Introduction
Desde 1973, o modelo de transplante renal em ratos tem sido um valioso instrumento de pesquisa, mas problemas técnicos têm dificultado seu uso generalizado. Ao longo dos anos, vários trabalhos têm sido publicados detalhando melhorias / aperfeiçoamentos a este procedimento. Como um modelo de transplante de órgãos sólidos, principalmente vascularizado este procedimento é, provavelmente, perdendo apenas para o modelo de transplante cardíaco heterotópico, que também foi concebido pelo laboratório Russell em 1973 6. Ambos os modelos se prestam à investigação sobre respostas de rejeição alogênicos, o desenvolvimento da função retardada do enxerto e lesão por isquemia-reperfusão.
Um dos problemas mais comuns que devem ser comunicadas com transplante renal é a relativamente alta incidência de trombose arterial 4,5,7 que também experiente em nosso laboratório. Por isso nos propusemos a realizar uma revisão da literatura sobre a formação de trombos e, possivelmente, encontrar a causa deste problema técnico e também para elaborar umsolução possível. A causa mais provável de trombose é o caminho tortuoso tanto o sangue toma da aorta do receptor, para a aorta do doador renal em seguida, para a artéria renal dador. Este caminho provoca turbulência na artéria renal, o que pode conduzir à activação de plaquetas e formação de trombos. Com base nas observações recentes e uma pesquisa da literatura relevante 14/08 que surgiu com uma nova técnica que reduziu trombose para 0%.
A técnica descrita aqui varia de técnicas previamente relatados na formação de um arterial punta-taco manguito que as instalações melhora a circulação sanguínea e reduz significativamente a formação de trombos. A braçadeira é formada pela divisão da aorta infra-renal através da face do óstio da artéria renal com um ângulo inferior a 45 ° em relação ao eixo longitudinal da aorta (Figura 1A e 1B). Isto resulta numa braçadeira aproximadamente 2 mm de comprimento. Um patch Carrel venosa é formado por transecting o renal veia para a VCI aumentando assim o diâmetro da braçadeira. A infra-renal de doadores abdominal aorta punta-taco manguito é de ponta a lado anastomosada à aorta abdominal destinatário ea veia renal doador / patch IVC é de ponta a lado anastomosado ao destinatário abdominal veia cava inferior (VCI) . O ureter é então introduzida e ancorada à bexiga tal como descrito por Han et al 3.
Para este estudo transplantes não tratados apenas com tempo de isquemia quente (ie., Sem isquemia fria) são comparados. Neste caso isquemia quente refere-se ao tempo da cessação do fluxo sangüíneo através do rim de doador (passo 1.11 abaixo) e reperfusão do enxerto no receptor (passo 2.11 abaixo). Isquemia fria refere-se ao tempo que o rim não perfundido é e é mantido em armazenamento a frio, até ao início do procedimento de implante.
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Protocol
Todos os ratinhos foram adquiridos da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade do Colorado Denver, Facility Barbara Davis Centro de animal de acordo com diretrizes do NIH e com a aprovação da University of Colorado Denver IACUC.
1. doador de rim Colheita
- Esterilizar todos os instrumentos, usar luvas estéreis durante todo o processo e manter um campo esterilizado. Executar todas as cirurgias com a utilização de um microscópio de operação.
- Remover cirurgicamente rins de doadores de rato anestesiado-pentobarbital (60mg / kg IP) doadores. Verificar profundidade da anestesia por toe-pitada, e observar a freqüência respiratória.
- Clipe da pele, em seguida, imobilizar o rato por apoios de 4-way. Prepare a pele com iodopovidona e armar o mouse de forma estéril.
- Adicione a 2 cm da linha média incisão abdominal vertical e entrar na cavidade abdominal. Retrair o intestino superiormente e exteriorizá-lopara o peito. Mantenha o intestino envolto em gaze estéril úmido durante todo o procedimento.
- Identificar os grandes vasos abdominais e mobilizá-los, identificar quaisquer ramos lombares e ou cauterizar ou ligá-los com 10/0 nylon de sutura.
