsel, het ruwe oppervlak van hetwelk de bladluis voldoende grip zodat het niet zal worden opgeheven na het aanbrengen van een druppel van natte lijm op het achterlijf. Na lijm drogen kan men de bladluis van het weefsel met behulp van een penseel heffen. - Steek de koperen pin met de bedrade insect in de piepschuim en indien nodig, verderbedrading alle andere insecten te gebruiken voor de EPG opnamesessie.
Opmerking: Deze protocollen voor bedrading bladluizen werken goed voor ons. De gebruiker kan zijn / haar eigen werkwijze voor het bedraden bladluizen vinden.
- Stap 4.
- Zet planten in de kooi van Faraday (Figuur 2P) op een niet-geleidende drager: gebruik Petrischalen of een plaat van glas of kunststof.
- Plaats een plant elektrode in de bodem van elke pot. Steek de koperen pin van de bedrade insect in de ingang van de EPG voorversterker (Figuur 2Q). Opmerking: de bodem elektrode niet overeenkomt met de aardelektrode in andere elektrofysiologische technieken. Het heeft de offset spanning die nodig is om te passen en te compenseren elektrode polarisatie voltages.
- Op de interface van de acquisitie software Stylet +, met vaste sample frequentie van 100 Hz, voer een bestandsnaam, geeft de opnametijd, en schrijf tekst om de details van het experiment te geven (behandeling, plant / inse ct soorten, etc.) in reactie lijnen 2 en 3.
- Laat de insecten op een geschikte landingsplaats van de plant en de opname sessie te starten door te klikken op de knop Start van de acquisitie software interface (Stylet +).
Opmerking 1: maximaal 8 kanalen gelijktijdig in een EPG ingesteld. Een EPG-electrode of meer EPG-elektroden per plant kan worden gebruikt.
Opmerking 2: wanneer de focus van het onderzoek is de bladluis gedrag, start de opname voor fabriek toegang tot de bladluizen om te voorkomen dat het missen van de eerste fabriek penetratie activiteiten. - Voor het bestuderen van de elektrofysiologische respons van SE op stimuli, wacht tenminste 10 minuten na de bladluis in floëem fase is ingegaan, teneinde te waarborgen dat de luis is in een aanhoudende floëem inname fase en dat het signaal basislijn stabiel. Alleen dan, beginnen alle planten stimulatie experiment.
tp_upload / 52.826 / 52826fig2.jpg "/>
Figuur 2. Het maken van EPG-elektroden met bladluizen of andere Hemipteran insecten voor elektrische penetratie grafiek (EPG) opnames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Panelen AI, stappen die nodig zijn om EPG-elektroden minus de bladluis te bereiden. Eerst, smelt een stuk soldeer metaal op het uiteinde van een soldeerbout (A). Vervolgens dompel de kop van de messing pen in een daling van het solderen vloeistof (B), en neem contact op met de gesmolten metaal op de soldeerbout tip (C). Direct na deze stap, contact het uiteinde van een koperdraad om het uiteinde van de soldeerbout, om het lijmen aan het hoofd van de messing pen (EF). Met een scalpel of mes, snijd een stukje gouddraad (G). Onderdompelinghet vrije einde van de koperdraad (verbonden bij het andere einde met de messing pen) op het witte lijm (H) en snel lid de gouddraad te (I) voor de zilveren opdroogt. De gouddraad is een goede geleider, en kan worden gepolariseerd. In werkelijkheid, in de meeste gevallen de polarisatie te klein om te worden gedetecteerd, en zo ja, kan worden gecompenseerd door de offset spanning (V).
Panelen JO, stappen voor een bladluis (of ander Hemipteran insecten) op de elektrode. Ten eerste, til een bladluis met een fijn aquarel penseel en plaats het op de opening van het vacuüm zuiginrichting (J). Zet de vacuümpomp en bedek de luchtklep gat met een stuk papier om zuiging toe te passen. Dompel het uiteinde van het insect pen in de zilver lijm (K), en zet een druppeltje lijm bovenop de buik van de bladluis is, onder een stereomicroscoop (LM). Binnen devolgende ~ 20 sec, voor de zilveren lijm druppel op de bladluis droogt, steek het einde van de gouden draad van het insect elektrode in de natte druppel zilver lijm, en houdt het op zijn plaats voor 1-3 min, totdat het zilver lijm geheel voorzien gedroogd (N). Op dit punt, schakelen zuigkracht door het verwijderen van het stuk papier dat het ventiel gat van de zuiginrichting bedekt en verwijder voorzichtig de bladluis, uit de zuiginrichting: het opheffen van de bladluis na bedrading vereist vaak wat hulp door een fijn penseel (O).
