Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Published: August 17, 2015 doi: 10.3791/52959
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Introduction

تجارب البروتين التي تستخدم الطيف الكتلي (MS) يمكن أن تكون مصممة لاستخدام إما غير المستهدفة (بندقية) أو الأساليب المستهدفة. البروتينات اكتشاف يعتمد عموما على بندقية من أسفل إلى أعلى MS، إما باستخدام طريقة الاستحواذ التي تعتمد على البيانات التقليدية، أو باستخدام واحدة من التقنيات بيانات مستقلة وضعت مؤخرا (على سبيل المثال، MS E، رقعة) 1،2. البروتينات البندقية هي أداة قوية لتحديد الببتيد الإنتاجية العالية وتقدير نسبي، ولكنه غير مناسب عموما لتقدير المطلق أو لاستهداف، ومجموعات صغيرة محددة (~ عشرات) من البروتينات. يتم تحديد طريقة MS غالبا ما تستخدم لالبروتينات المستهدفة رد فعل الرصد (SRM) لما له من حساسية عالية، وسرعة، ومجموعة ديناميكية 3-5. وتشمل بدائل لSRM رصد رد فعل مواز، الذي يستفيد من ذات الدقة العالية، والكامل MS مسح 6.

SRM عادة ما يتم إجراء باستخدام rever النانو تدفقالمرحلة سد عالية الأداء اللوني السائل (نانو-RP-LC) أداة بالإضافة إلى تأين electrospray نانو (النانو ESI) مصدر أيون تعلق على الثلاثي رباعية مطياف الكتلة (QQQ-MS). في تجربة نموذجية، يتم هضم البروتينات proteolytically العينة، ويتم فصل الببتيدات الناتجة chromatographically، المستوعبة، والمتأينة. ينتج عن ذلك من أيونات السلائف هي م / ض تصفيتها من قبل رباعي الأول (Q1) ومجزأة في رباعي الثاني (Q2) عن طريق الاصطدام بها مع الغاز الاصطدام. الأيونات جزء الناتجة م / في رباعي الثالث (Q3) وكميا من قبل dynode التي تمت تصفيتها ض. ويشار إلى كل زوج السلائف وتفتيت أيون لكمرحلة انتقالية، ويتم رصد كل انتقال لفترة زمنية محددة (زمن السكون، عادة 2-50 مللي ثانية). خلال LC-SRM، دورات QQQ-MS من خلال قائمة محددة مسبقا من التحولات (دورة العمل هو عادة ≤3 ثانية)، وأنتجت اللوني من كل انتقال.

الاستراتيجيه البديلةالمنشأ للبروتين الكمي وعادة ما تستخدم المناعية مثل نقطة البقع، البقع الغربية، ELISAs، ميكروأرس الأضداد، عكس المرحلة ميكروأرس البروتين، والمناعية ميكروفلويديك، ELISAs الرقمية، والمناعية على أساس microsphere 7. يمكن للأفضل المناعية يكون بشكل ملحوظ أكثر حساسية من LC-SRM، وعينة مرت من المناعية يمكن أن يكون أعلى بكثير من LC-SRM 5. ومع ذلك، يمكن أن تكون مكلفة المناعية تطوير و / أو مضيعة للوقت، ويمكن للفحوصات الناتجة تكون عرضة لعبر التفاعل و / أو تدخل، تتعارض مع خلية / تحلل الأنسجة / طرق التجانس، و / أو غير قابلة للمضاعفة 5،8. بعض من هذه القضايا يمكن معالجتها من خلال اقتران تقنيات الأضداد ومقرها MS. على سبيل المثال، والبروتينات المستهدفة يمكن إثراء باستخدام مناعي قبل التحلل البروتيني وLC-SRM 12/09. بدلا من ذلك، تقنية SISCAPA توظف مناعي لاحقا إلى التحلل البروتيني في LEVE الببتيدل 13،14. بالإضافة إلى immunoenrichment استراتيجيات، يمكن استخدامها immunodepletion من البروتينات وفرة عالية لزيادة حساسية LC-SRM عن طريق الحد من تدخل coeluting التحاليل 15،16.

ويمكن تقسيم يستند إلى MS-البروتين الكمي في الكمي النسبي والمطلق، وأيضا في وضع العلامات النظائر مستقرة وخالية من التسمية (على سبيل المثال، ووضع العلامات الأيضية، ووضع العلامات الكيميائية، والبروتين الثقيل وصفت والببتيد المعايير الداخلية). يمكن أن تقنيات خالية من التسمية أن تكون مفيدة للالنسبي البروتين الكمي، ولكن من غير مناسب لتقدير المطلق دقيقة. وعلى سبيل المقارنة، خفضت تقنيات الوسم الخطأ المرتبط إعداد العينات وMS التباين، وغالبا ما تستخدم للبروتين النسبي الكمي 17. على سبيل المثال، أعدت مستقر النظائر المسمى بروتيوم (SILAP) المعايير باستخدام خط الخلية البشرية مثقف تمكين الكمي النسبي من المؤشرات الحيوية المحتملة عن طريق LC-SRM من المصل البشري 18. دقيقة الكمي البروتين المطلق MS يتطلب أن النقى كميا، البروتين المسمى isotopically أو الببتيد المعايير الداخلية أن ارتفعت-في العينات البيولوجية قبل MS. إدراج النظائر الثقيلة المعايير الداخلية وصفت في سير عمل LC-SRM تمكن الكمي المطلق الذي ثبت أن تكون استنساخه للغاية وقابلة للتحويل بين المختبرات 16،19.

وتشمل النظائر المستقرة المعايير الداخلية وصفت لتقدير البروتين المطلق MS أعدت معايير الببتيد باستخدام التوليف الصلبة مرحلة 20 والبروتينات تتكون من متسلسلة معايير الببتيد البروتيني شطورة 21، والمعايير بروتين كامل طول 22. هدف التعديل البروتين التساهمية وإعداد نموذج غير مكتمل (أي غير مكتمل عينة تحلل والتجانس، وناقصة البروتين الإذابة، تمسخ، الألكلة، والتحلل البروتيني) يمكن أن تقوض التقدير الدقيق. ص الداخليهي المعايير rotein الأقل احتمالا أن تتأثر معظم هذه المشاكل المحتملة، ولكنها عادة ما تكون الأكثر صعوبة للاستعداد. بديل هو تحليل كل بروتين الهدف باستخدام معايير متعددة الببتيد الداخلية التي صممت لتشمل مواطني المرافقة بقايا جذر الأمينو وكربوكسي المحطة. بغض النظر عن التي يعمل نوع من معيار الداخلية، ينبغي أن ارتفعت-في العينات البيولوجية في أبكر وقت خلال إعداد عينة وقت ممكن. أيضا، يجب اختبار تقنيات إعداد عينة متعددة (على سبيل المثال، وظروف تمسخ مختلفة). استخدام أساليب فنية تجريبية متعامدة متعددة (تجريبي عبر التحقق من صحة) هو استراتيجية قابلة للتطبيق للتغلب على معظم الكمي المحتمل التحديات 23-25.

LC-SRM الكمي من البروتينات هي تقنية مرنة للغاية والتي تم استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات. والجدير بالذكر، وقد تم استخدامه لدراسة الببتيد وبروتين المؤشرات الحيوية داخلالعينات السريرية مثل مصل، الخزعات الأساسية، وشفاطات إبرة دقيقة 5. كما تم استخدام LC-SRM لقياس رياضيات الكيمياء من المجمعات بروتين 5،26، للكشف عن أعصاب البوتولينوم 27، لتحديد ديناميات البروتين الفسفرة ضمن مسارات إشارات 5، وتحديد التغيرات في التشكل البروتين 28.

مختبرنا يستخدم LC-SRM لتحديد البروتينات مما يشير إلى أن توسط الكيميائي البلاعم لدعم تطوير المحاكاة المسار الكيميائي. الخطة الشاملة للبروتوكول (الشكل 1) يبدأ مع مرتبة الببتيدات المستهدفة مؤقتة. وفي وقت لاحق، وقد تم تجميع معايير الببتيد الخارجية الخام واستخدامها لتطوير المقايسات LC-SRM للتحاليل نوعية العينات البيولوجية. إذا تم اكتشاف البيولوجي المستمدة من عينة الببتيد الهدف، تم إعداد معايير الببتيد الداخلية الثقيلة المسمى النقاء لالكمي LC-SRM. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لميلانcurately تحديد البروتينات من مجموعة واسعة من العينات البيولوجية، ودعم التحقيقات في طائفة واسعة من الأهداف البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم عرض هذه الطريقة الموصوفة سابقا 56.

