En ny ansökan av elektriska penetration Graph (EPG) för att förvärva och mäta elektriska signaler i floem sikt Elements

Abstract

Elektrofysiologiska egenskaper hos celler ofta studeras in vitro, efter att dissociera dem från deras naturliga miljöer. Emellertid studien av elektrisk överföring mellan avlägsna celler i en organism kräver in vivo, artefaktfria inspelningar av celler inbäddade i sin ursprungliga miljö. Överföring av elektriska signaler från sårade till oskadad områden i en fabrik har sedan länge väckt intresse hos botanister. Floemet, den levande delen av anläggningen vaskulaturen som är spridda över hela anläggningen, har postulerats som en viktig vävnad i elektrisk överföring i växter. Bristen på lämpliga elektrofysiologiska metoder innebär många utmaningar för studiet av de elektriska egenskaperna hos de floem celler in vivo. Här presenterar vi en ny metod för intracellulär elektro av siktelement (SE) som använder levande bladlöss eller andra floem-utfodring hemipteran insekter, integrerad i den elektriska penetration graph (EPG) krets. Mångsidigheten, robusthet, och riktigheten i denna metod gör det möjligt att spela in och i detalj studera de lindade-inducerade elektriska signaler i småföretag centrala venerna i modellväxten Arabidopsis thaliana ^1. Här visar vi att EPG-elektroderna kan lätt implementeras för intracellulära elektrofysiologiska inspelningar av bolag i marginal vener, liksom för att studera förmågan hos bolag att reagera med elektriska signaler till flera externa stimuli. EPG strategi tillämpas på intracellulära elektro av SE kan genomföras till ett brett utbud av växtarter, i ett stort antal växt / insekts kombinationer, och för många forskning syftar.

Introduction

Förmågan att producera långväga elektriska signaler är ett fördelaktigt drag hos flercelliga organismer som möjliggör effektiva reaktioner på yttre stimuli. Detta drag har utvecklats oberoende i växter och djur, och utgör därmed ett fall av konvergent evolution. Med tanke på att elektriska signaler kopplas med viktiga funktioner i djur såsom neural överföring och muskelsammandragning, den molekylära grunden, mekanismen för överföring och funktion av stimulans-inducerad elektriska signaler hos djur är föremål för intensiv forskning. Däremot har stimulus-inducerad elektrisk signalering i växter fått lite forskning uppmärksamhet. Även växter har inga nerver eller muskler, det verkar finnas tillräckligt med bevis för att anta att stimulans-inducerad elektriska signaler i växter spelar en viktig roll i sina svar på miljöfaktorer.

Floemet, den levande komponent i anläggningen vaskulaturen, har postulerats som en viktig understrate för överföring av stimulans-inducerad elektriska signaler från stimulerade / skadade till icke-stimulerade / oskadade områden ^2. De huvudsakliga cellerna i floem är siktelementen (SES), relativt enkla, långsträckta celler. Ändarna av bolag är anslutna till andra bolag, bildar en kontinuerlig, låg resistans, sikt rörsystem som är spridda över hela anläggningen. Det finns emellertid mycket få studier på de elektriska egenskaperna hos dessa mycket specialiserade celler. I dessa tidigare studier, forskare åt bolag med antingen glasmikroelektroder ³ eller med glaselektroder som är kopplade till anläggningen-införda nålar av bladlöss, efter stylectomy (skärning) ^4. Glasmikroelektroder är gjorda av glaskapillärer som dras vid en ände med värme till en fin spets av mindre än 1 pm i diameter, och därefter fylls med en KCl-lösning. En Ag / AgCl eller platinatråd, införd i KCl-fyllda glaselektrod kopplas sedan till förstärkaringången, samt en referenselektroden införes i badet som omger cellen av intresse, sluter kretsen. Denna setup registreras skillnaden i potential mellan den extracellulära referent elektroden och den intracellulära mätelektroden, dvs membranpotentialen hos cellen ^5. Med denna metod Umrath gjorde den första intracellulära inspelning från en växtcell, med användning av alger Nitella ^6,7. Nitella är en relativt enkel organism med stora celler, och därför mottagliga för intracellulära elektrofysiologi experiment. Däremot är införandet av intracellulära glaselektroder i de små cellerna i flercelliga, tredimensionella landväxter tekniskt krävande, kräver en mycket skicklig forskare, liksom sofistikerade visualisering, mikromanipulation, och anti-vibrationsutrustning. Även glaselektroderna kan användas för att spela in från ytliga celler i växter, såsom rot epidermalceller ^8, intracellulär recordings från celler djupt inbäddad i anläggningen vävnad, såsom bolag, mycket sannolikt orsaka skada-inducerade svar, förvirrande resultat. År 1989, Fromm och Eschrich rapporterat användning av en alternativ metod, kallad "bladlössens metoden", där glaselektroder är kopplade till bladlöss nålar efter stylectomy ^4. Den bladlöss Metoden är minimalt invasiva, eftersom flexibla nålar inte orsakar vävnad eller cellskador som glaselektroder gör. Bladlöss mandränger är naturens stora uppfinning för växt penetration och bladlöss är betydligt skickligare än människor att hitta bolag. Tyvärr är detta bladlöss metod också mycket krävande när det gäller teknisk expertis och utrustning. Dessutom framgången för varje experiment som implementerar denna teknik är helt beroende av bladlöss är i matningsmod - med stiletten stabilt insatt i en SE, vid tidpunkten för stylectomy. Tänkande i efterhand kan man se att oddsen för framgång av denna teknik kunde ha varit jagmproved genom att till försöksuppställningen ett instrument som gör det möjligt att identifiera huruvida aphid mandrängen är i SE vid tillämpningen stylectomy.

