Abstract
Elektrofysiologiske egenskaber af celler er ofte undersøgt in vitro, efter dissociering dem fra deres oprindelige miljøer. Men undersøgelsen af elektrisk transmission mellem fjerntliggende celler i en organisme kræver in vivo, artefakt-fri optagelser af celler indlejret i deres native miljø. Transmissionen af elektriske signaler fra såret til læderet områder i et anlæg har siden længe pikeret interesse botanikere. Den floem, den levende del af planten vaskulatur, som spredes i hele planten, er blevet postuleret som en vigtig væv i elektrisk transmission i planter. Manglen på egnede elektrofysiologiske metoder udgør en stor udfordring for studiet af de elektriske egenskaber af de Phloem celler in vivo. Her præsenterer vi en ny tilgang til intracellulær elektrofysiologi af sigteelementerne (SE), der bruger levende bladlus eller andre phloem-fodring hemipteran insekter, integreret i den elektriske penetration graph (EPG) kredsløb. Alsidighed, robusthed og nøjagtighed denne metode gjorde det muligt at registrere og studere i detaljer såret-inducerede elektriske signaler i SE-selskaber af centrale vener af modellen planten Arabidopsis thaliana 1. Her viser vi, at EPG-elektroder kan let gennemføres for intracellulære elektrofysiologiske optagelser af SE i marginale vener, samt at undersøge kapaciteten af SE til at reagere med elektriske signaler til flere eksterne stimuli. EPG tilgang anvendes på intracellulær elektrofysiologi af SE kan gennemføres til en bred vifte af plantearter, i en lang række af anlæg / insekt kombinationer, og for mange forskning sigter.
Introduction
Evnen til at producere lange afstande elektriske signaler er et fordelagtigt træk af flercellede organismer, der giver mulighed for effektive reaktioner på eksterne stimuli. Dette træk har udviklet sig uafhængigt i planter og dyr, og repræsenterer således et tilfælde af konvergent evolution. Eftersom elektriske signaler kobles med vigtige funktioner i dyr såsom neural transmission og muskelsammentrækning, den molekylære basis, overførselsmåden, og funktion af stimulus-fremkaldte elektriske signaler i dyr er genstand for intensiv forskning. I modsætning hertil har stimulus-induceret elektrisk signalering i planter fået lidt forskning opmærksomhed. Selvom planter har ingen nerver eller muskler, synes der at være nok beviser til at antage, at stimulus-induceret elektriske signaler i planter spiller en central rolle i deres svar på miljømæssige faktorer.
Den floem, den levende komponent af anlægget vaskulatur, er blevet postuleret som en stor subStrate til transmission af stimulus-induceret elektriske signaler fra stimulerede / beskadiget til ikke-stimulerede / ubeskadigede områder 2. De vigtigste celler i Phloem er sigteelementerne (SES), relativt simple, aflange celler. Enderne af SE er forbundet til andre selskaber, der danner en kontinuerlig, lav modstand, si rør, der er spredt i hele planten. Der er imidlertid meget få undersøgelser om de elektriske egenskaber af disse højt specialiserede celler. I disse tidligere undersøgelser, forskerne adgang SE med enten glas mikro-elektroder 3 eller med glas elektroder, der blev koblet til plante-indsatte stiletter af bladlus, efter stylectomy (skæring) 4.. Glasmikroelektroder er lavet af glas kapillærer, der er trukket i den ene ende med varme i en fin spids på mindre end 1 um i diameter, og derefter fyldt med en KCl-opløsning. En Ag / AgCl eller platin tråd, indsat i KCl-fyldte glas elektrode er derefter forbundet til forstærkeren input, og en referentelektrode indsættes i badet der omgiver cellen af interesse, der slutter kredsløbet. Denne opsætning registreres forskellen i potentiale mellem den ekstracellulære referent elektrode og den intracellulære måleelektrode, dvs. membranpotentialet af cellen 5. Med denne metode Umrath foretaget den første intracellulær optagelse fra en plantecelle, ved hjælp af alger Nitella 6,7. Nitella er et relativt simpelt organisme med store celler, og derfor modtagelige for intracellulære elektrofysiologi eksperimenter. I modsætning hertil indsættelse af intracellulære glaselektroder i de små celler af flercellede, tredimensionale landplanter er teknisk krævende, kræver et højt kvalificeret