1. الببتيد الهدف اختيار

  1. تجميع قائمة من البروتينات المستهدفة، وتشمل عددا صغيرا من البروتينات التدبير المنزلي للتطبيع عبر العينات البيولوجية، وتشمل أيضا مستوى بروتين الداخلي (على سبيل المثال، يراعة luciferase المراسل). هضم البروتينات المستهدفة في الببتيدات زيتية في سيليكون باستخدام أداة برمجية مثل بروتين الهضم محاكي 29،30.
  2. تتطلب أن الببتيدات هي زيتية تماما ولا تحتوي على مواقع التربسين انشقاق في عداد المفقودين. تجنب الببتيدات مع مواقع انشقاق التربسين المجاورة لتجنب يحتمل أن تكون غير مكتملة التربسين الهضم 31.
  3. يشترط أن يكون طول كل الببتيد هو 5-20 مخلفات. نظر الببتيدات أطول، ولكن لاحظ أن أنها عادة ما تكون أكثر تكلفة لتجميع.
  4. تجنب الببتيد إذا كان يتوافق مع المتغير الجيني الطبيعي (على سبيل المثال، على nucleotid احدالبريد تعدد الأشكال). تؤكد أيضا أن المواقع التربسين تتأثر (الخطوة 1.2).
  5. تجنب الببتيد إذا كان يتوافق مع موقع تعديل posttranslational (PTM). وبالمثل، وتجنب الببتيد إذا كان سيكون عرضة للتعديل الكيميائي أثناء إعداد نموذج LC-MS. على وجه التحديد، وتجنب الببتيدات عرضة للالسيستين والميثيونين الأكسدة، والأسباراجين الجلوتامين نزع الأميد، وتشكيل الجلوتامين الأميني من محطة بيروغلوتامات. تأكد من أن المواقع التربسين تتأثر (الخطوة 1.2).
    1. وعلاوة على ذلك، وتجنب الببتيدات التي تنشأ من جذر الأمينو البروتين وكربوكسي-تيرميني لتيرميني البروتين عرضة للتعديل posttranslational (الأميني ميثيونين محطة خسارة وأستلة، وكربوكسي محطة amidation).
  6. تتطلب كل الببتيد المستهدفة هي فريدة من نوعها لكل بروتين الهدف. إذا لم يكن ذلك ممكنا، تتطلب أن الببتيد هي فريدة من نوعها لمجموعة من إيسفورمس / المتماثلات. علاج الببتيدات تختلف فقط بواسطة يسين / استبدال يسوليوكينيكما لو كانت متطابقة عند تحديد الببتيد تفرد لأن هذه تؤدي تقريبا مماثل خلال LC-SRM.
    1. إذا كان قد تم إجراء تحليل transcriptomic شامل لجميع العينات البيولوجية (على سبيل المثال، RNA وما يليها)، وتحديد الببتيد تفرد استخدام في ترجمة سيليكون من النص تسلسل 32 بدلا من استخدام بروتيوم كامل من الأنواع.
  7. تتطلب أن الببتيدات المستهدفة هي proteotypic. تحديد الببتيدات proteotypic باستخدام بندقية مطياف الكتلة 1،2 من العينات البيولوجية التي تجري دراستها. بدلا من ذلك، استرداد التعرف الببتيد من الببتيدات proteotypic من قواعد البيانات على الانترنت البروتينات مثل مطياف الكتلة NIST المكتبات 33 (http://peptide.nist.gov/)، آلة بروتيوم العالمي 34 (X HUNTER المكتبات الطيفية من http: // شبكة الاتصالات العالمية .thegpm.org / HUNTER / index.html و، وGPMDB التعرف الببتيد من http://gpmdb.thegpm.org/)، PeptideAtlas 35 36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. إذا التحليلات الكمية على مستوى النص من العينات البيولوجية وقد تم تنفيذ (على سبيل المثال، RNA وما يليها، QPCR)، ثم تجنب استهداف الببتيدات التي تتوافق مع النصوص وفرة منخفضة نسبيا.
  9. إذا لزم الأمر، حدد الببتيدات المستهدفة التي يمكن أن تستخدم لفحوصات LC-SRM الهدف orthologs البروتين (على سبيل المثال، لفحص كل من الأشكال الماوس من البروتين المستهدف البشرية و).
  10. حدد اثنين على الأقل من الببتيدات المستهدفة في البروتين المستهدف (إن أمكن).

2. إعداد معايير الببتيد

ملاحظة: هذا القسم من بروتوكول يصف إعداد مجموعة من عشرين معايير الببتيد مجفف بالتجميد (كل يجري نانومول 1 في الكمية) للتحليلات المصب. لعدد مختلف من الببتيدات، أو لكميات الببتيد مختلفة، فإنه سيكون في حاجة إلى تعديل وفقا لذلك.

    20،37.
    1. تأكد من أن بقايا السيستين المعايير الببتيد الخارجية وcarbamidomethylated (التركيب الكيميائي التي شكلتها الألكلة iodoacetamide). في المقابل، تأكد من أن بقايا السيستين المعايير الببتيد الداخلية هي معدلة (هذه ستكون الألكيلية خلال إعداد العينات، هو موضح أدناه).
    2. تصميم معايير الببتيد الداخلية بحيث أنها تحتوي على مواطن جذر الأمينو وكربوكسي محطة المرافقة المخلفات (للسيطرة على كفاءة التربسين الهضم؛ كل هو عادة 3-6 بقايا طويلة).
    3. تصميم معايير الببتيد الداخلية بحيث تكون النظائر مستقرة المسمى. النظر في الملف الشخصي النظائر الطبيعية من الببتيد الهدف ودقة قياس كتلة MS عند اختيار استراتيجية العلامات الببتيد. لا تستخدم المعايير الببتيد بالديوتيريوم لأسباب الببتيد بالديوتريوم عكس المرحلة الوقت الاحتفاظ LCالصورة لتحويل 38.
      ملاحظة: عادة، يتم توليفها معايير الببتيد الداخلية زيتية باستخدام ~ 98٪ نقية [13 C 6، 15 N 4] الارجنتين و[13 C 6، 15 N 2] اليس أدرجت في كربوكسي-تيرميني.
    4. تنقية معايير الببتيد الداخلية باستخدام HPLC 39، وتحديد بدقة منهم 40.
  1. إضافة 100 ميكرولتر من 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك، و 20٪ ت / ت الأسيتونتريل (ACN) لكل 1 نانومول مجفف بالتجميد مستوى الببتيد لإنتاج تركيز الببتيد من 10 ميكرومتر (الرعاية استخدامها بوصفها الببتيد بالتبريد يمكن أن يكون لها كثافة منخفضة جدا ويمكن أن تضيع بسهولة). دوامة العينات لمدة 2 دقيقة وحمام يصوتن لهم لمدة 5 دقائق لضمان حل الببتيد كاملة.
  2. تجمع الببتيدات المنحل، والتركيز على خليط مما أدى إلى فراغ المكثف إلى الحجم النهائي من 80 ميكرولتر. إضافة 20 ميكرولتر من ACN حل أي الببتيد عجلت.
    ملاحظة: عينة الآن شاركntains 10 ميكرومتر من كل الببتيد و 20٪ ت / ت ACN.
  3. لمعايير الببتيد الداخلية، وإعداد سلسلة التخفيف الكمي لLC-SRM:
    1. إعداد 100 ميكرولتر من التخفيف 1 ميكرومتر: الجمع بين 90 ميكرولتر من 20٪ ت / ت ACN و 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر خليط الببتيد.
    2. إعداد 100 ميكرولتر من تمييع 100 نيوتن متر: الجمع بين 90 ميكرولتر من 20٪ ت / ت ACN و 10 ميكرولتر من 1 ميكرومتر خليط الببتيد.
  4. لمعايير الببتيد الخارجية، وإعداد 100 ميكرولتر من التخفيف 1 ميكرومتر لLC-MS من خلال الجمع بين 90 ميكرولتر من 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك و10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر خليط الببتيد.
    ملاحظة: يحتوي عينة الآن 1 ميكرومتر من كل الببتيد، 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك، و 2٪ ت / ت ACN، وعلى استعداد لاستخدامها في تطوير فحص LC-SRM.