År 1964, McLean och Kinsey beskrev ett "elektroniskt övervakningssystem" för studier av ätbeteende av bladlöss i realtid ^9,10. I detta system, var det bladlöss och nålen-trängde anläggningen integreras i en elektrisk krets. Senare, 1978, Tjallingii utarbetat en modifierad version av systemet, som kallas "Elektriska penetration Graph" (EPG) systemet ^11,12. Den ursprungliga elektroniska övervakningssystemet var känslig för motstånds-ursprung potentialer endast med EPG-systemet, den elektromotoriska kraften (EMF) har sitt ursprung potentialer, det vill säga, som genereras i anläggningen eller i insekten, kan registreras förutom potentialer till följd av motstånd (R) i insekten. Detta utgör en viktig förbättring, eftersom både signal komponenter, EMF och R,tillhandahålla biologiskt relevant information om händelser under växt penetration av bladlöss. Vad gör EPG förförstärkaren känslig för R-komponenter är dess relativt låga ingångsmotstånd av 1 GΩ, vilket är nära genomsnittet för anläggningen / bladlöss motstånd. En liten offsetspänning (Figur 1, V) på cirka +100 mV appliceras på anläggningen, som sedan delas mellan växt- och insekts å ena sidan, och ingångsmotståndet på den andra. De spänningar och deras ändringar mäts vid en punkt (figur 1 A, B) mellan insekten och ingångsmotståndet. Därför R-komponenterna representerar växt bladlössens motståndsmoduleringar av offsetspänning, medan EMF-komponenter är en viss andel av växtpotential på sondspetsen och potentialer orsakade i insekten. Växt potentialer - mest relevanta här - är främst membranpotentialer i växtceller punkterade av bladlöss nålar. De insekts potentialer verkar vara huvudsakligenstreaming potentialer orsakade av flytande rörelser inom de två stiletten kanalerna, det vill säga mat och spott kanalerna; inga interna nerv eller muskelpotentialer registreras i EPG. I praktiken fungerar mandräng spets som en elektrodspets. Alla växtceller är negativt laddade inne i förhållande till den positiva utsidan av cellen. Den elektriska strömmen (dvs förflyttning av laddade joner i vattenlösning), som strömmar från insidan till utsidan och vice versa är mycket begränsad på grund av den höga resistansen hos cellmembranet. Normalt vilopotentialen hålls konstant. När emellertid negativa joner flyttar ut eller positiva joner flytta in genom cellmembranet, är membranpotential reduceras, dvs det depolariserar '. Depolarisering sker vid cell excitation. Joner sedan flytta in eller ut när specifika jonkanaler i membranet öppnas eller då membranet är skadat och joner läcka in och ut. Alla celler har jonkanaler och pumpar i than plasmamembran som bringa membranpotentialen till dess vilonivå genom att återställa den ursprungliga koncentrationen av olika joner inuti cellen. Den vilopotential och dess förändringar är emf komponenter, och därför är det EPG-tekniken är lämplig för att mäta dem.