forsker, samt avancerede visualisering, mikromanipulering, og anti-vibration udstyr. Selvom glaselektroder er egnede til at optage fra overfladiske celler i planter, såsom root epidermale celler 8, intracellulær recordings fra celler dybt forankret i plantens væv, såsom SE, meget sandsynligt forårsage skade-inducerede reaktioner, forvirrende resultaterne. I 1989 Fromm og Eschrich rapporterede brug af en alternativ metode, kaldet "bladlus metoden ', hvor glaselektroder er koblet til bladlus stiletter efter stylectomy 4. Den bladlus metoden er minimalt invasiv, fordi fleksible stiletter ikke forårsager væv eller celler skade som glaselektroder gør. Bladlus stiletter er naturens store opfindelse af plantebeskyttelsesmidler penetration, og bladlus er betydeligt mere kvalificerede end mennesker med at finde selskaber. Desværre er denne bladlus metode er også meget krævende med hensyn til teknisk ekspertise og udstyr. Hertil kommer, at succes for hvert forsøg, der implementerer denne teknik er helt afhængig af bladlus er i fodring mode - med stiletten stabilt indsat i en SE, på tidspunktet for stylectomy. Tænker i retrospektiv, kan man se, at oddsene for succes denne teknik kunne have været improved ved til forsøgsopstillingen et instrument, der gør det muligt at identificere, om bladlus stiletten er i SE, når de anvender stylectomy.
I 1964 McLean og Kinsey beskrev et "elektronisk overvågningssystem« for studiet af adfærd bladlus fodring i realtid 9,10. I dette system blev bladlus og stiletten-trængte anlæg integreret i et elektrisk kredsløb. Senere, i 1978, Tjallingii udtænkt en modificeret version af det system, kaldet systemet 11,12 'Elektrisk Penetration Graph "(EPG). Hvorimod det originale elektroniske overvågningssystem var følsomme over for modstanden-stammer potentialer kun med EPG-system, den elektromotoriske kraft (emf) stammer potentialer, dvs genereres i anlægget eller i insektet kunne registreres i tillæg til potentialer, der følger af modstand (R) i insekt. Dette udgør en væsentlig forbedring, fordi både signal komponenter, emf og R,give biologisk relevante oplysninger om begivenheder i planter penetration af bladlus. Hvad gør EPG forforstærkeren følsom over for R-komponenterne er dens relativt lavt input modstand på 1 GQ, hvilket er tæt på gennemsnittet af planten / bladlus modstand. En lille offset spænding (figur 1, V) på ca. +100 mV påføres planten, som derefter er delt på tværs af plante- og insekt- på den ene side, og input modstand på den anden. De spændinger og deres ændringer måles ved et punkt (figur 1A, B) mellem insekt og input modstand. Derfor repræsenterer R-komponenter plante-bladlus modstand modulationer af offset spænding, mens emf-komponenter er en vis brøkdel af plante potentialer på stiletten tip og potentialer forårsaget i insekt. Planten potentialer - mest relevante her - er hovedsagelig membran potentialer plantecellerne punkterede af bladlus stiletter. De insekt potentialer synes at være overvejendestreaming potentialer forårsaget af flydende bevægelser inden for de to stiletten kanaler, dvs mad og spyt kanaler; uden indre nerve eller muskel potentialer registreres i EPG. I praksis stiletten tip fungerer som en elektrode tip,. Alle planteceller er negativt ladede inde i forhold til den positive ydersiden af cellen. Den elektriske strøm (dvs. bevægelsen af ladede ioner i vandig opløsning) strømmer fra indersiden til ydersiden og omvendt meget begrænset på grund af den høje modstand af cellemembranen. Normalt hvilende potentiale holdes konstant. Men når negative ioner bevæge sig ud eller positive ioner bevæge sig i gennem cellemembranen, er membranpotentialet reduceret, dvs., det depolariserer «. Depolarisering forekommer i tilfælde af celle excitation. Ioner derefter flytte ind eller ud når specifikke ionkanaler i membranen åbnes, eller når membranen er beskadiget, og ioner lække ind og ud. Alle celler har ionkanaler og pumper i than plasmamembranen, der bringer membranpotentialet til sin hvilestilling niveau ved at genskabe den oprindelige koncentration af forskellige ioner inde i cellen. Den hvilende potentiale og dets ændringer er emf komponenter, og derfor EPG teknik er egnet til at måle dem.