3. LC-SRM الفحص التنمية

  1. تحليل خليط من المعايير الببتيد الخارجية (حوالي 1-10 بمول كل الببتيد في حقن) من خلال بندقية MS باستخدام HPL النانو تدفقنظام C بالإضافة إلى الثلاثي رباعية مطياف الكتلة (LC-MS-QQQ (/ MS)).
    1. استخدام نظام LC-MS مجهزة العمود الشعري محملة C-18 وسائل الإعلام (≤5 ميكرون قطر، ~ 200 المسام Å، طول ≥10 سم، معرف = 50-100 ميكرون) وتلميح النانو ESI (ينتج عادة ما تستخدم ليزر-ساحبة). تأكد من أن كل المدى LC-MS يتضمن ~ 60 دقيقة الانحدار الخطي (عادة 0-40٪ المذيبات B)، وهي خطوة العمود تجديد (~ 80٪ المذيبات B)، وخطوة العمود إعادة موازنة (~ 0٪ المذيبات B ) (المذيبات A = 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك في H 2 O، المذيبات B = 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك في ACN، معدل التدفق = 200-800 نيكولا لانغ / دقيقة، ESI الجهد = 1800 V، عرض Q3 العزلة = 0.7 م / ض، Q2 الضغط الأرجون = 1.5 mTorr).
    2. لكل فحص السلائف أيون، حيوي حدد أعلى ~ 10 أيونات السلائف على أشده لمطياف الكتلة جنبا إلى جنب (MS / MS). تشغيل كل عينة في مكررة بحيث يتم استخدام نوعين مختلفين سلالم طاقة الاصطدام: واحدة تهدف إلى تفتيت الأمثل +2 أيونات السلائف، والآخرل+3 السلائف أيونات 41.
    3. أداء LC-MS-QQQ (/ MS) تحليلات باستخدام Q3 السلائف ايون المسح الضوئي (Q1 السلائف أيون المسح يمكن أن يسبب المخلفات من قمم السلائف أيون الناجمة عن التصادمات الأرجون منخفضة الطاقة في Q2).
    4. تأكد من أن نظام LC-MS هو المنفذ بشكل كاف عن طريق تحليل عينات QC ومكررات التقنية. منع عينة المرحل باستخدام أعمدة LC تقدم طازجة وعن طريق تشغيل الفراغات المتعددة بين العينات.
  2. تحليل الناتج بندقية LC-MS-QQQ (/ MS) البيانات باستخدام قاعدة بيانات البحث على تسلسل معايير الببتيد الخارجية 42. إذا كان ذلك مناسبا، ونبذ التعرف الببتيد غامضة باستخدام عشرات تحديد الببتيد الثقة (على سبيل المثال، القيم التوقع) أو باستخدام النمذجة الإحصائية 42. بغض النظر، يدويا مراجعة كافة هويات الببتيد 43 للتأكد من أنها كلها لا لبس فيه.
  3. استخدام بندقية MS التعرف الببتيد لخداعالبنية مكتبة الطيف باستخدام برنامج حاسوبي مثل الأفق.
    1. إعداد قائمة الانتقال LC-SRM باستخدام 10/03 التحولات على أشده في أيون السلائف (+2 و+3 أيونات السلائف؛ +1 و +2 جزء أيونات؛ Y-، ب، والأيونات أنه لا ≥2 المخلفات منذ فترة طويلة).
    2. تجاهل الانتقال إذا كان السلائف وتفتيت أيون قيم م / ض تتداخل في دقة قياس كتلة QQQ-MS (تجزئة السلائف أيون في بعض الأحيان غير مكتملة، وتذكر أن تنظر في monoisotopic وأشكال النظائر الطبيعية الثقيلة، وكذلك ليس لها علامة و أشكال الثقيلة المسمى).
    3. وبالمثل، ونبذ الانتقال إذا كان جزء أيون م / ض يتداخل ذلك من أيون جزء مختلف من نفس السلائف أيون.
  4. استخدام قوائم الانتقال مما أدى لأداء LC-SRM يحلل من خليط من المعايير الببتيد الخارجية (أداء قياس الطيف الكتلي كما هو موضح في الخطوة 3.1؛ Q1 و Q3 عرض العزلة = 0.7 م / ض، يسكن الوقت = 2-50 مللي ثانية).
  5. أماهnually مراجعة البيانات LC-SRM الناتجة عنها، وحذف أي فحوصات الأداء الضعيف (تحليل البيانات LC-SRM الموضح في القسم 5).

4. LC-SRM فحوصات العينات البيولوجية

  1. إعداد أطباق من الخلايا المستزرعة 44. إذا كان يتم مقارنة ظروف تجريبية متعددة، كتلة وبطريقة عشوائية عينات للحد من أي تحيزات منهجية الممكنة 45.
  2. لكل طبق من الخلايا، ونضح مستنبت خلايا لإضاعة وتعليق الخلايا في منطقة عازلة خالية المصل 44. إذا لزم الأمر، وغسل الخلايا في منطقة عازلة في الدم مجانا لإزالة أي البروتين خارج الخلية المتبقية.
  3. لكل عينة، والاعتماد على عدد من خلايا قابلة للحياة، ومجموع باستخدام صمة عار جدوى (على سبيل المثال، التريبان الأزرق) وعدادة الكريات أو عداد خلية الآلي 44.
  4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي، ونضح supernatants أن تضيع 44 (نموذجي حجم الخلية بيليه هو ~ 30 ميكرولتر).
  5. خلط كل عينة باستخدام pipetting لطيف، ونقل كل لأنبوب 2 مل (مع غطاء المسمار مع الدائري O) التي تحتوي على ~ 100 ميكرولتر من 0.1 ملم زركونيا / حبات السيليكا (لاحظ أن حبات يمكن أن يسبب أنابيب مبكرة الحد الأقصى لتسرب ). ليز الخلايا قبل vortexing العينات لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة (هذا lyses الخلايا عن طريق حبة الضرب).
    1. بدلا من ذلك، ليز الخلايا باستخدام طريقة ميكانيكية مختلفة (على سبيل المثال، وذلك باستخدام الفرنسية صحافة أطراف أو التجانس).
      ملاحظة: تجنب الطرد المركزي الخلية لست] لأن هذا قد بيليه البروتين عجلت التي يمكن بعد التمديدherwise يتم هضمها tryptically والكشف عنها من قبل LC-MS.
  6. لعينات التشويه والتحريف السطحي، احتضان لهم عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لمساعدة تجانس العينة وتمسخ البروتين.
  7. حمام يصوتن العينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمساعدة التجانس وتمسخ البروتين.
    ملاحظة: يمكن تخزين لست] وتحلل عازلة في -80 ° C (لن تكون هناك حاجة إلى تحلل العازلة للخطوات 4.9 و 4.13).
  8. إجراء فحص تركيز البروتين 46 (على سبيل المثال، لفحص الحمض bicinchoninic) من لست] (وللتحلل العازلة كتجربة السيطرة).
  9. للتحاليل النوعية (أي أن ارتفعت-إلى أية معايير الببتيد الداخلية العينات)، ماصة 200 ميكروغرام (كتلة البروتين) من المحللة الخلية إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. للالتحليلات الكمية، وإعداد أربع عينات من هذا القبيل لاستقرار سلسلة النظائر التخفيف.
  10. لكل عينة، إضافة مستوى البروتين داخلي (مثلا </ م>، إضافة ~ 5 بمول من ~ 98٪ يراعة luciferase المراسل النقي).
  11. للالتحليلات الكمية، إضافة مستقرة سلسلة النظائر التخفيف من خليط متساوي المولية للمعايير الببتيد الداخلية (على سبيل المثال، 0، 0.2، 2، 20 بمول من كل الببتيد) للعينات.
    1. في موازاة ذلك، إعداد عينات للسيطرة على استخدام المعايير الببتيد الداخلي وحده (أي، لا المحللة الخلية) (على سبيل المثال، 0، 0.2، 2، 20 بمول من كل الببتيد).
    2. أيضا إعداد نماذج للسيطرة على استخدام المعايير الببتيد الخارجية والداخلية (على سبيل المثال: 2 بمول من كل معيار الببتيد الخارجي، و0، 0.2، 2، و 20 بمول من كل معيار الببتيد الداخلي).
      ملاحظة: تأكد من أن المعايير الببتيد خالية من حمض الفورميك لأنها قد تتداخل مع عملية الهضم التربسين.
  12. إضافة العازلة تحلل حتى يتسنى لجميع العينات هي كميات متطابقة. ملاحظة: حجم العينة النموذجية 70 ميكرولتر، لذلك سيتم استخدام هذا الكتاب لهذا البروتوكول.
  13. تقليل المخلفات بروتين السيستين بإضافة 0.7 ميكرولتر من 1 M DTT (الطازجة) لكل عينة (تركيز DTT النهائي هو 10 ملم) واحتضان العينات عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  14. cystines يؤلكل البروتين عن طريق إضافة 7 ميكرولتر من iodoacetamide مخزنة (500 ملي iodoacetamide، 1 M HEPES ∙ هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 8؛ الطازجة) لكل عينة (تركيز iodoacetamide النهائي هو 50 ملم) واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام (iodoacetamide خفيف حساسة). إذا لزم الأمر، إخماد iodoacetamide المتبقية عن طريق إضافة DTT إلى تركيز النهائي من 50 ملم.
  15. لكل من العينات التشويه والتحريف استخدام اليوريا، إضافة 482 ميكرولتر من 100 ملي HEPES ∙ هيدروكسيد الصوديوم الهيدروجيني 8 بحيث تركيز اليوريا النهائي هو 1 متر (هو تحول دون التربسين بشكل كبير في> 1 M اليوريا 47).
  16. Tryptically هضم البروتينات إلى ببتيدات.
    1. لكل نموذج يحتوي المحللة الخلية، إضافة 8 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر الصف التسلسل تعديل التربسين بحيث ويركز التربسين النهائيايون هو 01:50 (بروتين ث: ث) التربسين: عينة، واحتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    2. لكل عينة التي لا تحتوي على الخلايا المحللة، إضافة 0.5 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر تسلسل درجة المعدل التربسين، واحتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (كل واحد من هذه العينات هي لتجارب السيطرة، وتحتوي على 10 نانوغرام فقط عادة -10 ميكروغرام من الببتيد + بروتين الكتلة).
  17. لكل من العينات التشويه والتحريف اليوريا، إضافة 440 ميكرولتر من 2٪ ت / ت حمض الفورميك (تركيز حمض الفورميك النهائي هو 1٪ ت / ت). تأكد من أن هذه العينات هي درجة الحموضة ~ 3.
    1. لكل من العينات التشويه والتحريف السطحي، إضافة 914 ميكرولتر من 0.5٪ ت / ت TFA (تركيز TFA النهائي هو 0.5٪ ت / ت). تأكد من أن هذه العينات هي درجة الحموضة ~ 1.5. احتضان هذه العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ليتحلل السطحي.
  18. microcentrifuge لجميع العينات عند 21000 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتكوير مجموعة الذيل السطحي وأي PREC أخرىipitates التي من شأنها أن تسد على C-18 خرطوشة SPE.
  19. المرحلة الصلبة استخراج كل من supernatants باستخدام المتاح C-18 خرطوشة SPE (الاحتياطي A = 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك، مخزن B = 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك، و 80٪ ت / ت ACN؛ ~ 100 ملغ C- 18 الراتنج في خرطوشة). إجبار مراحل المتنقلة من خلال خرطوشة SPE C-18 باستخدام لمبة المطاط المسطحة، وذلك باستخدام متعددة الاستخراج، أو عن طريق الطرد المركزي خرطوشة في أنبوب 15 مل الطرد المركزي في 10 × ز لمدة 5 دقائق.
    1. الرطب العمود عن طريق تطبيق 1 مل من العازلة B، تتوازن ذلك من خلال تطبيق 1 مل من العازلة A مرتين، وتطبيق العينة، وغسل خرطوشة من خلال تطبيق 1 مل من العازلة A مرتين. أزل الببتيدات من خلال تطبيق 1 مل من العازلة B ببطء (~ 2 دقيقة).
  20. تركز كل شطافة في المكثف فراغ إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر تتبخر ACN. إضافة 200 ميكرولتر من H 2 O لكل عينة، والتركيز في كل مكثف فراغ إلى الحجم النهائي من 98 ميكرولتر تتبخر أي إعادة محتملةاملتبقي ACN.
  21. إضافة 2 ميكرولتر من 5٪ ت / ت حمض الفورميك في ACN إلى كل عينة (تركيزات العينة النهائية هي 0.1٪ ت / ت حمض الفورميك، 2٪ ت / ت ACN).
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -80 ° C.
  22. تحليل العينات باستخدام LC-SRM (كما في الخطوة 3.4). لتحليل نوعي LC-SRM، تشغيل العينات البيولوجية والمعايير الببتيد الخارجية، وتحليل كافة البيانات الناتجة معا. لتحليل كمي LC-SRM، قم بتشغيل سلسلة النظائر تمييع كل عينة بيولوجية، وأيضا تشغيل عينات تتكون من المعايير الببتيد وحده، وتحليل كافة البيانات الناتجة معا.