Panel P toont een overzicht van de volledige EPG opgezet in de kooi van Faraday, en Panel Q toont een overzicht van de plant-bladluis combinatie voor EPG. Zie hoofdstuk 2 hierboven voor een meer gedetailleerde uitleg van dit proces.
Kleine letters zijn labels die verwijzen naar de items die men nodig heeft om EPG-elektroden te maken: a: solderen bout; b: solderen gesmolten metaal;c: solderen vloeistof; d: messing connector pin (nagel); e: koperdraad; f: Ø 18μm gouden draad; g: zuig-apparaat; h: bladluis; i: op basis van water zilveren lijm; j: kooi van Faraday; k: fabriek elektrode; l: ingang (BNC) van de EPG voorversterker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een eerdere studie hebben we geïmplementeerd EPG-elektrode techniek met als doel het karakteriseren van de elektrische signalen die in SE van de middennerf tijdens rups attack 1. De middennerf is een geprefereerde insertieplaats conventionele glazen elektroden, alsook voor glas-stylet elektroden, omdat het SE-dichtheid en relatief robuust dus ontvankelijk voor de fixatie op bij het implementeren van deze technieken. Hier hebben we gebruik van de veelzijdigheid van de EPG elektrode met als doel het verzamelen van elektrofysiologische gegevens uit meer moeilijk bereikbaar SE, met name in de marginale aders van bladeren. Figuur 3 toont een typische EPG opneemt van een SE in een marginale ader van een. thaliana planten, die een elektrisch signaal opgewekt door distale verwonding bevat. Anders SE in de grote aderen, SE in marginale aderen reageerden op externe schade met een enkele, trage depolarisatiegolf die kunnen overeenkomen met deslow depolarisatiegolf in het centrum van de SE. Gemiddeld deze afstand geïnduceerde langzame depolarisatie in de SE's van de bladrand had een gemiddelde duur van 61 ± 27 sec, en de gemiddelde amplitude van 37 ± 2 mV (n = 3, gemiddelde ± SEM). Deze gegevens, gemakkelijk verkrijgbaar met EPG-elektroden, suggereren dat de wond veroorzaakte elektrische signalen in verwonde bladeren in kleine aderen aan het floëem doen verspreiden van de grote vaatbundel.
Hier hebben we benut ook de robuustheid van EPG elektroden, te onderzoeken of een SE kunnen reageren op verschillende schadelijke stimuli, binnen een tijdsinterval in de orde van minuten geleverd. Wanneer twee bladeren werden geknipt met een schaar in de bladsteel-lamina junctie, een EPG-elektrode geplaatst in een intacte blad gedetecteerd soortgelijke reacties van dezelfde SE om deze wonden (figuur 4A). In een ander experiment werd een rups als de verwonding middel. De rups eerste cut een niet-buurman blad, en dan, na een paar minuten, het verplaatst toa buurman blad en snijd het ook. Dat de eerste wond in de niet-buurman leaf induceerde slechts langzaam op transiënte depolarisatie, de tweede wond in de naaste blad geïnduceerde totale elektrisch signaal dat een langzame en een snelle depolarisatie bevat, in overeenstemming met eerdere experimenten 1. Deze gegevens tonen aan dat een zeefelement multiple verwonding toegebracht events andere bladeren, geleverd binnen enkele minuten van elkaar kunnen detecteren.