Figur 1. EPG-elektroder. EPG-elektrode er en levende bladlus integreret i Elektrisk Penetration graf (EPG) kredsløb, hvis stiletten indsættes i en sigte element (SE) i stabil fodring tilstand. Hvis stiletten-spiddet SE er i hvile (panel A), spændingen i kredsløbet, registreres af EPG, er stabil og på den hvilende potentielle niveau (felt C, Rest). Hvis SE er ophidset, dens membran depolariserer (panel B), som er visualiseret i EPG som en gradvis stigning i spænding (panel C, Depolarisering). Som den ioniske balance i SE vender tilbage til hvile, dvs., det repolarizes, spændingen registreres af EPG aftager gradvist til resten potentielle niveau (felt C, Repolarisering). I panel C, "A" og "B" henviser til de tilfælde, der er vist i panel A og B, hhv. V = Indstillelig offset spænding kilde. Ri = indgangsmodstand. Parallelt med 1 GQ ekstern modstand, forstærkeren har en indvendig (i operationsforstærkeren) høj 1,5 TΩ modstand (panel A og B, i gråt). Ved fjernbetjening af kontakten kan ændres EPG pre-amp fra normal til emf-mode, som gør det muligt at opnå meget præcise spændingsværdier. Klik her for at se en større version af dette tal.
I det næste afsnit, vi give læseren en grundlæggende protokol for at udføre EPG eksperimenter, der gælder for både insekt-fokuserede og plante-fokuserede undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bladlus Opdræt
Bemærk: Valget af plante- og bladlus arter EPG optagelser afhænger af forskningen mål. For undersøgelser af Arabidopsis thaliana, at bladlus Brevicoryne brassicae er passende.
- Rear B. brassicae bladlus i et drivhus på Brassica oleracea. Holde planterne anvendes til bladlus opdræt i bure, for at undgå kontaminering af andre planter. Hold bladlus-opdræt planter og eksperimentelle planter (i vores tilfælde B. oleracea og A. thaliana) i separate rum, for at undgå forurening af eksperimentelle planter med bladlus.
- Overfør bladlus til friske planter omkring hver 2. uge, før at forårsage betydelig skade plante, eller nå overbefolkning. Overfør 10-20 voksne bladlus til en frisk plante opdræt at indlede en ny koloni.
- Overvåg opdræt planter regelmæssigt for forurening med uønskede bladlus arter og anden insektvoks planteædere, bladlus snyltehvepse og fungJeg, der kan påvirke sundheden af bladlus koloni.
- Saml voksen, vingeløse bladlus op til en uge efter deres endelige molt for EPG optagelse.
- Efter forsøgene, returnere de eksperimentelle planter, der ikke blev anvendt til kammeret vækst, da de ofte har nogle afkom, der er blevet produceret under optagelsen, der uforvarende kan forurene andre planter.
2. Insect Ledningsføring for EPG Recording
- For at gøre insekt elektroder, få messing stik pins (negle, Ø 1,2 mm), tynd kobbertråd (Ø 0,2 mm), meget tynd guldtråd (Ø ca. 20 um), vandbaseret sølv lim, en simpel lille lodning bolt med lodning væske og harpiks-kernehus lodning wire, stereomikroskop med 10X forstørrelse, lille saks eller skalpel, to fine pincet og en Styrofoam ark eller boks. Bemærk: En vortex-blander kan være nyttigt. Bemærk: trin-for-trin-protokollen til at gøre elektroder er indikeret i figur 2.
- For bladlushåndtering og lim ansøgning, opnå: en lille og blød akvarel camelhair børste (størrelse 2 eller mindre) og insekt ben som dem der bruges til insekt samling, selv om en fin synål eller tandstikker kan arbejde så godt. Trin 4 viser, hvordan man starter EPG optagelse.
