Introduction
Dal 1973 il modello di trapianto di rene nei topi è stato un valido strumento di ricerca, ma problemi tecnici hanno ostacolato la sua diffusione. Nel corso degli anni numerosi lavori sono stati pubblicati in dettaglio i miglioramenti / perfezionamenti a questa procedura. Come modello di principalmente vascolarizzato trapianto di organo solido questa procedura è probabilmente secondo solo al modello di trapianto di cuore eterotopico che è stato anche ideato dal laboratorio di Russell nel 1973 6. Entrambi i modelli si prestano alla ricerca sulle risposte di rigetto allogenico, lo sviluppo di ritardata funzionalità del trapianto e danno da ischemia riperfusione.
Uno dei problemi più comuni da segnalare con trapianto renale è relativamente alta incidenza di trombosi arteriosa 4,5,7 che abbiamo anche sperimentato nel nostro laboratorio. Pertanto abbiamo deciso di effettuare una revisione della letteratura di formazione di trombi e forse trovare la causa di questo problema tecnico e di elaborare anche unapossibile soluzione. La causa più probabile di trombosi è il percorso alquanto tortuosa sangue prende dall'aorta destinatario, nell'aorta renale donatore poi all'arteria renale donatore. Questo percorso provoca turbolenza nella arteria renale che può portare all'attivazione delle piastrine e formazione di trombi. Sulla base delle recenti osservazioni e una ricerca di letteratura 8-14 siamo arrivati a una nuova tecnica che ha ridotto la trombosi a 0%.
La tecnica qui descritta varia da tecniche precedentemente riportati nella formazione di un bracciale tallone e punta arteriosa che strutture migliorate flusso sanguigno e riduce notevolmente la formazione di trombi. Il polsino è formata dividendo dell'aorta infra-renale attraverso la faccia della ostio arterioso renale con un angolo inferiore a 45 ° rispetto all'asse longitudinale dell'aorta (Figura 1A e 1B). Ciò si traduce in un bracciale circa 2mm di lunghezza. Una patch Carrel venoso è formata da sezionare la rvena Enal nella IVC aumentando il diametro del bracciale. Il donatore addominale dell'aorta polsino tacco e punta infra-renale è end-to-side anastomizzata all'aorta addominale destinatario e la vena renale donatore / patch IVC è end-to-side anastomizzata al destinatario addominale vena cava inferiore (IVC) . L'uretere viene poi introdotto in ed ancorata alla vescica come descritto da Han et al 3.
Per questo studio i trapianti non trattati con soli tempi di ischemia calda (es., Senza di ischemia fredda) si confrontano. In questo caso ischemia calda si riferisce al tempo dalla cessazione del flusso di sangue attraverso il rene donatore (passo 1.11) e riperfusione del graft nel ricevente (passo 2.11 sotto). Ischemia fredda si riferisce al tempo che il rene non è perfuso e si mantiene in celle frigorifere fino all'inizio della procedura di impianto.
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Protocol
Tutti i topi sono stati acquistati da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), e sono stati alloggiati in condizioni di libero patogeni presso l'Università del Colorado Denver, Facility Barbara Davis Animal Center secondo Linee Guida NIH e con l'approvazione della University of Colorado Denver IACUC.
1. Trapianto renale Harvest
- Sterilizzare tutti gli strumenti, indossare guanti sterili durante tutta la procedura e mantenere un campo sterile. Eseguire tutti gli interventi chirurgici con l'uso di un microscopio operatorio.
- Rimuovere chirurgicamente reni topo donatore da (kg IP 60mg /) donatori pentobarbital-anestetizzati. Accertare profondità dell'anestesia da punta pizzico, e osservare la frequenza respiratoria.
- Agganciare la pelliccia quindi immobilizzare il mouse da vincoli a 4 vie. Preparare la pelle con iodio-povidone e drappeggio il mouse in modo sterile.
- Fare un 2 centimetri linea mediana verticale incisione addominale e entrare nella cavità addominale. Ritrarre l'intestino superiormente ed esternare laal petto. Mantenere l'intestino avvolto in una garza sterile umido durante tutta la procedura.
- Identificare i grossi vasi addominali e mobilitare, identificare eventuali rami lombari e sia cauterizzare o legare con 10/0 sutura in nylon.