Figur 1. EPG-elektroder. EPG-elektroden är en levande bladlöss integreras i elektrisk penetration Graph (EPG) krets, vars nålen sätts in i en sil element (SE) i stabil matningsmod. Om nålen-spetsas SE är i vila (panel A), spänningen i kretsen, inspelad av EPG, är stabil och på vilopotential nivå (panel C, vila). Om SE är upphetsad, dess membran depolariserar (panel B), som visualiseras i EPG som en gradvis ökning i spänning (panel C, Depolarisering). Som jonbalansen i SE-återgår till vila, dvs det repolarizes spänningen registreras av EPG minskar gradvis till resten potentiella nivån (panel C, repolarisation). I panel C, "A" och "B" hänför sig till de scenarier visade i panelerna A och B, respektive. V = Justerbar offsetspänning källa. Ri = Ingång motstånd. Parallellt med 1 GΩ externt motstånd, har ett internt (i OpAmp) höga 1,5 TΩ motstånd (paneler A och B, i grått) förstärkaren. Genom fjärrstyrning av växeln EPG förförstärkaren kan ändras från normal till EMF-läge, vilket gör det möjligt att få mycket exakta spänningsvärden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I nästa avsnitt ger vi läsaren en grundläggande protokoll för att utföra EPG experiment som gäller för både insekts fokuserad och växtfokuserad studier.

Protocol

1. Bladlöss Uppfödning

Obs: Valet av växt- och bladlöss arter för EPG inspelningar beror på forskning mål. För studier på Arabidopsis thaliana, är bladlöss Brevicoryne Brassicae lämpligt.

1. Bakre B. brassicae bladlöss i ett växthus på Brassica oleracea. Behåll de växter som används för bladlöss uppfödning i burar, i syfte att undvika kontaminerande andra växter. Håll bladlöss uppfödning växter och experimentella anläggningar (i vårt fall B. oleracea och A. thaliana) i separata rum, för att undvika kontaminering av försöksanläggningar med bladlöss.
2. Överför bladlöss till färska växter ungefär var 2 veckor innan orsaka betydande skada anläggningen, eller nå överbefolkning. Överför 10-20 vuxna bladlöss till en ny uppfödningsanläggning för att inleda en ny koloni.
3. Övervaka uppfödning växter regelbundet för förorening av oönskade bladlöss arter, andra insekts växtätare, bladlöss parasiter och fungJag som kan påverka hälsan hos bladlössens kolonin.
4. Samla vuxen, vinglösa bladlöss upp till en vecka efter det att de sista molt för EPG inspelning.
5. Efter experimenten, återförsöks växter som inte användes till tillväxtkammaren, eftersom de har ofta någon avkomma som har tagits fram under inspelningen, som oavsiktligt kan förorena andra växter.