- Trin 1.
Bemærk: Trin 1 og 2 nedenfor viser, hvordan du forbereder insekt elektroder minus bladlus. Trin 3 viser, hvordan du tilslutter en bladlus til elektroden. Vakuum fiksering af bladlus anbefales under ledninger, men ikke altid nødvendigt for langsom bevægelige arter (f.eks B. brassicae).- Tænd for lodning bolt og smelte nogle lodning wire ved dens spids (figur 2A). Fugt lederen af messing stik pin med nogle lodning væske (figur 2B) og dyppe den i den smeltede lodning metal (figur 2C).
- Anvende en kappe af smeltet loddemetal metal på den ene ende af en 1-2 cm langt stykke af den tynde kobbertråd (figur2D). Derefter bringe stiften og kobbertråd sammen mod den varme bolt (Figur 2E) og flytte dem sammen væk for at afkøle og størkne (figur 2F).
- Trin 2.
- Ryst (eller vortex) hætteglasset med sølv lim til flere minutter, indtil en glat emulsion vist. Cut (saks eller skalpel) et par stykker af guld ledning (på ca. 1,5 cm i længde) på objektet plade af stereomikroskop (figur 2G).
- Tag en messing pin med loddet kobbertråd (lavet i afsnit 2.3) og dyp den frie ende af kobbertråd ind i den lille sølv lim reservoir, der vil have samlet på indersiden låget på hætteglasset efter åbning det (Figur 2H). Bemærk: Der er behov for kun en lille dråbe.
- Flyt lim-dyppet ende af kobbertråd til det stykke af guldtråd, mens du løfter den ene ende for at undgå udtværing af lim på stereomikroskopet objekt plade. Prøv at overlappe copper og guldtråd til et par mm (figur 2I), distribuere limen langs overlapningen af de to ledninger.
- Vent, indtil limen er tørret nok til at holde trådene samlet. Kontroller limen kontakt efter tørring og tilføje nogle friske lim med en lille nål eller andre stykke kobbertråd, hvis nogle dele af de forbundne ledninger viser lim-fri dele.
- Efter insekt elektrode er klar, skal det opbevares, for eksempel indsat i et stykke flamingo.
Bemærk: Længden af guldtråd vil bestemme bevægelsesfrihed af bladlus: hvis det er for kort (mindre end 5 mm), bladlus kan føle sig forpligtet og vil ikke opføre sig normalt; hvis den er for lang (> 2 cm), vil bladlus bevæge sig frit. Bladlus har tendens til at flytte til den adaxial side af blade, hvis de får lov til. Hvis guldtråd rører bladet, vil signalet være kortsluttet.
- Trin 3.
- Bladlus kan holdes på plads ved hjælp af lys sugning, ved anvendelse af et vakuum; i dette tilfælde, skal du installere than Sugeindretning under stereomikroskop. Placer sugeåbningen i midten af feltet.
- Grundigt ryste hætteglasset med sølv lim i flere minutter (eller vortex), indtil en glat emulsion dannes. Saml en bladlus med den lille børste.
- Tænd for sugeindretningen og monter bladlus på sugeåbningen (figur 2J), med bagsiden af maven vendte til eksperimentatoren. Med den fine pensel, fjerne alle voks fra maven (rigelige i kål bladlus).
- Åbn lim hætteglasset og våd en nål med en meget lille dråbe af sølv lim (figur 2K). Påfør dråbe af sølv lim på bagsiden af bladlus bagkrop (figur 2L-M). Lad denne dråbe helt tørre i flere minutter, rystes kraftigt, lim hætteglasset igen og tilføje en anden dråbe af sølv lim på toppen af den første. Bemærk: Mens sølv lim er en elektrisk leder, betyder det ikke forårsage betydeligebeskadigelse af insektets kutikula.
- Efter lukning af lim hætteglasset, indsætte den frie ende af guldtråd ind i den våde dråber og holde tråden stadig samtidig med at limen tørre helt (figur 2 N). Undgå udtværing lim på ben eller antenner og kassér en bladlus, hvis dette er sket.