- Immediatamente distale vasi renali sinistra stuzzicare la vena cava inferiore (IVC) e aorta addominale (AA) a parte per via smussa su circa 2mm. Legare con 10/0 nylon e dividere piccolo arterioso e rami venosi dai vasi renali.
- Ora separare la vena renale dalla arteria renale attentamente per via smussa di queste strutture. Questo consente la creazione accurata di una patch Carrel all'estremità prossimale della vena renale, che verrà utilizzata per formare una anastomosi end-to-side ai destinatari IVC.
- Identificare, legare e sezionare i vasi surrenali sinistra. Questo consente l'accesso all'aorta surrenale e una sutura di seta 6-0 è collocato intorno l'aorta in preparazione per legatura, ma non legato in questo momento. Mobilitare il rene, i vasi e dell'uretere dalla plancia circostante. Ruotare il rene a destra e legare / dividere i rami posteriori. Quindi tornare il rene di sinistra.
- Ora dirigere l'attenzione per l'uretere. Senza scomodare l'ilo renale liberare l'uretere dal circostante plancia facendo attenzione a preservare i vasi ureterali. Dividere l'uretere a livello del dotto deferente. Il rene è ora pronto per il recupero.
- Iniettare lentamente 300 unità di eparina nel distale IVC heparinizing così il donatore. Fissare la sutura di seta 6-0 disposte intorno al AA surrenale e profumato rene sinistro tramite l'aorta addominale distale con 0.8ml di soluzione di eparina salina (100 U / ml).
- Una volta che la perfusione ha cessato creare una patch Carrel venoso immediatamente per eliminare il riflusso nel rene. Ritrarre la vena renale verso il rene rivelando l'AA e dell'arteria renale sotto.
- Dividere l'aorta adiacente dell'arteria renale creando un tacco ee bracciale come mostrato in Figura 1. Rimuovere i reni, vasi e dell'uretere dal donatore.
- Rimuovere il rene direttamente a un destinatario pre-preparati (0 min tempo di ischemia fredda) o conservati a 4 ° C in una soluzione di scelta per un tempo predeterminato fino al momento dell'impianto. Eutanasia donatori di exsanguanation e dislocazione cervicale. Il tempo totale per il recupero del rene del donatore è di circa. 15-20 min.
2. Rene tecnica di impianto
- Anestetizzare il mouse destinatario con pentobarbital (60 mg / kg IP dose iniziale, 25 mg dose supplementare / kg IP se richiesto). Accertare profondità dell'anestesia da punta pizzico, e osservare la frequenza respiratoria. Clip della pelliccia quindi immobilizzare il mouse da vincoli a 4 vie e applicare pomata oftalmica per gli occhi. Preparare la pelle con iodio-povidone e drappeggio il mouse in modo sterile.
- Fare un 2 centimetri linea mediana verticale incisione addominale e entrare nella cavità addominale. Ritrarre l'intestinosuperiormente e externalize al petto. Mantenere l'intestino avvolto in una garza sterile umido durante tutta la procedura.
- A questo punto eseguire una nefrectomia destra. Legare l'arteria e la vena renale con 6-0 punti di sutura in seta. Accise distale rene per le suture. Legare l'uretere con 6-0 seta e poi dividere prossimale al rene.
- Isolare l'aorta addominale e vena cava inferiore (IVC) sotto i vasi renali. Mettere 4-0 legami di cotone attorno l'aorta e vena cava inferiore superiore poi inferiore al sito anastomosi. Identificare e legare eventuali vasi lombari all'interno del campo con 10-0 sutura in nylon.
- Annodare i legami di cotone, prima l'inferiore, seguito dal superiore. In questo modo viene mantenuta del sangue nell'aorta rendendo il aortotomy facile.
- Formare la aortotomy con un ago 30G per entrare nel lume dell'aorta. Estendere l'incisione con sottili forbici micro ad una lunghezza di circa 2 mm.
- Effettuare la fine anastomosi lato della cuffia aortico donatore tacco e punta al'aorta destinatario nel seguente modo. Inserire un 10-0 nylon soggiorno suture stitch nell'aorta donatore e all'angolo inferiore dell'incisione nell'aorta destinatario e cravatta.
- Posizionare un secondo 10-0 nylon opposto al primo nell'aorta donatore e l'angolo superiore dell'incisione in aorta addominale e cravatta. Fare una linea sutura continua da superiore a inferiore nella parete laterale dell'aorta e legare contro la permanenza punto precedentemente posizionato. Poi suturare la parete mediale in modo esecuzione e cravatta.