2. Insekts Inkoppling för EPG-inspelning

1. För att göra insekts elektroder, få mässing kontaktstift (spikar, Ø 1,2 mm), tunn koppartråd (Ø 0,2 mm), mycket tunn guldtråd (Ø ca 20 pm), vattenbaserade silver lim, en enkel liten lödning bult med lödning vätska och harts kärnhus lödtråd, stereo med 10x förstoring, liten sax eller skalpell, två fina pincett och en frigolit ark eller låda. Obs: En virvelblandare kan vara användbart. Obs: steg-för-steg-protokoll för att göra elektroder visas i fig 2.
2. För aphidhantering och lim ansökan få: en liten och mjuk akvarell camelhair pensel (storlek 2 eller mindre) och insekts stift såsom de som används för insektssamlingar, även om en fin synål eller tandpetare kan fungera lika bra. Steg 4 visar hur man startar EPG inspelning.
3. Steg 1.
   Anm: Steg 1 och 2 nedan visar hur man förbereder insekts elektroder minus bladlöss. Steg 3 visar hur du ansluter en bladlus till elektroden. Vakuum fixering av bladlöss rekommenderas under ledningar, men inte alltid för långsamma arter (t.ex. B. brassicae).
   1. Slå på lödning bulten och smälta lite lödtråd vid sin spets (Figur 2A). Fukta huvudet av mässing kontaktstift med några lödning vätska (Figur 2B) och doppa den i smält lödningsmetall (Figur 2C).
   2. Applicera en mantel av smält lödtenn metall på den ena änden av en 1-2 cm lång bit av den tunna koppartråden (figur2D). Sedan föra trådstiftet och koppar tillsammans mot den heta bulten (fig 2E) och flytta dem tillsammans bort för att svalna och stelna (Figur 2F).
4. Steg 2.
   1. Skaka (eller virvel) flaskan med silver lim under flera minuter tills en jämn emulsion visas. Cut (sax eller skalpell) ett par bitar av guldtråd (av ca 1,5 cm i längd) på objektet platta stereomikroskop (figur 2G).
   2. Ta en mässing stift med lödda koppartråd (gjord i avsnitt 2.3) och doppa den fria änden av koppartråden i den lilla silver lim reservoar som har samlats på insidan av locket på flaskan efter att öppna den (Figur 2H). Obs: Endast en liten droppe behövs.
   3. Flytta lim doppade änden av koppartråden till bit av guldtråd, samtidigt lyfta ena änden för att undvika smetar lim på stereoobjektplattan. Försök att överlappa copper och guldtråd för några mm (fig 2I), fördelning av lim längs överlappningen av de två trådarna.
   4. Vänta tills limmet har torkat tillräckligt för att hålla trådarna enat. Kontrollera limmet kontakt efter torkning och lägga till några färska lim med en liten nål eller annan bit av koppartråd om vissa delar av de sammanfogade trådar visar limfria delar.
   5. Efter insekts elektroden är klar, spara den, till exempel infogas i en bit frigolit.
      Obs: Längden på guldtråd kommer att avgöra den fria rörligheten av aphid: om det är för kort (mindre än 5 mm), den bladlöss kan känna sig begränsade och kommer inte att bete sig normalt; om det är för långt (> 2 cm), kommer bladlöss röra sig fritt. Bladlöss tenderar att flytta till adaxial sidan av bladen, om den tillåts. Om guldtråden vidrör bladet, kommer signalen att vara kortsluten.
5. Steg 3.
   1. Den bladlöss kan hållas på plats med hjälp av ljus sug, genom att använda ett vakuum; i det här fallet, installera than suganordning under stereomikroskop. Placera sugöppningen i mitten av fältet.
   2. Skaka flaskan med silver lim i flera minuter (eller virvel) tills en jämn emulsion bildas. Samla en bladlus med den lilla borsten.
   3. Koppla till suganordningen och montera aphid på sugöppningen (fig 2J), med baksidan av buken vände sig till försöksledaren. Med fin pensel, ta bort någon yta vax från buken (rikligt i kål bladlöss).
   4. Öppna limmet flaskan och väta ett stift med en mycket liten droppe av silver lim (Figur 2K). Applicera droppen av silver lim på baksidan av bladlusen buk (Figur 2L-M). Låt detta droppen helt torr under flera minuter, Skaka limmet flaskan igen och lägga till en andra droppe av silver lim på toppen av den första. Obs: Medan silver lim är en elektrisk ledare, inte orsaka betydandeskador på insektens nagelbanden.
   5. Efter att ha stängt limmet flaskan, sätt in den fria änden av guldtråden i den våta droppen och hålla tråden fortfarande samtidigt som limmet torka fullständigt (Figur 2N). Undvik smet lim på benen eller antenner och kasta en bladlöss om det som hänt.
   6. Stäng av suganfixeringsanordningen och lyft försiktigt insekten (Figur 2O). Om det behövs, använd en fin pensel för att underlätta lyft av bladlöss från suganordning.
      Obs: Kabeldragning B. brassicae kräver inte ett vakuum, eftersom de kan kopplas på en bit av en precisions laboratorium vävnad, den grova yta som ger bladlöss med tillräckligt grepp så att den inte kommer att hävas efter applicering en droppe våt lim på sin mage. Efter lim torkning kan man lyfta bladlöss från vävnaden med hjälp av en fin pensel.
   7. Sätt mässingstappen med den trådbundna insekt i frigolit och vid behov, fortsätterledningar alla andra insekter som ska användas för EPG inspelningen.
      Obs: Dessa protokoll för ledningar bladlöss fungerar bra för oss. Användaren kan hitta hans / hennes egen metod för kabeldragning bladlöss.
6. Steg 4.
   1. Sätt växter i Faradays bur (Figur 2P) på ett icke-ledande stöd: använd petriskålar eller en platta av glas eller plast.
   2. Sätt en anläggning elektroden i jorden i varje kruka. Sätt mässingsstift fast insekt i ingången på EPG förförstärkaren (Figur 2Q). Obs: marken elektroden motsvarar inte jordelektroden används i andra elektrofysiologiska tekniker. Det har offsetspänning som behövs för att justera och kompensera för elektrod polarisering spänningar.
   3. På gränssnittet för förvärv programvara Stylet +, med fast samplingsfrekvens på 100 Hz, ange ett filnamn, ange inspelningstiden, och skriva text för att ange detaljer om experimentet (behandling, växt / inse ct arter, etc.) kommentar linjer 2 och 3.
   4. Sänk insekterna på ett lämpligt landningsområde av anläggningen och starta inspelningen genom att klicka på Start-knappen för förvärv programvara (Stylet +) gränssnitt.
      Anmärkning 1: högst 8 kanaler kan användas samtidigt i en EPG inrättas. En EPG-elektrod eller flera EPG-elektroder per planta kan användas.
      Not 2: när fokus för studien är bladlöss beteende, starta inspelningen innan anläggningen tillgång bladlöss att undvika att missa de första växtpenetrations aktiviteter.
   5. För att studera de elektrofysiologiska svar bolag på stimuli, vänta minst 10 minuter efter det att bladlöss har ingått floem fas, för att säkerställa att bladlöss är i en ihållande floem intag fasen, och att signalen baslinjen är stabil. Först då börjar alla växter stimulering experiment.

tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg "/>
Figur 2. Göra EPG-elektroder med bladlöss eller andra hemipteran insekter för elektrisk penetration graf (EPG) inspelningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Paneler AI, steg som krävs för att förbereda EPG-elektroder minus bladlöss. Först smälter en bit lödningsmetall på spetsen av en lödnings skruven (A). Sedan doppa huvudet av mässingsstiftet i en droppe lödning vätska (B), och kontakta det med den smälta metallen vid lödning bultspetsen (C). Omedelbart efter detta steg, kontakta änden av en koppartråd till spetsen på lödningsbulten, för att limma fast den på huvudet av mässingsstift (EF). Med en skalpell eller ett blad, skära en bit av guldtråd (G). Dipden fria änden av koppartråden (förenade vid den andra änden till mässingsstift) på silver lim (H), och snabbt ansluta sig till guldtråd till den (I), innan silver torkar upp. Den guldtråd är en utmärkt ledare, och kan vara polariserad. I verkligheten, i de flesta av fallen polarisationen är för liten för att detekteras, och om så är fallet, kan den kompenseras med offsetspänningen (V).

Paneler JO, steg som behövs för att ansluta en bladlus (eller annan hemipteran insekt) till elektroden. Först försiktigt lyfta en bladlus med en fin akvarell pensel och placera den på öppningen av vakuumsuganordning (J). Slå på vakuumpumpen och täcka luftventilhålet med ett papper för att anbringa sug. Doppa spetsen av insekten stift i silver lim (K), och sätta en liten lim droppe ovanpå bladlössens buk, under ett stereomikroskop (LM). Inomnästa ~ 20 sek, innan silver lim droppen på bladlöss torkar, sätt i slutet av guldtråd av insekten elektroden i den våta droppe silver lim, och hålla den på plats under 1-3 minuter, tills silver limmet har helt lufttorkades (N). Vid denna punkt, inaktivera sug genom att ta bort papper som täcker luftventilen hålet i suganordning och försiktigt bort bladlöss, från suganordningen: lyfta bladlöss efter ledningsdragning kräver ofta hjälp av en fin pensel (O).

Panel P visar en översikt över hela EPG ställa upp inuti Faradays bur, och Panel Q visar en översikt över växt bladlössens kombination för EPG. Se avsnitt 2 ovan för en mer detaljerad förklaring av denna process.