Figuur 3. Intracellulaire opnames van wond veroorzaakte elektrische signalen van zeef elementen (SE) in marginale aderen met EPG-elektroden. Elektrische Penetratie Graph (EPG) signaal segment van het floëem-voeden fase van de bladluis melige koolluis. De EPG-geregistreerde bladluis was het voeden van een SE in een marginale ader van het blad # 8 (Arabidopsis thaliana, Wild-type), die in de cartoon aan de linkerkant. De EPG signaal toont een langzame depolarisatiegolf in de marginale SE kort na het snijden van een proximale buurman blad (blad # 3). De ritmische, kleine, naar beneden snel signaalcomponenten vertegenwoordigen de streaming mogelijkheden die voortvloeien uit de ritmische hemelvaart van sap langs het voedsel kanaal van de stilet tijdens de inname fase (golfvorm E2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Meerdere elektrische respons op verwonding stimuli zeef elementen (SE) verkregen met EPG-elektroden De robuustheid van de bladluis planten (Brevicoryne brassicae - Arabidopsis thaliana). Interactie en de stabiliteit van de SE-ingevoegd bladluizen stylets belangrijke eigenschappen van EPG-electrodes dat de verwerving van lange EPG opnamen (uur) mogelijk te maken. Hier hebben we geprofiteerd van deze eigenschappen te onderzoeken of een SE kan reageren op twee afstandsbedieningen verwonden stimuli. Panel A toont de reacties van een SE twee kunstmatige verwonding evenementen (blad snijden door schaar) achtereenvolgens toegebracht aan twee verschillende buurman verlaat. Er is een interval van ongeveer 17 minuten tussen de twee stimuli. Paneel B toont de respons van een SE twee opeenvolgende natuurlijke verwonding events. Een rups 4 e instar van het koolwitje (Pieris brassicae) werd bij dit experiment gebruikt. De rups eerste cut een niet-buurman blad (in relatie met de EPG opgenomen blad), het induceren van een langzame, voorbijgaande depolarisatie. Vervolgens, ongeveer 7 minuten later, de rups snijden andere buurman blad, die een dubbele depolarisatie signaal geactiveerd (dat wil zeggen, dat een langzame en een snelle transiënte depolarisaties) in de bladluis opgenomen SE. Pijlen geven de tijd waar de wondenwerden toegebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel geeft een gedetailleerd protocol voor het maken van elektrische Penetratie Graph (EPG) opnames. De EPG techniek is goed ingeburgerd, met 100-200 actieve gebruikers wereldwijd, en het is geïmplementeerd voor veel studies over verschillende onderwerpen, bijvoorbeeld: a) waardplant resistentie tegen bladluizen en andere stylet dragende insecten 13; b) planten virus en ziekteverwekker transmissie mechanismen 14; c) insecticide werkingsmechanisme, (toxiciteit en gedragsveranderingen) 15; d) EPG zelfs nuttig aantonen dat bladluis gevechten zijn gunstig voor de winnaar zij haar feeding efficiency 16 vergroot is.
Leren om insecten draad voor EPG opname is niet moeilijk, maar vereist geduld en praktische ervaring te beheersen. Van waardoor elektroden om de uiteindelijke bedrade insect, is een praktijk gedurende een of twee weken aanbevolen. Gedurende deze tijd zal de onderzoeker zich vertrouwd / zich met de afhandeling van het gekozeninsectensoorten en om verder te gaan door alle stappen met succes. Kritische stappen zijn: solderen goed, grondig schudden van de zilveren lijm flacon alvorens een lijm druppel van de juiste grootte - niet te klein of te groot is - zorgen voor een goede elektrische en mechanische verbinding, en het plaatsen van de gouden draad binnen de zilveren druppel op de buik van het insect op een wijze die niet zal beperken de bewegingen insect. Het niet te werk kunnen uitvoeren zal resulteren in slechte elektrische verbindingen, die resulteert in gegevens van slechte of onacceptabele kwaliteit. Bij het geven van de bedrade insecten toegang tot de installatie, is het belangrijk om ze visueel tijdens het eerste half uur van de opname te controleren. Tijdens deze periode, zijn bladluizen raken gewend aan de draad, en kan uit de buurt van de gewenste opname plaats te lopen, of afzetten van de plant. Daarom kan een nodig opnieuw positioneren van de bladluizen in deze periode. Bij gedrags- doelen, geen herpositionering worden uitgevoerd nadat het eerste half hour grote verschillen tussen herhalingen te voorkomen. Slecht geplaatst of vallen-off individuen moet worden weggegooid.