- Sluk suge fiksering enhed og løft forsigtigt insekt (Figur 2O). Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en fin pensel til at hjælpe med ophævelsen af bladlus fra suge-enheden.
Bemærk: Ledningsføring B. brassicae kræver ikke et vakuum, da de kan tilsluttes på et stykke en præcision laboratorium væv, den ru overflade, der giver den bladlus med nok greb, så at det ikke vil blive ophævet efter anvendelse af et fald på våd lim til dens mave. Efter lim tørring man kan løfte bladlus fra vævet ved hjælp af en fin pensel. - Sæt messing pin med det kablede insekt ind i Styrofoam og om nødvendigt, fortsætteledningsføring alle andre insekter skal anvendes til EPG indspilningen.
Bemærk: Disse protokoller til ledninger bladlus fungerer godt for os. Brugeren kan finde hans / hendes egen fremgangsmåde til ledningsføring bladlus.
- Trin 4.
- Sæt planter i Faradays bur (Figur 2P) på et ikke-ledende support: Brug petriskåle eller en plade af glas eller plastik.
- Indsæt en plante elektrode i jorden for hver pot. Sæt messing pin af det kablede insekt i input-stikket på EPG forforstærker (figur 2Q). Bemærk: jorden elektroden ikke svarer til jordelektroden anvendes i andre elektrofysiologiske teknikker. Det har den offset spænding er nødvendig for at justere og kompensere for elektrode polarisering spændinger.
- På grænsefladen af købet software Stilet +, med fast frekvens prøve på 100 Hz, indtast et filnavn, angive optagelsestiden, og skrive tekst til at angive oplysninger om forsøget (behandling, anlæg / Inse ct arter, etc.) kommentar linie 2 og 3.
- Sænk insekter på et passende landingsområde af anlægget og starte indspilningen ved at klikke på knappen Start af købet software (Stilet +) interface.
Note 1: højst 8 kanaler kan bruges samtidigt i en EPG oprettet. En EPG-elektrode eller flere EPG-elektroder per plante kan anvendes.
Note 2: når fokus for undersøgelsen er bladlus adfærd, starte optagelsen, før anlægget adgang bladlusene at undgå manglende de første anlæg penetration aktiviteter. - Til undersøgelse af elektrofysiologiske responser af SE'er på stimuli, vente mindst 10 min efter bladlus har indgået phloem fase, for at sikre, at bladlus er i en vedvarende Phloem indtagelse fase, og at signalet basislinjen er stabil. Først da, begynder enhver plante stimulering eksperiment.
tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg "/>
Figur 2. Making EPG-elektroder med bladlus eller andre hemipteran insekter til elektrisk penetration graf (EPG) optagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Paneler AI, trin, der kræves for at forberede EPG-elektroder minus bladlus. Først smelte et stykke af lodning metal på spidsen af en lodning bolt (A). Derefter dyppe lederen af messing stift i en dråbe lodning væske (B), og kontakte den med den smeltede metal ved lodning bolt spids (C). Umiddelbart efter dette trin kontakte enden af en kobbertråd til spidsen af lodning bolt, for at lime det i hovedet på messing tap (EF). Med en skalpel eller et blad, skære et stykke af guldtråd (G). Dipden frie ende af kobbertråden (forbundet ved den anden ende til messing pin) på sølv lim (H), og hurtigt tiltræde guldtråd til det (I) før sølv tørrer op. Den guldtråd er en fremragende leder, og kan blive polariseret. I virkeligheden, i størstedelen af tilfældene polariseringen er for lille til at blive opdaget, og i så fald kan det blive kompenseret for med offset spænding (V).
Paneler JO, nødvendige skridt for at tilslutte en bladlus (eller anden hemipteran insekt) til elektroden. Først forsigtigt løfte en bladlus med en fin akvarel pensel og placere den på åbningen af vakuum suges enhed (J). Tænd vakuumpumpen og dækker luftventilen hullet med et stykke papir for at anvende sugning. Dyp spidsen af insekt stift i sølv lim (K), og sætte en lille dråbe lim på toppen af bladlus mave under et stereomikroskop (LM). Inden fornæste ~ 20 sek, før sølv lim dråbe på bladlus tørrer, indsætte enden af guldtråd af insekt elektrode ind i den våde dråbe sølv lim, og holde det på plads i 1-3 minutter, indtil sølv limen har fuldstændigt lufttørret (N). På dette tidspunkt, skal du deaktivere sug ved at fjerne det stykke papir, der dækker luftventil hul sugeindretningen og fjern forsigtigt bladlus, fra suge enhed: løfte bladlus efter ledninger ofte kræver noget hjælp af en fin pensel (O).