Små bokstäver är etiketter som hänvisar till de punkter som man måste göra EPG-elektroder: a: lödning bult; b: smält lödning metall;c: lödning vätska, d: mässing anslutningsstift (spik), e: koppartråd; f: Ø 18μm guldtråd, g: suganordning, h: bladlus, i: vattenbaserat silver lim, j: Faradays bur, k: växt elektrod; l: ingång (BNC) i EPG förförstärkaren.

Representative Results

I en tidigare studie har vi genomfört EPG-elektrodteknik i syfte att karakterisera de elektriska signaler som alstras i småföretag av midvein under larv attack ^1. Den midvein är en föredragen införingsställe för konventionella glaselektroder, samt för glas-mandrängen elektroder, eftersom det är SE-tät, och relativt robust, därför mottaglig för fixering behövs för att genomföra dessa tekniker. Här tog vi nytta av mångsidigheten hos EPG elektroden med syfte att samla elektro information från svårare att få tillgång till bolag, särskilt de i marginal venerna i bladen. Figur 3 visar en typisk EPG inspelning från en SE i en marginell ven A. thaliana växt, vilken innehåller en elektrisk signal induceras av distala sårskada. Till skillnad från bolag i större vener, bolag i marginella vener svarade på fjärr skada med en enda långsam depolariseringsvåg som kan motsvaralångsam depolariseringsvåg i centrala bolag. I genomsnitt denna distans inducerade långsam depolarisering i bolag i bladet marginalen hade en genomsnittlig löptid på 61 ± 27 sekunder, och medelamplitud av 37 ± 2 mV (n = 3, medelvärde ± SEM). Dessa uppgifter, lätt kan erhållas med EPG-elektroder, tyder på att sår-inducerade elektriska signaler i oskadad löv sprider från de stora kärl bunten till floem i mindre vener.

Här utnyttjas även robustheten i EPG elektroder, för att undersöka om en SE kan svara på olika skadliga stimuli, som levereras inom ett tidsintervall av storleksordningen minuter. När två blad skars med sax vid bladskaft-lamellen korsning, en EPG-elektrod placerad i en intakt blad detekteras liknande svar från samma SE till dessa sår (Figur 4A). I ett annat experiment framställdes en larv användes som sårande medlet. Caterpillar först skära en icke-granne blad, och sedan, efter några minuter, flyttade toa granne blad och skär den också. Medan den första såret i den icke-granne blad inducerade endast en långsam övergående depolarisation, den andra sår i grannblad inducerade fullständig elektrisk signal som innehåller en långsam och en snabb depolarisation, konsekvent med tidigare experiment ^ett. Dessa data visar att en sikt elementet kan upptäcka om flera sårskada händelser fogats till andra blad, som levereras inom minuter från varandra.

Figur 3. Intracellulära inspelningar av sår-inducerade elektriska signaler från siktelement (SES) i marginal vener med EPG-elektroder. Elektrisk penetration Graph (EPG) signalsegment i floem-matning fasen av bladlössens Brevicoryne Brassicae. EPG-inspelade bladlöss utfodring från en SE som ligger i en marginell ven av blad # 8 (Arabidopsis thaliana, Vild typ), som visas i den tecknade till vänster. EPG-signalen visar en långsam depolariseringsvåg i marginal SE strax efter styckning en proximal granne blad (blad # 3). De rytmiska, små, nedåt snabba signalkomponenter representerar strömmande potential som härrör från den rytmiska uppstigning sav i livsmedels kanalen sonden under intag fasen (vågform E2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Flera elektriska svar på såra stimuli i siktelement (SES) förvärvats med EPG-elektroder robustheten i aphid-anläggningen (Brevicoryne Brassicae - Arabidopsis thaliana). Interaktion och stabiliteten hos SE-insatta bladlöss nålar är viktiga egenskaper hos EPG-electrodes som tillåter förvärv av långa EPG inspelningar (timmar). Här tog vi nytta av dessa egenskaper för att undersöka om en SE kan svara på två fjärr såra stimuli. Panel A visar svaren från en SE till två konstgjorda sårskada händelser (blad skär av sax) följd tillfogat två olika granne lämnar. Det finns ett intervall på cirka 17 minuter mellan de två stimuli. Panel B visar svaren från en SE till två på varandra följande naturliga sårskada händelser. En ^{4: e} instar larv av kål fjäril (Kålfjäril) användes i detta experiment. Caterpillar först skära en icke-granne blad (i förhållande till EPG inspelade blad), inducerar en långsam, övergående depolarisation. Sedan ungefär 7 minuter senare, larv skära en annan granne blad, vilket utlöste en dubbel depolarisation signal (dvs innehåller en långsam och en snabb övergående depolarisationer) i aphid inspelade SE. Pilar indikerar tiden där sårenhar tillfogats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att göra elektrisk penetration Graph (EPG) inspelningar. EPG-tekniken är väl etablerad, med 100-200 aktiva användare världen över, och det har införts för många studier om olika ämnen, till exempel: a) värdväxt resistens mot bladlöss och andra Stylet bärande insekter ^13; b) växtvirus och patogena överföringsmekanismer ^14; c) insekts verkningsmekanism, (förändringar toxicitet och beteende) ^15; d) EPG har även varit till nytta för att visa att bladlöss slagsmål är fördelaktiga för vinnaren eftersom det ökar dess matningseffektiviteten ^16.