- Imediatamente distal para os vasos renais esquerda provocar a veia cava inferior (IVC) e aorta abdominal (AA) por dissecção romba para além ao longo de aproximadamente 2 mm. Ligadura com 10/0 nylon e dividir pequena arterial e ramos venosos dos vasos renais.
- Agora separar a veia renal a partir da artéria renal cuidadosamente por dissecção romba destas estruturas. Isto permite a criação de um emplastro precisas Carrel na extremidade proximal da veia renal, que vai ser utilizado para formar uma anastomose extremidade-a-lado para os destinatários IVC.
- Identificar, ligadura e dividir os vasos adrenal esquerda. Isto permite que o acesso à aorta supra-renal e uma sutura de seda 6-0 é colocado em torno da aorta em preparação para a ligação, mas não amarrado neste momento. Mobilizar o rim, ureter e vasos do tablier envolvente. Gire o rim para a direita e ligar / dividir quaisquer ramos posteriores. Em seguida, a rim de regresso para a esquerda.
- Agora dirija a atenção para o ureter. Sem perturbar o hilo renal libertar o ureter a partir da envolvente tablier tendo o cuidado de preservar os vasos ureterais. Divida o ureter no nível do canal deferente. O rim está agora pronto para recuperar.
- Lentamente injetar 300 unidades de heparina para a VCI distal heparinizar assim o doador. Atar o fio de sutura de seda 6-0 colocado em torno do AA supra-renal e perfundir o rim esquerdo via a aorta abdominal distai com 0,8 ml de solução salina de heparina (100 U / mL).
- Uma vez que a perfusão cessou criar um remendo Carrel venosa imediatamente para eliminar o refluxo para o rim. Retrair a veia renal em direção ao rim revelando a AA ea artéria renal abaixo.
- Dividir a aorta adjacente à artéria renal, criando um calcanhar ee braçadeira como mostrado na Figura 1. Remover o rim e ureter, vasos do dador.
- Remover o rim directamente a um receptor pré-preparado (0 min de tempo de isquemia fria) ou armazenado a 4 ° C numa solução de escolha para um tempo pré-determinado, até que o tempo de implantação. Eutanasiados os doadores por exsanguanation e deslocamento cervical. O tempo total para recuperar doador de rim é de aprox. 15-20 min.
2. Rim Técnica de Implante
- Anestesiar o mouse destinatário com pentobarbital (60 mg / kg dose inicial IP, 25mg / kg IP dose suplementar se necessário). Verificar profundidade da anestesia por toe-pitada, e observar a freqüência respiratória. Clipe da pele, em seguida, imobilizar o rato por apoios de 4 vias e aplicar pomada oftálmica para os olhos. Prepare a pele com iodopovidona e armar o mouse de forma estéril.
- Adicione a 2 cm da linha média incisão abdominal vertical e entrar na cavidade abdominal. Retrair o intestinosuperiormente e exteriorizar para o peito. Mantenha o intestino envolto em gaze estéril úmido durante todo o procedimento.
- Neste momento realizar uma nefrectomia direita. Ligar a artéria e veia renal com 6-0 seda. Extirpar o rim distal para as suturas. Ligadura do ureter com seda 6-0 e depois dividir proximal do rim.
- Isolar a aorta abdominal e veia cava inferior (IVC) abaixo dos vasos renais. Coloque 4-0 laços de algodão em torno da aorta e, em seguida, IVC superiores inferior ao local da anastomose. Identificar e ligar quaisquer vasos lombares dentro do campo com nylon 10-0 sutura.
- Atar os laços de algodão, o primeiro inferior seguido pelo superior. Deste modo algum sangue é retida na aorta fazendo o aortotomy mais fácil.
- Formar o aortotomy com uma agulha de 30G para introduzir o lúmen da aorta. Estender a incisão com tesoura micro finas para um comprimento de cerca de 2 mm.
- Faça um fim a anastomose lado do manguito doador aórtica punta-taco paraa aorta do receptor da seguinte maneira. Coloque um nylon 10-0 sutura estadia ponto na aorta do doador e ao ângulo inferior da incisão na aorta destinatário e gravata.