Panel P viser et overblik over hele EPG oprettet inde i Faradays bur, og Panel Q viser en oversigt over anlægget-bladlus kombination for EPG. Se afsnit 2 ovenfor for en mere detaljeret forklaring af denne proces.
Små bogstaver er etiketter, der henviser til de punkter, at man skal gøre EPG-elektroder: en: lodning bolt; b: smeltet lodning metal;c: lodning væske; d: messing stik pin (søm) e: kobbertråd; f: Ø 18μm guldtråd; g: sugeanordning h: bladlus; i: vandbaseret sølv lim j: Faraday buret k: plante elektrode; l: indgangsstik (BNC) i EPG forforstærker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en tidligere undersøgelse, vi implementeret EPG-elektrode teknik med henblik på at karakterisere de elektriske signaler, der produceres i SE-selskaber af midvein under larve attack 1. Den midvein er en foretrukken insertion site for konventionelle glaselektroder, samt til fremstilling af glas stiletten elektroder, fordi det er SE-tætte og relativt robust, dermed modtagelig for fikseringen nødvendige for gennemførelsen af disse teknikker. Her tog vi fordel af alsidigheden af EPG elektrode med henblik på at indsamle elektrofysiologiske oplysninger fra mere vanskeligt at få adgang selskaber, navnlig i de marginale årer af blade. Figur 3 viser en typisk EPG optagelse fra en SE i en marginal vene af A. thaliana plante, som indeholder et elektrisk signal induceret af distal sårdannelse. Til forskel fra SE-selskaber i større vener, SE i marginale vener reagerede på remote skade med en enkelt, langsom depolarisering bølge, der kan svare til denslow depolariseringsbølge i centrale selskaber. I gennemsnit dette eksternt induceret langsomme depolarisering i SE-selskaber af bladet margin havde en gennemsnitlig varighed på 61 ± 27 sek, og gennemsnitlig amplitude på 37 ± 2 mV (n = 3, gennemsnit ± SEM). Disse data, let opnåelige med EPG-elektroder, tyder på, at sår-inducerede elektriske signaler i læderet blade spreder fra den store vaskulære bundtet til phloem i mindre vener.
Her udnyttede også robusthed EPG elektroder, at undersøge, om et SE kan reagere på forskellige skadelige stimuli, leveret inden for et tidsinterval i størrelsesordenen minutter. Når to blade blev skåret med en saks på bladstilken-lamina junction, en EPG-elektrode anbringes i en intakt blad detekteret lignende svar fra den samme SE til disse sår (figur 4A). I et andet forsøg blev en larve anvendt som såring middel. Larven først skære en ikke-nabo blad, og så, efter et par minutter, det flyttet toa nabo blade og skære det så godt. Mens den første sår i ikke-nabo blad inducerede kun en langsom transient depolarisering, den anden såret i nabo blad inducerede den komplette elektriske signal, der indeholder en langsom og en hurtig depolarisering, konsekvent med tidligere eksperimenter 1. Disse data viser, at en sigte element kan registrere flere såring begivenheder påført til andre blade, leveret inden for minutter fra hinanden.