Att lära sig att koppla insekter för EPG inspelning är inte svårt men kräver tålamod och praktisk erfarenhet att bemästra. Från att göra elektroder till slut fast insekt, är en praxis period på ett eller två veckor rekommenderas. Under denna tid kommer forskaren bekanta sig / själv med hanteringen av den valdainsektsarter och att gå igenom alla steg framgångsrikt. Kritiska steg: lödning ordentligt, omsorgsfullt skaka silver lim flaskan innan ett lim droppe av rätt storlek - varken för liten eller för stor - att säkerställa god elektrisk och mekanisk koppling, och placera guld tråd i silver droppen på insekten buk på ett sätt som inte kommer att begränsa insekts rörelser. Underlåtenhet att utföra dessa steg korrekt kommer att resultera i dålig elektrisk anslutning, vilket resulterar i uppgifter av dålig eller oacceptabel kvalitet. När de lämnar den trådbundna insekter tillgång till anläggningen, är det viktigt att visuellt övervaka dem under den första halvtimmen av inspelningen. Under denna period är bladlöss blir vana vid tråden, och kan gå bort från den önskade inspelningen eller släppa av anläggningen. Därför kan man behöva åter placera bladlöss under denna period. Vid beteende mål bör ingen omplacering göras efter det första half timme för att förhindra stora skillnader mellan replikat. Dåligt placerade eller tappas-off individer ska kasseras.

Förutom att ge ett protokoll för EPG inspelning, här artikeln rekapitulerar funktionerna i EPG krets som är relevanta för dess tillämpning som en metod i växt intracellulära elektro (Figur 1). Den viktigaste funktionen av EPG-elektroder är att de är mycket cellspecifika elektroder som möjliggör korrekta intracellulära inspelningar från bolag. I den vanliga EPG förstärkaren, är ingångsmotståndet relativt låg, 1 GΩ (10 ⁹ Ω). I praktiken innebär detta att resistens ändras under inspelning påverkar den uppmätta potentialen. Detta är inte ett problem i konventionell intracellulära elektro med glaselektroder, som vanligtvis använder högre insatsmotståndsförstärkare. Man kan korrigera för förändringar i resistans till följd av plasmamembranet och från andra källor med hjälp kalibration pulser, som i Salvador-Recatalà et al. ^1. Ett annat alternativ är att öka den vanliga EPG förförstärkare ingångsmotstånd, från 1 GΩ till 1,5 TΩ (1,5 x 10 ¹² Ω) eller till 1 PΩ (10 ¹⁵ Ω, beroende på pre-förstärkarens OpAmp), vilket motsvarar ingångsmotstånd i vanliga förstärkare för intracellulär inspelning. EPG förstärkare med högre inresistans hänvisas till här som "EMF-mode EPG" systemet. I denna förstärkare, inaktiverar en omkopplaren normalläge EPG förstärkare (se figur 1). I EMF-läge, registrerar EPG-elektrod metoden växtcellpotentialer lika exakt som vanliga förstärkare som används i intracellulära elektrofysiologi. Den enda störningen kvar i EPG i EMF-läge uppstår från EMF komponenterna i bladlöss under SE utfodring, men dessa är relativt låg och inte äventyrar noggrannheten i mätningarna. Om forskaren önskar samtidig rekordreaktion av bladlöss miljöstressfaktorer (till exempel förändringar i salivering och intag) och informationen om SE membranpotentialen, då normalläge EPG rekommenderas. I detta fall tillämpa den kalibrerade pulsen ger acceptabla, ungefärliga värden av membranpotentialen.