- Coloque um segundo nylon 10-0 frente ao primeiro lugar na aorta do doador e do canto superior da incisão na aorta abdominal e gravata. Faça uma linha de sutura contínua de superior para inferior na parede lateral da aorta e empate contra o ponto estadia previamente colocado. Em seguida, sutura da parede medial de uma forma correndo e gravata.
- Faça um fim-anastomose da veia renal dador até ao receptor IVC da seguinte forma. Perfurar o IVC com uma agulha de 30G e estender a incisão com tesoura micro finas. Amarre a veia renal de doadores para o canto inferior da incisão na VCI com nylon 10-0. Faça uma linha de sutura contínua entre a veia renal e da VCI e gravata.
NOTA: É também de vital importância que a espessura total passa da agulha de sutura incluindo o adventit vascularIA e da íntima são alcançados. Eversão das bordas também assegura que não há contacto íntima-a-íntima, que ajuda na cura e selagem das anastomoses. Enquanto um agente de coagulação hemostática pode ser útil para reduzir vazamentos, recomendamos que um cirurgião sim contar com boa técnica. - Certifique-se de que as anastomoses são "limpos". Isto é, que as paredes opostas não são capturados ao colocar pontos. Isto fará com que uma constrição significativa ao fluxo que irá resultar numa falha do enxerto e em casos extremos, à paralisia dos membros posteriores.
NOTA: Outro factor extremamente importante é assegurar que a tensão das linhas de sutura anastomóticos também é óptima. Muito solto e haverá vazamento irreversível, muito apertado e estenose ao fluxo resultará. Se no lado arterial isto irá resultar em má perfusão do enxerto, se no lado venoso de um rim congestionado vai resultar. - Solte o fluxo venoso 4-0 tie algodão restabelece distal. Uma vez que a hemostasia do venonos anastomose tem sido observado gradualmente afrouxar o laço de algodão 4-0 proximal e observar a anastomose arterial para hemostasia.
- Retire os laços de algodão do mouse uma vez ambas as anastomoses são consideradas seguras. Pierce da bexiga com uma agulha de 20 G a criação de dois furos.
- Passar as pontas das pinças curvas através dos orifícios e puxar o ureter dador através da bexiga com a pinça com a extremidade proximal do ureter sendo ancorada à parede da bexiga com duas suturas de nylon 10-0. Aparar o excesso de comprimento do ureter saliente a partir do segundo furo permitindo do uréter se retraia dentro da bexiga e fechar o buraco com duas suturas de nylon 10-0.
- Retorno do intestino para o abdômen. Feche a parede abdominal em duas camadas usando 5-0 sutura de seda de forma a funcionar.
- Administrar um bolus de 1,0 ml de solução salina esterilizada quente no abdômen como a reanimação com líquidos em cima do fecho, e injectar 0,8 ml de solução salina normal subcutaneamente no pós-operatório. Nenhum outro supportisão necessárias medidas ve durante a cirurgia.
- Recuperar o animal em uma manta térmica. Tempo de implante total é de aprox. 35-45 min. Administrar analgésicos, tais como a buprenorfina, de 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml no início do procedimento e cada 6-12 horas, durante 72 h pós-op.
3. A nefrectomia contralateral
- Dependendo dos requisitos do protocolo, vários dias após o procedimento de implante, uma nefrectomia contralateral executar sob anestesia com isoflurano (5% de isoflurano inalado por indução, 1,5-2,0% para manutenção).
- Digite a cavidade abdominal e retrair delicadamente o intestino para a direita do animal. Expor o rim esquerdo e dissecar romba da fáscia circundantes.
- Ligar a artéria renal, veia e do ureter com 6-0 suturas de seda e, em seguida, o rim acima excisar as suturas e remover o rim. Tempo total do procedimento é de aprox. 10 min.
4. Avaliação do Enxerto
- Medida creati soronove utilizando o método do picrato alcalino (Jaffe reacção).