Figur 3. Intracellulære optagelser af sår-induceret elektriske signaler fra sigteelementer (SES) i marginale vener med EPG-elektroder. Elektrisk Penetration Graph (EPG) signal segment af phloem-fodring fase af bladlus Brevicoryne brassicae. EPG-indspillet bladlus fodring fra en SE beliggende i en marginal vene af bladet # 8 (Arabidopsis thaliana, Vildtype), vist i tegnefilmen til venstre. EPG signal viser en langsom depolarisering bølge i den marginale SE kort efter opskæring en proximal nabo blad (blad # 3). De rytmiske, små, nedadgående hurtige signalkomponenter repræsenterer streaming potentialer, der følger af rytmiske opstigning af sap langs maden kanalen af stiletten under indtagelse fase (bølgeform E2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Multiple elektriske reaktioner på sårede stimuli i sigteelementerne (SES) erhvervet med EPG-elektroder Den robusthed bladlus-plante (Brevicoryne brassicae - Arabidopsis thaliana). Interaktion og stabiliteten af SE-indsatte bladlus stiletter er vigtige egenskaber for EPG-electrodes der tillader erhvervelse af lange EPG optagelser (timer). Her tog vi fordel af disse egenskaber til at undersøge, om et SE kan reagere på to fjerntliggende såring stimuli. Panel A viser svarene fra en SE til to kunstige såring begivenheder (blad opskæring af saks) fortløbende påført to forskellige nabo blade. Der er et interval på ca. 17 min mellem de to stimuli. Panel B viser svarene fra en SE til to på hinanden følgende naturlige såring begivenheder. A 4 th instar caterpillar af kål sommerfugl (Pieris brassicae) blev anvendt i dette eksperiment. Larven først klippe en ikke-nabo blad (i forbindelse med EPG optaget blad), inducerer en langsom, forbigående depolarisering. Derefter ca 7 min senere, larven skære en anden nabo blad, hvilket udløste en dobbelt depolarisering signal (dvs. indeholder en langsom og en hurtig forbigående depolariseringer) i bladlus-indspillet SE. Pile viser tiden, hvor såreneblev påført. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for at gøre elektrisk Penetration Graph (EPG) optagelser. EPG teknik er veletableret, med 100-200 aktive brugere over hele verden, og det er blevet implementeret for mange undersøgelser om forskellige emner, for eksempel: a) modstand værtsplante for bladlus og andre stiletten-bærende insekter 13; b) anlæg virus og patogene transmissionsmekanismer 14; c) insekticid virkningsmekanisme, (ændringer toksicitet og adfærd) 15; d) EPG har endda været nyttigt at påvise, at bladlus kampe er fordelagtige til vinderen, da det øger dens fodring effektivitet 16.
At lære at wire insekter til EPG optagelse er ikke svært, men kræver tålmodighed og praktisk erfaring at mestre. Fra at elektroder til den endelige kablede insekt, er en periode på en eller to uger praksis anbefales. I løbet af denne tid, vil forskeren sætte sig / sig med håndtering af den valgteinsektarter og at fortsætte gennem alle trin med succes. Kritiske trin: lodning ordentligt, grundigt ryste sølv lim hætteglasset, før du tager en lim dråbe af den rigtige størrelse - hverken for lille eller for stor - at sikre en ordentlig elektrisk og mekanisk forbindelse, og placere guldtråd i sølv dråbe på insekt mave på en måde, der ikke vil begrænse insekt bevægelser. Undlade at udføre disse trin korrekt, vil resultere i dårlig elektrisk forbindelse, som vil resultere i data af dårlig eller uacceptabel kvalitet. Når man giver den kablede insekter adgang til anlægget, er det vigtigt at visuelt overvåge dem i den første halve time af optagelsen. I denne periode er bladlus bliver vant til den tråd, og kan gå væk fra den ønskede optagelse sted, eller aflevere anlægget. Derfor kan man brug for at re-positionere bladlusene i denne periode. I tilfælde af adfærdsmæssige mål, bør der ikke re-positionering ske efter den første timealf time for at forhindre store forskelle mellem gentagelser. Dårligt placeret eller droppet-off individer skal kasseres.