Bristen på lämpliga metoder för förvärv av elektriska svar floemet kärl in vivo är för närvarande begränsar typ och antal frågor som rör miljöstressreaktioner av växter. Forskare har genomfört glaselektroder ³ och glas stiletten elektroderna ⁴ för förvärv av intracellulära inspelningar i bolag i midvein. I motsats till dessa två typer av elektroder, kan EPG-elektroder placeras på praktiskt taget alla antenn del av växten (och även på rötter, använda roots bladlöss). Därför kommer EPG-elektroderna underlätta mer omfattande studier i växtelektrofysiologi. Anothennes fördel av EPG-elektroder jämfört med konventionella elektroderna är att de förstnämnda tillåter förlängda inspelningstider, vilket gör det möjligt att undersöka svaren från enskilda bolag till olika stimuli. Detta är en viktig biofysikalisk funktionen och kan ge intressant information om hur bolag integrera information från olika stimuli från omgivningen. I själva verket, de som uppges här bevisar att bolag svarar på olika skadliga stimuli (Figur 4), vilket motiverar ytterligare forskning i denna viktiga biofysiska funktion i bolag.

Antalet elektrofysiologiska studier av bolag är för liten för att göra jämförelser mellan de uppgifter som erhållits med EPG-elektroderna och data som erhållits med traditionella glaselektroder. I själva verket, så vitt vi vet finns det inga uppgifter i litteraturen om stimulans-inducerade elektriska signaler i bolag i Arabidopsis, som förvärvats med en traditionell metod, vara glaselektroder eller glas stilett elektroder. Använda glaselektroder, Rhodos ochkollaboratörer ³ tyckte att värme inducerar aktionspotentialen liknande spikar i bolag av tomatplantor. Den snabba depolarisation som de visade hade en magnitud på ungefär 70 mV, som förekommer på toppen av en liten, långsammare depolarisation. Detta är i linje med våra elektriska signaler som förvärvats av EPG-elektroderna ^1, även om försiktighet bör iakttas när man jämför elektriska signaler från två olika växtarter, och induceras av olika typer av stimuli.

EPG elektroden är ett mångsidigt och elegant verktyg för att studera de elektrofysiologiska svar hos floem celler för olika typer av stimuli.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass connector pins	EPG Systems/hardw.shop		Φ 1.2 mm
Thin copper wire	EPG Systems/hardw.shop		approx. Φ 0.2 mm
Thin gold wire	EPG Systems		Φ 18 µm
Soldering fluid	hardware shop		matching the soldering wire
Resin-cored soldering wire	hardware shop
Styrofoam	any
Water-based silver glue	EPG Systems		recipe in: www.epgsystems.eu
Paper wipes	Kimberly-Clark	5511
Soldering bolt	any
Stereomicroscope	Hund Wetzlar		minimum magnification is 10X
Small scissors	Fine Science Tools	14088-10
Scalpel	Fine Science Tools	10050-00
Fine forceps	Fine Science Tools	11231-20
Vortex	A. Hartenstein	L46
Watercolor brushes	any		Number 1 or 2
Air suction device			see description in: www.epgsystems.eu
Insect pins	any		No. 1 or 2
Solid table
Faraday cage			Hand made
Computer	Fujitsu Siemens
Data acquisition software	EPG Systems		Stylet+d
Giga-4 (-8) Complete System	EPG Systems
includes the following:
Main control box with USB output		Di155/Di710	12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed)
EPG probes 4 (8)			50x DC pre-amplifier
Swivel clamps on rod
DC power adaptor			bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC
Plant electrodes and cables
Additional test and ground cables