5. تحليل LC-SRM البيانات

ملاحظة: تحديد الببتيد والكمي يمكن مبسطة للغاية ومؤتمتة جزئيا باستخدام برنامج مثل الأفق، ولكن من المستحسن لا يزال بشدة لكافة البيانات الشرح إعادة النظر يدويا. أيضا، فمن الأفضل لاستبعاد المعلومات على مستوى البروتين خلال ANNOT دليلأوجه البيانات LC-SRM لمنع التحيز.

  1. لكل تحديد الببتيد، تأكد من أن شكل كل البيانات الشخصية شطف الانتقالية جاوس تقريبا. لكل الانتقالية، تأكد من أن ملف التعريف شطف هو نتاج إشارات متعددة يقاس كشف MS (أي ليس نتاج واحد أو اثنين من المسامير عشوائية من MS الضوضاء).
  2. لكل تحديد الببتيد، وضمان أن يتم تحديد كامل الملف الشخصي الببتيد شطف. تجنب يدويا ضبط الحدود الشخصي شطف من المكونات الفرعية لتحديد الببتيد (شكل الببتيد الثقيل المسمى، شكل الخالي من الملصقات، أيونات السلائف الفردية، والتحولات الفردية).
  3. تأكد من أن كل البيانات الشخصية شطف الانتقال ديه نسبة الإشارة إلى الضوضاء (ق / ن) ≥3. ملاحظة: "الضوضاء" يشير إلى الضوضاء MS عشوائي، وليس لاستنساخه إشارة من التحاليل coeluting. يمكن اللوني وظائف تجانس يساعد كثيرا في تحليل البيانات الصاخبة.
  4. لكل تحديد الببتيد،تأكد من أن كافة التحولات ديك ملامح شطف متطابقة تقريبا (وليس فقط على قدم المساواة مرات مهيمنة الذروة، وقد يكون لمحات شطف سعة مختلفة).
  5. ليحلل LC-SRM كمية كبيرة من المعايير الببتيد (عادة ≥100 fmol كل الببتيد)، تأكد أن المقابلة لمحات الببتيد شطف مكثفة جدا (ق عادة / ن ≥100)، وأن هويات الببتيد هي لا لبس فيها. ملاحظة: ستكون هذه الهويات واثقة للغاية ستكون حاسمة لتحديد الببتيدات المستمدة من عينة بيولوجية المقابلة.
  6. لكل تحديد الببتيد، تأكد من أن شدة التحول النسبية تتطابق مع تلك من مستوى الببتيد التي تم تحديدها بثقة. إذا لزم الأمر، ونبذ صاخبة، نسبيا منخفضة الحدة ملامح شطف انتقالية، ولكن تأكد من أن أيا من التحولات الشديدة نسبيا في عداد المفقودين. تجاهل مكثفة نسبيا لمحات شطف الانتقالية التي يتم إلى حد كبير وبشكل لا لبس فيه تتأثر المشتركيبلغ حجمه الملوث.
  7. لكل تحديد الببتيد، وتقدير احتمال أنه تم إنتاجه بشكل عشوائي من قبل إشارة الخلفية (الضوضاء MS عشوائي بالإضافة إلى إشارة استنساخه من التحاليل coeluting).
    1. تقدير هذا الاحتمال يدويا عن طريق فحص كامل اللوني LC-SRM وتقدير تفرد كل تحديد الببتيد. إنتاج مجموعة من التعرف الببتيد ثقة بأن لديه المعدل المقدر كاذبة اكتشاف (روزفلت) من 5٪. استخدام معايير أكثر صرامة (على سبيل المثال، فرانكلين روزفلت ≤1٪) إذا كان مطلوبا أو ثقة أعلى مجموعة من تحديد الهوية (لا ينصح استخدام معايير اكثر مرونة).
    2. بدلا من ذلك، استخدام خوارزمية mProphet 48 أو الخوارزمية المراجعة 49، ولكن يدويا استعراض نتائج.
  8. لكل تحديد الببتيد، تأكد أن الوقت شطف يتسق مع للا مائية من الببتيد (تم تصميم الأفق لأداء هذا الحساب).
  9. لكل الببتيد، تأكد من أنالوقت شطف موضوعه متفقا عبر أشواط LC.
    ملاحظة: LC-SRM تحليلات بعض الأحيان تنتج ملامح شطف التي تميل بشكل منهجي بين أشواط. تحولات منهجية وينتظر أن تتم بعد التعديلات أداة مثل استبدال عمود. أيضا، يمكن أن الببتيدات يبلغ حجمه في وقت مبكر تكون عرضة للتحول (وخاصة إذا تم تحميل العمود بالقرب من القدرات)، ويمكن في وقت متأخر الببتيدات يبلغ حجمه أيضا تكون عرضة للتحول. تحديد الببتيد اكتمال الآن.
  10. لتحسين الببتيد الكمي، reinspect كل تحديد الببتيد وتجاهل لمحة شطف الانتقال إذا كان صاخبة لا سيما بالمقارنة مع غيرها من التشكيلات شطف الانتقال من تحديد الببتيد. تجاهل لمحة شطف الانتقال إذا شدته الانتقال النسبية خاطئة (مقارنة مع مستوى الببتيد).
  11. تفقد حدود كل أيون السلائف وشطف الانتقال الجانبي. إذا لزم الأمر، وضبط دقيق لحدود الشخصي شطف المحاصيل بعيدا إشارة الخلفية (أو إلى iخلفية mprove تقدير إشارة).
  12. لكل معيار الببتيد الداخلي، معرفة ما اذا كان هو ملوثة مع كمية ملحوظة من الببتيد الضوء (التي يحددها LC-SRM تحليل المعايير الببتيد الداخلية وحدها، هو موضح أعلاه). وفي وقت لاحق، ونبذ أي ضوء ملامح الببتيد شطف التي تعرضت للخطر بشكل كبير من التلوث الخفيف الببتيد ضمن المعايير الببتيد الداخلية.
  13. تحديد كل انتقال الملف الشخصي شطف عن طريق حساب مساحته ذروة LC. إذا كان ذلك مناسبا، خصم إشارة الخلفية المقدرة. تحديد كل الببتيد الشخصي شطف بجمع القيم الكمي الانتقال المقابلة (الآخرة، وهذا ما يشار إليها باسم "Sum_Peak_Area" القيمة). لكل قيمة Sum_Peak_Area عينة الببتيد البيولوجية، وحساب البيولوجي عينة الببتيد فرة المولي باستخدام بيانات من LC-SRM المعايير الببتيد الداخلية أو الخارجية (استخدام فقط التحولات التي تم قياسها بنجاح من قبل كل من عينة الببتيد البيولوجيLC-SRM وذلك من مستوى الببتيد).
    1. الكمي باستخدام معايير الببتيد الخارجية (غير مستحسن):