Ud over at give en protokol til EPG optagelse denne artikel sammenfatter funktionerne i EPG kredsløb, der er relevante for dens anvendelse som en metode i plante intracellulær elektrofysiologi (figur 1). De store træk af EPG-elektroder er, at de er særdeles cellespecifikke elektroder, der muliggør nøjagtige intracellulære optagelser fra SE. Efter den almindelige EPG forstærker, input modstand er relativt lav, 1 GQ (10 9 Ω). I praksis betyder det, at modstanden ændres under optagelse påvirker det målte potentiale. Dette er ikke et problem i konventionelle intracellulær elektrofysiologi med glas elektroder, der typisk bruger højere input modstand forstærkere. Man kan korrigere for ændringer i modstanden som følge af plasmamembranen og fra andre kilder ved hjælp Kalibration impulser, som i Salvador-Recatalà et al. 1. En anden mulighed er at øge regelmæssig EPG forforstærker input modstand, fra 1 GQ til 1,5 TΩ (1,5 x 10 12 Ω) eller endog til 1 PΩ (10 15 Ω, afhængigt af den pre-amp s opamp), som svarer til input modstand i regelmæssige forstærkere til intracellulær optagelse. EPG forstærker med højere input modstand omtales her som "emf-mode EPG" system. I denne forstærker, en omskifter deaktiverer normal-tilstand EPG forstærker (se figur 1). I emf-mode, EPG-elektrode metoden registrerer plantecellen potentialer så præcist som de regelmæssige forstærkere, der anvendes i intracellulær elektrofysiologi. Den eneste forstyrrelse tilbage i EPG i emf-mode opstår fra emf komponenter af bladlus i SE fodring, men disse er forholdsvis lav, og går ikke på kompromis nøjagtigheden af målingerne. Hvis forskeren ønsker at simultan registrereromsætning af bladlus miljømæssige stressfaktorer (for eksempel ændringer i spytafsondring og indtagelse) og informationen af potentialet SE membran, hvorefter den normale tilstand af EPG anbefales. I dette tilfælde anvender den kalibrerede puls giver acceptable omtrentlige værdier af membranpotentialet.
Manglen på egnede metoder til erhvervelse af elektriske svarene fra phloem kar in vivo er i øjeblikket begrænser typen og antallet af spørgsmål i forbindelse med miljømæssige stressreaktioner af planter. Forskere har implementeret glaselektroder 3 og glas-stiletten elektroder 4 for erhvervelse af intracellulære optagelser i SE-selskaber i midvein. I modsætning til disse to typer af elektroder, kan EPG-elektroder placeres på stort set alle aerial del af planten (og endda på rødder, bruge root bladlus). Derfor vil EPG-elektroder fremme en mere omfattende studier i planter elektrofysiologi. Anothendes fordel af EPG-elektroder i forhold til konventionelle elektroder er, at førstnævnte mulighed for udvidede optagelse perioder, hvilket gør muligt at undersøge svarene fra enkelte selskaber til forskellige stimuli. Dette er et vigtigt biofysisk træk, og kan give interessante oplysninger om, hvordan SE integrere information fra stimuli forskellige miljømæssige. Faktisk er opgivet her beviser, at SE-selskaber reagerer på forskellige skadelige stimuli (figur 4), hvilket begrunder yderligere forskning på dette vigtige biofysiske træk ved SE-selskaber.
Antallet af elektrofysiologiske undersøgelser af SE-selskaber er for lille til at foretage sammenligninger mellem de overtagne med EPG-elektroder og data opnået med traditionelle glaselektroder. Faktisk til vores viden er der ingen data i litteraturen om stimulus-induceret elektriske signaler i SE-selskaber af Arabidopsis, erhverves med en traditionel metode, være glaselektroder eller glas-stiletten elektroder. Brug af glaselektroder, Rhodos ogsamarbejdspartnere 3 fandt, at varme inducerer handling potentiale-lignende spidser i SE-selskaber af tomatplanter. Den hurtige depolarisering, at de viste havde en størrelsesorden på ca. 70 mV, forekommer på toppen af en lille, langsommere depolarisering. Dette er i overensstemmelse med vores elektriske signaler erhvervet af EPG-elektroder 1, selv om der skal sørges for, når man sammenligner elektriske signaler fra to forskellige plantearter, og fremkaldt af forskellige typer af stimuli.
EPG elektrode er en alsidig og elegant værktøj til at studere de elektrofysiologiske responser af Phloem celler til forskellige typer af stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
VSR blev støttet af en IIF Marie Curie Grant (viklet i EARTH, akronym for: Sår induceret elektriske signaler i Arabidopsis thaliana).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG Systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is 10X | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100 Hz (softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A.
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