Naast het verschaffen van een protocol voor EPG opname dit artikel recapituleert de eigenschappen van de EPG schakeling die voor de toepassing als een werkwijze installatie intracellulaire elektrofysiologie (figuur 1) zijn. Het belangrijkste kenmerk van EPG-elektroden dat ze zeer celspecifieke elektroden waarmee nauwkeurige intracellulaire opnamen van SE. In de normale EPG versterker, de ingangsweerstand relatief laag, 1 GQ (10 9 Ω). In de praktijk betekent dit dat de weerstand verandert tijdens opname beïnvloeden de gemeten potentiaal. Dit is niet een probleem in conventionele intracellulaire elektrofysiologie met glazen elektroden, die doorgaans gebruikt hogere input weerstand versterkers. Men kan corrigeren voor veranderingen in de weerstand die door de plasmamembraan en uit andere bronnen met behulp kalibratie peulvruchten, zoals in Salvador-Recatalà et al. 1. Een andere optie is om ingangsweerstand regelmatig EPG voorversterker verhogen, van 1 GQ tot 1,5 TΩ (1,5 x 10 12 Ω) of zelfs 1 PΩ (10 15 Ω, afhankelijk van de pre-amp's OpAmp), die overeenkomt met de ingangsweerstand in de reguliere versterkers voor intracellulaire opname. De EPG versterker met een hogere ingangsweerstand wordt hier aangeduid als de "emf-mode EPG" systeem. In deze versterker, een schakelaar schakelt de normale modus EPG versterker (zie figuur 1). In emf-mode, de EPG-elektrode methode registreert de plantencel potentials zo nauwkeurig als de gewone versterkers gebruikt in intracellulaire elektrofysiologie. Het enige verstoring nog in de EPG in emf-mode komt voort uit de EMF bestanddelen van de bladluis tijdens SE voeden, maar deze zijn vrij laag zijn en de nauwkeurigheid van de metingen niet aantasten. Als de onderzoeker wil gelijktijdig opnemen van dereactie van de bladluis milieu stressfactoren (bijvoorbeeld, veranderingen in speeksel en inslikken) en de informatie van de SE membraanpotentiaal, waarna de normale modus van de EPG wordt aanbevolen. In dat geval is de toepassing van de gekalibreerde impuls levert aanvaardbaar richtwaarden van de membraanpotentiaal.
Het ontbreken van geschikte methoden voor de aankoop van elektrische reacties van het floëem vaatstelsel in vivo is momenteel het beperken van het type en het aantal vragen met betrekking tot stress respons van planten. Onderzoekers hebben glas elektroden 3 en glas-stylet elektroden 4 voor de verwerving van intracellulaire opnames in SE in de middennerf geïmplementeerd. In tegenstelling tot deze twee soorten elektroden, kan EPG-elektroden worden geplaatst op vrijwel elk antenne deel van de plant (en zelfs op wortels, middels wortel bladluizen). Daarom zal de EPG-elektroden meer omvattende studies in plantaardige elektrofysiologie vergemakkelijken. Anothaar voordeel EPG-elektroden ten opzichte van conventionele elektroden is dat de eerste zorgen voor langere tijd opnemen, hetgeen mogelijk maakt onderzoek naar de respons van afzonderlijke SE op verschillende stimuli. Dit is een belangrijke biofysische functie, en kunnen interessante informatie over hoe SE integreren informatie uit verschillende prikkels uit de omgeving te bieden. Inderdaad, de hier vermelde gegevens blijkt dat SE reageren op verschillende schadelijke stimuli (figuur 4), die verder onderzoek naar deze belangrijke biofysische kenmerk SE rechtvaardigt.
Het aantal elektrofysiologische studies van SE is te klein om vergelijkingen tussen de verworven met EPG-elektroden gegevens en de resultaten verkregen met de traditionele glas elektroden gegevens. In feite, om onze kennis er geen gegevens in de literatuur over-stimulus geïnduceerde elektrische signalen in SE's van Arabidopsis, verworven met een traditionele methode, zijn glas elektroden of glas-stylet elektroden. Het gebruik van glas elektrodes, Rhodos encollaborateurs 3 gevonden die warmte induceert actiepotentiaal-achtige pieken in de SE's van tomatenplanten. De snelle depolarisatie dat ze toonden had een grootte van ongeveer 70 mV, die zich op een kleine, tragere depolarisatie. Dit is consistent met onze elektrische signalen verworven EPG-elektroden 1, maar er moet worden genomen bij het vergelijken van elektrische signalen van twee verschillende plantensoorten, en geïnduceerd door verschillende stimuli.
De EPG elektrode een veelzijdig en elegant hulpmiddel om de elektrofysiologische respons van floëem cellen aan verschillende soorten stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
VSR werd ondersteund door een IIF Marie Curie Grant (WOND IN DE AARDE, acroniem voor: wond veroorzaakte elektrische signalen in Arabidopsis thaliana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A.
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