      1. رسم الببتيد الخارجي القيم Sum_Peak_Area القياسية مقابل الببتيد الخارجي القيم وفرة المولي القياسية. إنتاج منحنى قياسي من المناسب الانحدار الخطي للبيانات (عادة، يجب أن يستعمل فقط المكون خطية من مجموعة ديناميكية؛ وينبغي أن تستخدم أي مكونات غير الخطية بحذر شديد). لكل قيمة Sum_Peak_Area عينة الببتيد البيولوجية، استخدم المنحنى القياسي لحساب الببتيد فرة المولي.
        ملاحظة: لا ينصح بهذا الأسلوب الكمي لأنه يتطلب أن إعداد العينات وLC-SRM يكون الإثباتية قوي لأن يتم إعداد العينات البيولوجية والمعايير الببتيد الخارجية وتحليلها من قبل LC-SRM على حدة. أيضا، فإنه لا يأخذ في الحسبان الآثار مصفوفة (الآثار الناجمة عن مكونات عينة أخرى من الحليلة).
    2. الكمي باستخدام الداخليةمعايير الببتيد (موصى به):
      1. لكل عينة الببتيد قيمة Sum_Peak_Area البيولوجية وما يقابلها من الببتيد الداخلية قيمة Sum_Peak_Area المعيار الثقيل المسمى، وحساب ضوء / نسبة الثقيلة. استخدام هذه النسبة كمقياس للالمقابلة ضوء / الببتيد الثقيلة نسبة الوفرة المولي لحساب وفرة المولي من العينة الببتيد البيولوجي. على وجه التحديد، والبيولوجي عينة الببتيد فرة المولي تساوي الببتيد الداخلي المولي قياسي فرة مضروبا في ضوء / نسبة Sum_Peak_Area الثقيلة.
      2. لكل تكرار والهدف الببتيد البيولوجي، وتحديد مجموعة خطية من تقدير LC-SRM عن طريق إنشاء منحنى قياسي باستخدام الانحدار الخطي. على وجه التحديد، رسم الببتيد الداخلي القيم وفرة المولي قياسي مقابل ثقيلة / خفيفة Sum_Peak_Area القيم نسبة (لاحظ أن كتلة عينة بيولوجية ثابتة عبر مجموعة البيانات). تتطلب كل عينة قيمة الببتيد Sum_Peak_Area البيولوجية هي ضمن مجموعة خطية (typicحليف، إلا أن عنصر خطية من النطاق الديناميكي يجب أن تستخدم. وينبغي أن تستخدم أي مكونات غير الخطية بحذر شديد). وبالمثل، تنفيذ هذه الخطوة لكل الانتقال الببتيد الهدف.
        ملاحظة: الحليلة الكمي من قبل LC-QQQ-SRM يجب أن تكون خطية على مجموعة واسعة ديناميكية (~ 10000). في نهاية منخفضة، وسوف إشارة الخلفية (الضوضاء MS عشوائي بالإضافة إلى إشارة استنساخه من التحاليل coeluting) تقليل دقة القياس الكمي والدقة. في نهاية عالية، وسوف كاشف تشبع يسبب استقامة (في نهاية المطاف، وهذا يمكن أن يسبب ملامح شطف أن يكون انطلاق شقة في كثافة إشارة محددة).
  14. إذا كان ذلك مناسبا، إجراء تطبيع العالمي عبر العينات، مثل التطبيع النزعة المركزية 50، لتصحيح الاختلافات الطفيفة في كمية العينة قبل في ارتفاعه للمعايير الببتيد الداخلية. إذا لزم الأمر، فقط استخدام البروتينات التدبير المنزلي من الخطوة 1.1.
  15. إذا لزم الأمر، يحسب في عداد المفقودين quantificatأيون تقدر 51،52.
    ملاحظة: إنه من غير المناسب ببساطة استبدال القيم المفقودة مع نصف الحد الأدنى للالكمي (LLOQ) أو نصف الحد من الكشف (اللد) لأن ذلك من شأنه أن يقلل بشكل مصطنع تقدير التباين، ويمكن أن يؤدي إلى اختبار إحصائي (على سبيل المثال، وهو ANOVA ) تنتج نتيجة إيجابية كاذبة (خطأ I نوع). ومع ذلك، وتجاهل القيم المفقودة يمكن أيضا أن يكون مشكلة. على سبيل المثال، إذا كان نصف القيم وفرة الحقيقية هي أقل من اللد، والنصف الآخر فوق LLOQ، ثم لاحظ يعني وفرة من شأنه أن نبالغ في تقدير يعني وفرة حقيقية.
  16. تأكد من أن المقايسات تستوفي المبادئ التوجيهية المقبولة على نطاق واسع لLC-SRM 23-25. والجدير بالذكر، أن تشترط على معامل الاختلاف في القيم الكمي هو عادة ≤25٪ لفحوصات السريرية، و≤35٪ لفحوصات غير السريرية 25. لفحوصات LC-SRM المتعلقة الرعاية الصحية أو البيطرية المنتجات أو الخدمات التي سوف يتم بحثها عن التطبيق التنظيميroval، تتطلب أن المقايسات تلبي متطلبات الدقة أكثر صرامة لمثل هذه المقايسات: "إن الدقة تحدد في كل مستوى التركيز يجب أن لا تتجاوز 15٪ من معامل الاختلاف (CV) باستثناء LLOQ، حيث يجب أن لا تتجاوز 20٪ من CV "23،24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تطوير نماذج حسابية التنبؤية للإشارة مسارات نقل هو واحد من الأهداف الأساسية للبيولوجيا الأنظمة 53. للأسف، حتى بالنسبة لمسارات الإشارات التي تم دراستها على نطاق واسع ولها أهمية سريرية عالية، فإنه لا يزال لا عموما من الممكن التنبؤ كميا سلوك الطريق ردا على الاضطرابات (على سبيل المثال، وهذا ينطبق على MAPK / ERK مسار 54). مؤخرا، تحقيقا توظيف البروتينات المستهدفة، transcriptomics، والنمذجة الحاسوبية والمحاكاة لدراسة الكيميائي الماوس بلعم إشارات الطريق 56. كان محور التحقيق سفينغوزين-1-فوسفات الكيميائي بوساطة من RAW 264.7 خلايا (خط الخلية الماوس الوحيدات / بلعم). لتسهيل النمذجة الطريق، وضعت فحوصات LC-SRM وأجريت لقياس الوفرة المطلقة من البروتينات المسار الكيميائي داخل RAW 264.7 خلايا. وكانت القيم وفرة مما أدى استخدامد كمعلمات للنموذج المسار.