- Effettuare la fine anastomosi lato della vena renale donatore al ricevente IVC nel seguente modo. Forare il IVC con un ago 30G ed estendere l'incisione con sottili forbici micro. Legare la vena renale donatore verso l'angolo inferiore della incisione nel IVC con 10-0 di nylon. Fare una linea di sutura che corre tra la vena renale e l'IVC e cravatta.
NOTA: E 'di vitale importanza che tutto spessore passa l'ago di sutura tra cui il adventit vascolareia e l'intima sono raggiunti. Eversion dei bordi assicura anche che c'è intima-to-intima contatto, che aiuta nella chiusura e guarigione delle anastomosi. Mentre un agente di coagulazione emostatico può essere utile per ridurre le perdite, si raccomanda che un chirurgo invece contare su una buona tecnica. - Assicurarsi che le anastomosi sono "puliti". Vale a dire, che le pareti opposte, non sono catturati durante il posizionamento di punti. Questo provocherà un restringimento significativo di fluire che si tradurrà in un innesto fallito e, in casi estremi arto posteriore paralisi.
NOTA: Un altro fattore estremamente importante è garantire che la tensione delle linee di sutura anastomotica anche ottimale. Troppo lenta e non ci saranno perdite irreversibili, troppo stretto e stenosi di fluire si tradurrà. Se sul lato arterioso questo si tradurrà in scarsa perfusione dell'innesto, se sul lato venoso comporterà un rene congestionata. - Rilasciare il distale flusso venoso 4-0 cotone tie ristabilire. Una volta emostasi del venonoi anastomosi è stata osservata gradualmente allentare la prossimale pareggio 4-0 in cotone e osservare la anastomosi arteriosa per l'emostasi.
- Rimuovere le fascette di cotone dal mouse una volta entrambe le anastomosi sono considerati sicuri. Pierce vescica con un ago 20 G creando due fori.
- Far passare la punta delle pinze curve attraverso i fori e tirare l'uretere donatore attraverso la vescica con la pinza con l'estremità prossimale dell'uretere essere ancorato alla parete della vescica con due 10-0 suture in nylon. Tagliare la lunghezza in eccesso dell'uretere sporge dal secondo foro permettendo l'uretere ritragga all'interno della vescica e chiudere il foro con due 10-0 suture in nylon.
- Ritorna l'intestino all'addome. Chiudere la parete addominale in due strati con 5-0 sutura di seta in modo esecuzione.
- Somministrare un bolo 1,0 ml di soluzione sterile, caldo normale soluzione fisiologica nell'addome come rianimazione fluido alla chiusura, e iniettare 0,8 ml di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea nel post-operatorio. Nessun altro Supportigiocare cinque misure durante l'intervento sono obbligatori.
- Recuperare l'animale su una coperta di riscaldamento. Tempo totale dell'impianto è di circa. 35-45 min. Somministrare analgesici come buprenorfina, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml all'inizio della procedura e ogni 6-12 ore per 72 ore post-op.
3. controlaterale Nefrectomia
- A seconda dei requisiti di protocollo, diversi giorni dopo la procedura di impianto, eseguire una nefrectomia controlaterale sotto anestesia isoflurano (5% isoflurano inalato per induzione, 1,5-2,0% per la manutenzione).
- Inserire la cavità addominale e ritrarre delicatamente l'intestino al diritto degli animali. Esporre il rene sinistro e sezionare smussato dalla fascia circostanti.
- Legare l'arteria renale, vena e dell'uretere con 6-0 punti di sutura in seta e poi asportare il rene sopra le suture e rimuovere il rene. Tempo operatorio totale è di circa. 10 min.
4. Graft Assessment
- Misura siero Creatinove utilizzando il metodo del picrato alcalino (reazione Jaffe).