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Representative Results
Esta técnica cirúrgica permite tanto para estudos simples sobrevivência de enxerto / rejeição, ou protocolos experimentais bastante complexas. Nas figuras abaixo demonstramos as vantagens de usar esse melhor técnica de anastomose arterial. Usando esta técnica, reduzimos significativamente a incidência de trombose arterial de 35% para 0%, aumentando assim a produtividade. Temos utilizado esta técnica para mais de um ano com o mesmo resultado de 0% a trombose mantida. A Figura 1 descreve o método para a formação do arterial punta-taco manguito que é a base desta nova técnica. Esta braçadeira proporciona um mais anastomose e um caminho de fluxo sanguíneo para o rim reto. Ambos estes pontos resultar em turbulência diminuiu significativamente reduzindo assim a probabilidade de activação de plaquetas e formação de trombos.
Figura 2. A análise imunohistoquímica. (A), ácido periódico de Schiff secção de um controlo não manchado trarim nsplanted. (B) Um transplante renal no POD 8 singeneicos utilizando a técnica Revised demonstra células tubulares proximais normais, que são cubóide, com um citoplasma claro e um núcleo redondo luz no meio da célula. Há evidência de lesão ligeira borda em escova (setas), mas a maioria das fronteiras escova são regulares e bem preservado. Ampliação: 400x.
Tabela 1. Comparação da incidência de trombose e isquemia quente vezes entre as duas técnicas. Todos os valores são expressos como média ± DP. Para comparações individuais, dados distribuídos normalmente, são avaliados utilizando testes t de Student não pareado bicaudal, e os dados não normalmente distribuídos são analisados pelo teste não pareado não paramétrico de Mann-Whitney. Os valores de p inferiores a 0,05 são considerados estatisticamente significant.
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Discussion
Dominar esta técnica de transplante é difícil, mas uma vez conseguido isso é uma ferramenta de pesquisa muito poderoso. O cirurgião paciente / pesquisador será recompensado pela atenção aos detalhes e consistência da técnica, que é a chave para dominar qualquer procedimento cirúrgico, ainda mais em pequenos modelos animais. As dificuldades técnicas de dominar o transplante de rim do rato são muitas dobras, e é altamente provável que a experiência em outros modelos pequenos transplante animal deve ser adquirida antes de abordar este procedimento.
É importante assegurar que as anastomoses são "limpo", isto é, as paredes vasculares opostas não deve ser travado ao colocar os pontos, a fim de manter um lúmen de patentes. Caso contrário, haverá constrição significativa a fluir que vai mais que provável resultado em um enxerto falhou e, em casos extremos levar a posteriores-membro paralisia. É também de vital importância que a espessura total passa da agulha de sutura incluindo a adventícia da íntima vascular e são alcançados como isto resulta na eversão adequada das arestas, garantindo que não há contacto íntima-a-íntima, que ajuda na cura e selagem das anastomoses. Enquanto um agente de coagulação hemostática pode ser útil para reduzir vazamentos, recomendamos que um cirurgião em vez contar com boa técnica.
Também deve ser dada atenção a garantir a tensão das linhas de sutura da anastomose é ótimo, muito solto e haverá vazamento irreversível, ao fluxo apertado e reduziu irá resultar. Se no lado arterial isto irá resultar em má perfusão do enxerto, se no lado venoso de um rim congestionado vai resultar. Atingir essa tensão correta é uma questão de prática e experiência com outros modelos de pequenos animais microvasculares vai ser de grande ajuda. Acima de tudo consistência da técnica e inabalável atenção ao detalhe vai render excelente mouse e sobrevida do enxerto, e função do transplante renal.
t "> As limitações desta técnica são reguladas apenas com base nas utilizações que podem ser aplicados pelo investigador. Tal como acontece com qualquer processo microvascular, enquanto boa técnica é observado os resultados devem ser reprodutíveis.A incidência de trombose arterial usando esta técnica tem sido drasticamente reduzida. Isso resulta em pelo menos 1/3 de todos os transplantes de rim a ser convertido de potenciais falhas técnicas aos dados utilizáveis, resultando em redução de custos e aumento da produtividade.
Como um modelo de transplante totalmente vascularizado, orthotopic as futuras aplicações incluirão rejeição / estudos de tolerância, o fenômeno da função tardia do enxerto e investigações sobre os mecanismos de lesão de isquemia / reperfusão.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
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