بدأ المخطط العام التجريبية (الشكل 1) مع قائمة من البروتينات المستهدفة، والتي شملت G I2، وهو heterotrimeric G-بروتين α-الوحيدات. نجاح بروتوكول شامل يعتمد بشكل كبير على اختيار الأهداف الببتيد التي هي proteotypic وquantotypic، مثل YDEAASYIQSK. تم إعداد خليط من معايير الببتيد الخارجية وتحليلها بواسطة بندقية LC-MS-QQQ (/ MS). وتألفت الناتجة YDEAASYIQSK جنبا إلى جنب الطيف الكتلي العديد من الأيونات شظية، وكان لديها خلفية منخفضة (الشكل 2). واستخدمت الأطياف لتكوين قوائم الهدف LC-SRM يحتوي على أهم عشرة الأيونات شظية على أشده في السلائف أيون.

تم تحليل خليط من 409 مستويات الببتيد الخارجية ("JPT409") في ثلاث نسخ من قبل النوعي LC-SRM (لا تظهر البيانات). وشملت هذه العينة ثلاثة الببتيدات شركة i2 G، وكان تحديد كل ثلاثةالحكم على أن تكون واثقة. وفي وقت لاحق، RAW 264.7 عينات (مكررات البيولوجية "RAW1" و "RAW2") وعينة JPT409 تم تحليل كل من نسختين (اثنان LC-SRM مكررات الفنية) من خلال النوعي LC-SRM (هؤلاء الستة LC-SRM أجريت تحاليل كما بالمثل كما ممكن). تم التعرف على الببتيد YDEAASYIQSK بثقة في جميع التحليلات ستة (أرقام 3A - C). كانت YDEAASYIQSK الانتقال أنماط كثافة متناسقة عبر يحلل ستة LC-SRM، وهذه كانت مشابهة تقريبا لطلقات نارية LC-MS (/ MS) نمط ("مكتبة" تكرار من الشكل 3C).

نمط من شدة انتقال وحده لا يكفي دائما لتحديد واثق من الببتيد. يجب أن يكون للا مائية الببتيد وقياس LC الوقت الاحتفاظ ثابت. أيضا، يجب أن يكون المعايير الببتيد الخارجية والمقابلة الببتيدات عينة بيولوجية تقريبامرات الاحتفاظ متساوية. تم العثور على للا مائية (تقدر تستخدم الإصدار 3.0 SSRCalc 100 خوارزمية 55) ولاحظ الوقت الاحتفاظ YDEAASYIQSK أن تكون متسقة (الشكل 4A). أيضا، تم قياس الوقت الاحتفاظ YDEAASYIQSK باستخدام كل التحليلات RAW 264.7 وتحليل المعايير الببتيد الخارجية، وكافة القيم الوقت الاحتفاظ كانت متساوية تقريبا (الشكل 4B).

معظم النوعي LC-SRM تحليل العينات البيولوجية كانت ناجحة، لذلك المقابلة الثقيلة المسمى، منقى، كميا وأعدت معايير الببتيد الداخلية وارتفعت-إلى RAW 264.7 الخلية لست]. تم استخدام النظائر سلسلة تخفيف LC-SRM لتحليل العينات التي تتكون من المعايير الببتيد الداخلية وحدها (عينة "R0")، والداخلية والمعايير الببتيد الخارجية (عينة "R1")، وستة RAW 264.7 مكررات البيولوجية (عينات "R2" - "R7"). اثنين احواستخدمت الإقليم الشمالي denaturants البروتين لاختبار أي قضايا البروتين الإذابة، تمسخ، الألكلة، و / أو الهضم المحتملة التي قد تقوض دقيق البروتين الهدف الكمي (عينات R2-R4 تستخدم اليوريا، وعينات R5-R7 تستخدم RapiGest SF). والخفيفة والثقيلة أشكال YDEAASYIQSK الواردة الانتقال متطابقة تقريبا أنماط كثافة وملامح شطف (أرقام 5A - C). وقد لخص LC-SRM استخدمت نسب منطقة الذروة كإجراء وفرة الببتيد النسبية، واستخدمت النسب YDEAASYIQSK لحساب G القيم وفرة شركة i2 في وحدات النسخ في RAW 264.7 الخلية. في موازاة ذلك، وG الثاني I2 تم استخدام الببتيد المعيار الداخلي (IAQSDYIPTQQDVLR) لإجراء فحوصات الكمية G I2 LC-SRM من نفس الخام 264.7 العينات، وفحوصات اثنين من إنتاج القياسات وفرة G I2 مماثلة إلى حد كبير عبر كل من مكررات البيولوجية (الشكل 5D). اتفاق اثنين من G I2 المقايسات LC-SRM كانت صحيحة ودقيقة.

وعموما، كان كميا 35 البروتينات باستخدام 58 المعايير الببتيد الداخلية (الجدول 1). تجدر الإشارة إلى أن فحوصات LC-SRM من مستوى البروتين الداخلي، وكانت صحيحة ودقيقة (يراعة luciferase المراسل الخطوة 4.11). مجموعة شاملة من البيانات أفق من هذا التحقيق هو متاح في قاعدة بيانات على الانترنت LC-SRM بانوراما (في المجلد Manes_RAW_Chemotaxis في https://panoramaweb.org/labkey/project/NIH_NitaLazar/begin.view).

الشكل 1
وقد تم اختيار نظرة عامة على بروتوكول ثلاثة الببتيدات المستهدفة المؤقتة للG I2 (أ heterotrimeric G-بروتين α-الوحيدات) لالببتيد الخارجي تركيب القياسية: الرقم 1. وكانت هذه analyزد بواسطة بندقية LC-MS (/ MS) لتطوير ثلاثة G I2 المقايسات LC-SRM، وكانت تستخدم هذه المقايسات لأداء التحاليل النوعية من العينات البيولوجية. وقد تم تحديد كل ثلاثة G الببتيدات المستهدفة I2، وتم اختيار اثنين لإعداد الببتيد الداخلي القياسي. واستخدمت-التربسين شطورة "JPT-الكلمات" لتحديد المعايير الببتيد الداخلية باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. استخدمت المعايير الببتيد داخلية للقيام الكمية G I2 المقايسات LC-SRM من RAW 264.7 العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: بندقية LC-MS (/ MS) الطيف الشامل يصور نشأت من تحليلات واحدة من G معايير الببتيد الخارجية توفرها i2 (YDEAASYIQSK). لهذا السلائفأيون، وقد تم اختيار العشرة الأوائل التحولات على أشده لLC-SRM (باستثناء ايون A1 1+ جزء بسبب طوله القصير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: النوعي LC-SRM من G شركة i2 واللوني YDEAASYIQSK من JPT409 التحليلات الواردة خلفية منخفضة جدا وحددت الببتيد بثقة (A). وأسفرت المقابلة RAW 264.7 التحليلات في مزيد من إشارة الخلفية، ولكن تحديد الببتيد لا يزال لا لبس فيه (B). كانت أنماط كثافة انتقال النسبية متناسقة عبر كل ستة LC-SRM يحلل (اثنان مكررات الفنية ثلاث عينات المستقلة)، وكانت هذه تقريبا سيميلار إلى المقابلة بندقية LC-MS (/ MS) نمط ("مكتبة" تكرار) (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4: الببتيد التنبؤ الوقت الاحتفاظ والاختلاف عبر أشواط احتسب الانحدار الخطي باستخدام للا مائية تقدر وتقاس النوعي LC-SRM الوقت شطف كل من الببتيدات المستهدفة، وكانت مرات شطف توقع وقياس من YDEAASYIQSK ثابت (A). . بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد اتساق الوقت شطف لاحظ كل الببتيد عبر LC-SRM التحليلات. الأوقات شطف من YDEAASYIQSK امتدت مجموعة من ~ 40 ثانية، وهو ما يتسق مع دقة الصك LC-SRM التي تم استخدامها (قيمهي وقت الذروة قمة +/- العرض الكامل في نصف كحد أقصى، وكذلك العرض الكامل في قاعدة الذروة) (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: تم تلخيص الكمي LC-SRM من G شركة i2 والاستشرابية الانتقال من الببتيد عينة بيولوجية (A) ومستوى الببتيد الداخلي (B) كان يتفق شدة الانتقال النسبية، و (C) (صورت هو "R2" تحليل لYDEAASYIQSK باستخدام 10 fmol مستوى الببتيد الداخلي). كانت الخفيفة والثقيلة لمحات شطف متناسقة (C)، وكانت تستخدم نسبة للمنطقة في ظل هذه المنحنيات كإجراء من دوري الدرجةحزب التحرير / الثقيلة وفرة الببتيد. واستخدمت الثاني G شركة i2 الببتيد الداخلي معيار (IAQSDYIPTQQDVLR) لالكمي LC-SRM في موازاة ذلك، وكان ينتج عن ذلك من القيم وفرة G I2 متناسقة عبر كل من مكررات البيولوجية ستة واثنين من الببتيدات المستهدفة (عموما، ن = 12 و CV = 8.38 ٪) (D). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