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Representative Results
Questa tecnica chirurgica consente sia per i semplici studi di sopravvivenza / rigetto dell'organo o protocolli sperimentali piuttosto complessi. Nelle figure di seguito dimostriamo i vantaggi di utilizzare questo miglioramento tecnica anastomosi arteriosa. Utilizzando questa tecnica abbiamo ridotto significativamente l'incidenza di trombosi arteriosa dal 35% allo 0%, aumentando così la produttività. Abbiamo usato questa tecnica per oltre un anno con lo stesso risultato trombosi 0% mantenuto. La Figura 1 descrive il metodo per la formazione della arteriosa bracciale tacco e punta che è alla base di questa nuova tecnica. Questo bracciale prevede una anastomosi più lungo e un percorso dritto del flusso sanguigno nel rene. Entrambi questi punti risultato in turbolenza significativamente diminuita riducendo la probabilità di attivazione piastrinica e la formazione di trombi.
Figura 2. L'analisi immunoistochimica. (A) acido periodico-Schiff sezione di un controllo non-tra macchiatorene nsplanted. (B) Un trapianto di rene singenico a POD 8 con la tecnica riveduta dimostra normali cellule tubulari prossimali, che sono cubico, con un citoplasma chiaro e un nucleo di luce rotondo al centro della cella. Ci sono prove di lieve lesione confine pennello (frecce), ma la maggior parte delle frontiere pennello sono regolari e ben conservato. Ingrandimento: 400x.
Tabella 1. Confronto di incidenza di trombosi e tempi di ischemia calda tra le due tecniche. Tutti i valori sono espressi come media ± SD. Per i singoli confronti, i dati normalmente distribuiti sono valutate utilizzando appaiati, due code test Student t, e dati non normalmente distribuiti sono analizzate con il test non parametrico spaiato Mann-Whitney U. Valori di p inferiori a 0,05 sono considerati statisticamente significant.
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Discussion
Padroneggiare questa tecnica di trapianto è difficile, ma una volta realizzato, è uno strumento di ricerca molto potente. Il paziente chirurgo / ricercatore sarà ricompensato dalla cura dei dettagli e la coerenza della tecnica, che è la chiave per padroneggiare qualsiasi procedura chirurgica, a maggior ragione nei piccoli modelli animali. Le difficoltà tecniche di padroneggiare il trapianto di rene di topo sono molte pieghe, ed è molto probabile che l'esperienza in altri modelli di piccole dimensioni trapianto animale deve essere acquisita prima di affrontare questa procedura.
È importante garantire che le anastomosi sono "puliti", cioè, le pareti vascolari avversaria non devono essere catturati durante il posizionamento di punti al fine di mantenere un lume pervio. Altrimenti ci sarà una significativa costrizione fluire che più probabilmente risultato in un innesto fallito e in casi estremi portare a paralisi degli arti posteriori. E 'anche estremamente importante che passa tutto spessore dell'ago di sutura tra cui l'avventizia vascolare e l'intima vengono raggiunti come questo si traduce in una corretta evertion dei bordi assicurando che vi sia un contatto intima-to-intima che aiuta nella tenuta e guarigione delle anastomosi. Mentre un agente di coagulazione emostatico può essere utile per ridurre le perdite, si raccomanda che un chirurgo invece affidamento su una buona tecnica.
Anche attenzione deve essere rivolta a garantire la tensione delle linee di sutura anastomotici è ottimale, troppo lenta e ci saranno perdite irreversibili, al flusso stretto e riduzione si tradurrà. Se sul lato arterioso questo si tradurrà in scarsa perfusione dell'innesto, se sul lato venoso comporterà un rene congestionata. Raggiungere questo tensione corretta è una questione di pratica e l'esperienza con altri piccoli modelli microvascolari animale sarà di grande aiuto. Soprattutto la consistenza della tecnica e l'attenzione costante ai dettagli produrrà eccellente mouse e la sopravvivenza del trapianto, e la funzione trapianto di rene.
t "> I limiti di questa tecnica sono disciplinati esclusivamente dagli usi che possono essere applicate dallo sperimentatore. Come con qualsiasi procedura microvascolare, fino a quando una buona tecnica è osservato i risultati dovrebbero essere riproducibili.L'incidenza di trombosi arteriosa utilizzando questa tecnica è stato drasticamente ridotto. Questo si traduce in almeno 1/3 di tutti i trapianti di rene in fase di conversione da parte di potenziali guasti tecnici di dati utili, con conseguente riduzione dei costi e aumento della produttività.
Come completamente vascolarizzato, modello trapianto ortotopico le applicazioni future includeranno rifiuto / studi sulla tolleranza, il fenomeno della ritardata funzionalità del trapianto e indagini sui meccanismi di danno da ischemia / riperfusione.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
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