<td> 68467
UniProt الانضمام البروتين المستهدف الهدف الببتيد وفرة (fmol / ميكروغرام) وفرة (نسخ / خلية، تطبيع) السيرة الذاتية
P08659 luciferase المراسل (UV عند 280 نانومتر) 23،824 ن / أ ن / أ
P08659 luciferase المراسل VVDLDTGK 24،103 ن / أ 7٪
P08659 luciferase المراسل VVPFFEAK 24،717 ن / أ 4٪
P60710 الأكتين، السيتوبلازمية 1 IWHHTFYNELR 760،448 61762598 3٪
P16858 GAPDH LISWYDNEYGYSNR 357،803 28906524 14٪
P06151 نازعة اكتات LLIVSNPVDILTYVAWK 129،623 10633145 30٪
P99024 تويولين β 5 ALTVPELTQQVFDAK 78،765 6398971 3٪
P20152 Vimentin SLYSSSPGGAYVTR 121،100 9807488 10٪
P60766 CDC42 DDPSTIEK 86،647 6957317 27٪
P60766 CDC42 QKPITPETAEK 26،475 2153669 6٪
Q8C3J5 DOCK2 ETLYETIIGYFDK 1،459 118539 15٪
Q8C3J5 DOCK2 ISSSPTHSLYVFVR 1،795 143440 33٪
Q8BPU7 ELMO1 ALTTKPSSLDQFK 2،302 186754 7٪
Q8BPU7 ELMO1 SAIDISILQR 1،244 99728 25٪
Q8BGM0 FGR GAYSLSIR 1،099 89473 17٪
Q8BGM0 FGR WTAPEAALFGR 0،319 24766 6٪
P27601 Gα 13 GIHEYDFEIK 0،843 15٪
P27601 Gα 13 VFLQYLPAIR 1،295 106176 23٪
P08752 Gα (ط) 2 IAQSDYIPTQQDVLR 10.900 885701 2٪
P08752 Gα (ط) 2 YDEAASYIQSK 9،774 790616 9٪
Q9DC51 Gα (ك) EYQLNDSASYYLNDLDR 6،574 537862 15٪
Q9DC51 Gα (ك) ISQTNYIPTQQDVLR 3،504 285784 10٪
P62874 Gβ 1 AGVLAGHDNR 17،078 1385578 4٪
Q9CXP8 Gγ 10 DALLLGVPAGSNPFR 2،167 179178 36٪ P63213 Gγ 2 EDPLLTPVPASENPFR 3،284 266360 8٪
Q80SZ7 Gγ 5 VSQAAADLK 6،087 493512 6٪
P08103 HCK GPVYVPDPTSSSK 1،143 93044 12٪
P08103 HCK IIEDNEYTAR 0،944 77147 19٪
P43406 إنتغرين α V AGTQLLAGLR 0،276 22264 32٪
P43406 إنتغرين α V SHQWFGASVR 0،443 34235 5٪
P25911 LYN VIEDNEYTAR 1،461 119377 13٪
Q5SW28 PI3K 5 التنظيمي AGFPGILDTASPGK 0،301 24331 11٪
Q8K3B3 α التنظيمي PI3K LYEEYTR 0،472 38592 16٪
Q8K3B3 α التنظيمي PI3K TWNVGSSNR 0،524 42697 12٪
Q8K3B3 α التنظيمي PI3K VLSEIFSPVLFR 0.440 35902 20٪
Q5U3K7 β التنظيمي PI3K DTPDGTFLVR 0،188 15262 30٪
Q5U3K7 β التنظيمي PI3K IAEIHESR 0،282 22561 13٪
Q0VGQ5 α PI3K LINLTDILK 0.102 8494 38٪
Q8CI98 PI3K δ HEVQEHFPEALAR 0،178 14566 22٪
Q8CI98 PI3K δ ITEEEQLQLR 0.481 38709 24٪
Q9ES52 PIP3 5-الفوسفاتيز 1 IVVLAKPEHENR 0،486 39194 19٪
Q9ES52 PIP3 5-الفوسفاتيز 1 LSQLTSLLSSIEDK 2،056 167123 7٪
Q69ZK0 راك GEF 1 تعتمد على PIP3 DSVLSYTSVR 0،647 52712 32٪
Q69ZK0 راك GEF 1 تعتمد على PIP3 NQLLLALLK 0،354 27425 5٪
Q9CQE5 RGS 10 ASSQVNVEGQSR 2.460 199782 4٪
Q9CQE5 RGS 10 WASSLENLLEDPEGVQR 20،647 206005 11٪
Q9CX84 RGS 19 AEANQHVVDEK 0،495 39753 21٪
Q9CX84 RGS 19 LIYEDYVSILSPK 0،846 68481 22٪
B9EKC3 رو GAP 5 DGLAQELANEIR 0،448 34653 10٪
Q99PT1 رو GDI 1 SIQEIQELDK 3،156 267063 16٪
Q99PT1 رو GDI 1 VAVSADPNVPNVIVTR 37،077 3006168 5٪
Q61599 رو GDI 2 LNYKPPPQK 37،975 3086596 3٪
Q61599 رو GDI 2 YVQHTYR 21،436 1711908 47٪
Q61210 رو GEF 1 FDGAEGSWFQK 2،149 176139 47٪
Q61210 رو GEF 1 SGLELEPEEPPGWR 2،911 236483 8٪
Q9QUI0 RhoA QVELALWDTAGQEDYDR 43.500 3532438 8٪
P70336 ROCK2 GAFGEVQLVR 0.527 42800 23٪
P70336 ROCK2 IYESIEEAK 1،011 83794 33٪
P70336 ROCK2 LEGWLSLPVR 0،573 48259 22٪
Q8R0X7 S1P ياز 1 AGYPLEKPFDFR 1،787 147043 27٪
Q8R0X7 S1P ياز 1 TPEIVAPESAHAAFDK 3،562 291791 18٪

الجدول 1: الكمية LC-SRM من RAW البروتينات 264.7 خلية وكميا خمسة وثلاثون RAW 264.7 بروتينات الخلية باستخدام الثامنة والخمسين المعايير الببتيد الداخلية وستة مكررات البيولوجية. خمسة من البروتينات المستهدفة والتدبير المنزلي البروتينات (الأكتين، GAPDH، نازعة اكتات، تويولين، وvimentin)، وكان كميا لتمكين التطبيع عبر العينات البيولوجية (الخطوة 1.1). بالإضافة إلى ذلك، كان مستوى البروتين الداخلي ارتفعت-في كل المحللة الخلية وكميا بواسطة LC-SRM (4.765 بمول من يراعة luciferase لكل 200 ميكروغرام عينة و 98٪ نقية من قبل SDS-PAGE، كميا طيفيا عند 280 نانومتر؛ الخطوة 4.11). تم حساب القيم CV عبر مكررات البيولوجية ستة باستخدام القيم وفرة طبيعية على مستوى العالم (باستثناء luciferase المراسل؛ الخطوة 5.15).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المطلق البروتين الكمي ضروري لمجموعة متنوعة جدا من التطبيقات الطبية الحيوية مثل التحقق من صحة العلامات البيولوجية ونقل الإشارة النمذجة الطريق. في الآونة الأخيرة، البروتينات المستهدفة باستخدام LC-SRM قد استفاد من التحسينات على تقنيات عديدة بما في ذلك إعداد الببتيد القياسية، HPLC، QQQ-MS، وتحليل البيانات LC-SRM. وبناء على ذلك، فقد أصبح بديلا قويا لالمناعية. يمكن المناعية تكون حساسة للغاية والإنتاجية العالية، ولكن يمكن وضع المناعية قوية تكون صعبة للغاية بسبب المناعية يمكن أن يكون عرضة للعبر التفاعل و / أو تدخل، تتعارض مع خلية / الأنسجة طرق تحلل / التجانس، و / أو غير قابلة للمضاعفة 5،8. على سبيل المثال، الاختبار الأكثر شمولا لعبر التفاعل هو لأداء المناعية باستخدام عينات التي نشأت من بالضربة القاضية جين، التي يمكن أن تكون صعبة للاستعداد.

يصف هذا البروتوكول pept الهدفاختيار بيئة تطوير متكاملة، وتطوير فحص LC-SRM، نوعي وكمي LC-SRM، وتحليل البيانات LC-SRM. انه كان يستخدم لقياس وفرة مطلقة من 36 الكيميائي البروتينات المسار داخل RAW 264.7 خلايا 56، ولكن تطبيقه يمتد إلى ما هو أبعد هذا تطبيق معين. على الرغم من أنه صمم لقياس البروتينات داخل الكريات الخلايا، يمكن تعديله لتحليل العينات البيولوجية الأخرى (على سبيل المثال، biofluids) والأهداف SRM أخرى (على سبيل المثال، phosphopeptides). على سبيل المثال، تغيير بروتوكول التجانس و / أو هضم البروتين قد تحسن إلى حد كبير الإذابة، تمسخ، الألكلة، والهضم، وتقدير من البروتينات المستهدفة صعبة للغاية (على سبيل المثال، بروتينات الغشاء)، أو قد تمكن من تحليل عينات الصعبة خاصة (على سبيل المثال، والعينات تحتوي <100 ميكروغرام البروتين الكتلة).

الاختيار الأولي من الببتيدات المستهدفة هي حرجة ولكن يمكن أن يكون مضيعة للوقت. لhundreس البروتينات المستهدفة، يمكن أن تستخدم على درجة مخصصة لكل المعايير، ويمكن أن يكون في المرتبة الببتيدات المستهدفة مؤقتة على أساس مجموع الدرجات، كما حدث في السابق 56. بدلا من ذلك، هذا التحليل يمكن أن يكون آليا باستخدام PeptidePicker، واجهة الويب التي يبسط إلى حد كبير اختيار الببتيد الهدف 30 (http://mrmpeptidepicker.proteincentre.com/).

بعد أن تم اختيارها الببتيدات المستهدفة وتم إعداد المقايسات LC-SRM، فمن الأهمية بمكان أن النوعية المقايسات LC-SRM من العينات البيولوجية أن يؤديها لأن حتى الببتيد proteotypic للغاية وquantotypic لا تكون قابلة للكشف إذا يتم التعبير عن بروتين في مستويات أدنى من عتبة حساسية الصك، أو إذا كان التدخل خلفية إشكالية على وجه الخصوص. والبعد الثاني من الفصل (على سبيل المثال، قوية الصرف HPLC الموجبة، عكس المرحلة العالية الحموضة-HPLC، وخالية من هلام الكهربائي) يمكن أن تزيد من عمق البروتين، ولكن سوف تتطلبأكثر كثيرا من الوقت وأداة لتحليل البيانات. بدلا من ذلك، استراتيجية تخصيب (على سبيل المثال، immunoenrichment peptide- ومستوى البروتين وتجزئة الخلية) يمكن أن تحسن عمق البروتين، وimmunodepletion من البروتينات وفيرة للغاية يمكن استخدامها للحد من التدخل من قبل coeluting التحاليل.

LC-SRM من ~ عشرات من العينات ل~ مئات أو آلاف ~ من التحولات وعادة ما يتطلب الوقت أداة واسعة النطاق. على الرغم من عدم استخدامه لهذه الدراسة، LC-SRM جدولة (قياس التحولات خلال نوافذ زمنية محددة مسبقا شطف) تمكن من تحليل المزيد من التحولات في التشغيل. أيضا، جدولة يقلل من دورة العمل SRM خلال فترات الشاغرة نسبيا من التدرج LC، وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحسين تحديد الببتيد وتقدير. ومع ذلك، يتطلب جدولة أن الوقت شطف الببتيد أن تحدد بثقة من تحليل LC-SRM النوعي. التغييرات الطفيفة في إعداد عينة، وأداة LC-MS،أو طريقة LC-MS يمكن أن يسبب جدولة لاقتصاص أو حتى يغيب تماما الببتيدات المستهدفة. على سبيل المثال، تم نقل البيولوجية ملامح شطف عينة YDEAASYIQSK قليلا بالنسبة لأولئك من مستوى الببتيد الخارجي (الشكل 4B)، وربما يعود ذلك إلى آثار المصفوفة.

وباختصار، يقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتطوير وتطبيق LC-SRM لتقدير البروتين المطلق. وقد تم بالفعل أثبتت الكميات المطلقة من البروتينات التي LC-SRM أن يكون استنساخه بين المختبرات 16،19. تقنيات البروتينات، بما في ذلك إعداد نموذج (على سبيل المثال، والتشغيل الآلي)، اللوني السائل، وقياس الطيف الكتلي، وتحليل البيانات، وتتحسن بسرعة، وتمكن LC-SRM لتصبح عملية للبحث واسعة النطاق والتطبيقات السريرية. خصوصية وحساسية ودقة، بتكاثر، والإنتاجية العالية من الكمية LC-SRM يجعلها أداة قوية للبحوث الأساسية والطب الحيوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade Fisher A955-1
BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit Fisher 23235
Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1 mm BioSpec Products 11079101z
Bestatin hydrochloride Sigma B8385-10MG
Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) Lonza 12-614F
Cell culture EDTA, 500 mM, pH8 Gibco 15575
Cell culture fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11550
Cell culture L-glutamine Sigma G8540-25G
Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 Gibco 10010-049
Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v Lonza 17-942E
Cellometer Auto T4 cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer Auto T4 disposable counting chambers Nexcelom Bioscience CHT4-SD100-014
Dithiothreitol (DTT) Sigma D5545-5G
Formic acid, LC-MS grade, ampules Fisher A117-10X1AMP
Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1 mm deep Marienfeld-Superior 0640030
HEPES, 1 M, pH 7.2 Mediatech 25-060-CI
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR BDH3028-2.5LG
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000
LC coated silica capillary, 50 µm id Polymicro Technologies 1068150017
LC vial, autosampler, 12 mm x 32 mm polypropylene SUN SRI 200-268
LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone SUN SRI 500-061
Luciferase, from Photinus pyralis Sigma L9506-1MG
Pepstatin A EMD Millipore 516481-25MG
pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) EMD Chemicals 9586-1
PhosStop phosphatase inhibitor cocktail Roche 04906837001
RapiGest SF Waters 186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartridge Waters WAT023590
Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position Waters WAT200609
Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb Fisher 03-448-25
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
SpeedVac vacuum concentrator Fisher SPD111V
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Tube decapper for Micronic tubes USA Scientific 1765-4000
Tubes, 2 ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile Sarstedt 72.694.006
Urea Sigma U0631-500g
Water, LC-MS grade Fisher W6-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
  2. Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
  3. Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
  4. Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
  5. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
  6. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
  7. Wild, D. The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , 4th edn, Elsevier. (2013).
  8. Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
  9. Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
  10. Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
  11. Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
  12. Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
  13. Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
  14. Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
  15. Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
  16. Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
  17. Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
  18. Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
  19. Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
  20. Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. Peptide synthesis and applications. , 2nd edn, Humana Press Springer. (2013).
  21. Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
  22. Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
  23. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070107.pdf (2001).
  24. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration; Revision 1 (draft). Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf (2013).
  25. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
  26. Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
  27. Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
  28. Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
  29. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  30. Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
  31. Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
  32. Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
  33. Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
  34. Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
  35. Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
  36. Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
  37. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
  38. Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
  39. Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
  40. Alterman, M. A., Hunziker, P. Amino acid analysis : methods and protocols. , Humana Press. (2012).
  41. Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
  42. Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
  43. Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
  44. Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th edn, Wiley-Blackwell. (2010).
  45. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
  46. Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
  47. Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
  48. Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
  49. Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
  50. Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
  51. Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16. S5 (2012).
  52. Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
  53. Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
  54. Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
  55. Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
  56. Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. Mol Cell Proteomics. , Forthcoming.

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 102، الكمي المطلق، اللوني السائل، مطياف الكتلة، اختار رصد رد فعل ومستقرة سلسلة النظائر التخفيف، والبروتينات المستهدفة، رباعي الثلاثي
رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manes, N. P., Mann, J. M.,… More

Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J. Vis. Exp. (102), e52959, doi:10.3791/52959 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter