Introduction
Le facteur de transcription Nurr1 et ses homologues (Nur77 et NOR1) appartiennent à la sous-famille des récepteurs nucléaires 4A (NR4A) 1. Ils sont également des récepteurs orphelins parce que leurs ligands endogènes ne sont pas encore identifiés. Nurr1 a été cloné en 1992 et bien connu pour être exprimé dans le cerveau 2, son rôle essentiel pour le développement et la maintenance des neurones dopaminergiques du mésencéphale a été révélé par des études de souris knockout 3. En outre, son rôle important pour le maintien des neurones dopaminergiques du mésencéphale a récemment été démontré par une étude de knock-out conditionnel 4. En raison de ces études montrent élégantes rôles critiques de NURR1 pour les neurones dopaminergiques du mésencéphale, de nombreuses études ultérieures ont essentiellement porté sur la neurones dopaminergiques du mésencéphale et le trouble neurodégénératif liés à la dopamine, la maladie de Parkinson (PD) 5.
Notamment, Nurr1 est exprimée non seulement dans les dopamine mésencéphale (MDA) neurones, mais aussi dans les diles zones du cerveau verset 2, suggérant que cela peut avoir des rôles fonctionnels dans de nombreux domaines non-Da, ce qui est fortement soutenue par des études plus récentes montrent que Nurr1 joue des rôles importants dans diverses fonctions du cerveau. Pour des exemples, il a été montré que les activités de mémoire induisant comme l'apprentissage, ou d'autres tâches de dépendante de l'hippocampe résultat dans la régulation de l'expression Nurr1 dans l'hippocampe 6,7. En outre, abattre d'expression Nurr1 dans l'hippocampe était suffisante pour altérer la mémoire à long terme et / ou la plasticité synaptique 8-11, suggérant fortement que Nurr1 joue divers rôles dans de nombreuses zones du cerveau. Ainsi, afin de mieux comprendre l'expression de type cellule-spécifique et subcellulaire de Nurr1, il est souhaitable d'utiliser des anticorps spécifiques de NURR1, qui ne présentent pas de réactivité croisée à ses homologues Nur77 ou NOR1. Ce document décrit un protocole pré-adsorption pour générer des anticorps spécifiques NURR1 et de présenter des données supplémentaires montrant sa spécificité.
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Protocol
Remarque: La composition de toutes les solutions citées ci-dessous peut être trouvé dans le tableau Matériaux / Équipement.
1. Protéine A Colonne Antibody Purification
- Equilibrer une colonne de protéine de spin et de tous les tampons nécessaires à la température ambiante pendant 15 minutes avant de commencer la procédure.
- Diluer le sérum immun 1: 1 avec de l'IgG de la protéine A Binding Buffer. (5 ml de sérum est recommandé).
- Tapoter doucement une colonne de protéine de spin sur la paillasse pour déloger toute résine qui peut être logé dans le capuchon. Retirez le couvercle supérieur et enclenchez doucement la fermeture de fond. Placer la colonne dans un tube collecteur de 15 ml et laisser la solution de stockage se vider.
- Ajouter 5 ml de protéine A IgG Binding Buffer et laissez la solution se vider.
- Appliquer le sérum immun dilué dans la colonne et recueillir l'écoulement. Pour de meilleurs résultats, ajouter un volume d'échantillon qui contient une concentration d'anticorps inférieure à 80% d'anticorps se liant à la capacit de la colonney.
- Laver la colonne avec 15 ml de protéine A ou IgG Binding Buffer jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm est inférieur à 0,1.
- Ajouter 100 pi de tampon de neutralisation à cinq tubes de prélèvement étiquetés.
- Ajouter 5 ml de tampon d'élution d'IgG de la protéine A et la colonne recueillir fractions de 1 ml dans chacun des tubes contenant 100 pi de tampon de neutralisation.
- Mesurer l'absorption de chaque fraction à 280 nm et des fractions piscine avec une absorbance supérieure à 0,5. Gardez les fractions regroupées sur la glace jusqu'à ce que prêt pour la dialyse.
- Régénérer la colonne en ajoutant 8 ml d'IgG tampon d'élution et laissez la solution de circuler à travers la colonne.
- Rincer la colonne avec une solution Binding Protein A jusqu'à ce que les IgG éluant pH revient à 7.4.
- Stocker la colonne par addition de 5 ml de solution de stockage (azoture de sodium à 0,02% dans du PBS). Lorsque environ 3 ml restent dans la colonne, bouchon de fond et de sécuriser le capuchon supérieur. Rangez la colonne à 4 ° C.
- Déterminer la longueur oun tube de dialyse f nécessaire selon les instructions du fabricant. Utilisation de 16 mm de diamètre de tube plat utiliser 5,47 cm de longueur de tube par ml de solution à dialyse. Couper le tube et rincer avec du PBS pH 7,4 pendant 15 à 30 min.
- Pliez et coupez une extrémité du tube de dialyse, transférer l'IgG commun fractions contenant un tube de dialyse équilibrées dans PBS pH 7,4 et fermer l'autre extrémité.
- Dialyser à température ambiante contre 200 volumes de PBS, pH 7,4 pendant 2 heures.
- Changez le tampon de dialyse (PBS fraîche pH 7,4) et dialyse pendant 2 h à température ambiante.
- Changez le tampon de dialyse (PBS fraîche pH 7,4) et dialyse pendant la nuit à 4 ° C.
- Conserver la solution d'anticorps dialysée à 4 ° C jusqu'au moment de procéder à d'autres étapes de purification.
- Évaluer la concentration d'anticorps en utilisant son absorption à 280 nm et le coefficient d'absorption molaire d'anticorps à 280 nm de 210 000 M -1 cm -1 12.
2. Couplage de protéines LBD de couplage Aminolink Résine
- Préparer deux colonnes, l'une pour l'autre et Nor1 pour Nur77. Suivez le même protocole pour les deux protéines.
- Décongeler la protéine à être couplé à la résine sur de la glace. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le coefficient d'extinction molaire et son absorbance à 280 nm 12.
- En variante, en utilisant un essai de détermination de protéine tel que le dosage de l'acide bicinchoninique 13. Si la protéine est dissoute dans un tampon Dialyser ou tampon contenant une amine échange contre le tampon de couplage. Si la protéine est dans un tampon approprié (pas d'amines libres) diluer 4 fois en tampon de couplage.
- Utiliser 2 ml de résine pour 2 mg de protéine. Toutes les étapes qui suivent sont fournies à résine de 2 ml dans une colonne de 10 ml. Jusqu'à 10 mg de protéine peut être lié par 1 ml de résine (2 ml de 1: une suspension).
- Préparer une colonne de 10 ml d'une fritte en le poussant vers le bas et l'exécution du PBS pH 7,4 à travers elle. Cap til fond de la colonne et ajouter 2 ml de tampon de couplage.
- Ajouter le volume désiré de suspension (4 ml d'obtenir 2 ml de résine) à la colonne, retirez le bouchon de fond et laisser le drain de la colonne. Rincer la colonne avec un total de 6 ml (volume 3) résine-lit de tampon de couplage et de laisser la colonne se vider. Après le tampon de couplage a drainé, remplacer le bouchon de fond.
- Ajouter 2-4 ml de protéine en suspension dans de couplage de tampon à la colonne (conserver une partie aliquote de la solution de protéine afin d'évaluer l'efficacité de couplage par comparaison de la concentration en protéine de l'éluat de l'étape 2.11 en utilisant soit l'absorbance à 280 nm ou le dosage bicinchoninique) . Cap et à la fin sur l'extrémité mélanger pour avoir une solution homogène.
- Peser un 1,8 ml microtube vide et passer à la hotte. Soigneusement transférer NaCNBH3 (environ 0,05 g) dans le tube pré-pesé. Fermer le tube et peser le tube contenant NaCNBH3. Ne pas ouvrir le tube extérieur de la hotte.
- Sur la base du poids deNaCNBH3 transféré dans le tube, préparer une solution 5 M par addition de 1 M de NaOH. Le poids moléculaire du NaCNBH3 est 62,84 g donc 0,05 g est égal à (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mole) 7,96 x 10 -4 moles. Pour obtenir une solution add 5 M (7,96 x 10 -4 / 5) 159 pl de 1 M NaOH.
- Mesurer le volume total de la réaction qui a le volume de résine en considération. Ajouter 10 pi de 5 M NaCNBH3 par ml de réaction.
- Par exemple: pour un volume de réaction de 4 ml ajouter 40 pi de 5 M NaCNBH3. Pour 1 ml de résine et 3 ml de protéine ajoutée, le volume total est de 4 ml.
- Cap de la colonne et à la fin mélanger plus fin. Fixer la colonne sur un agitateur de tube et laisser la réaction continuer pendant une nuit à 4 ° C.
- Dans la matinée, porter la colonne à la hotte chimique et soigneusement enlever le bouchon comme certains gaz peut s'être formée. Égoutter la colonne dans un tube propre et économiser l'éluat pour mesurer la protéine concentration en utilisant l'absorbance à 280 nm de 12 procédé ou le dosage de l'acide bicinchoninique et le comparer avec la concentration de protéine de départ dans l'étape 2.6.
- Laver la résine avec 4 ml de tampon de couplage et de laisser le drain de la colonne.
3. Blocage sites restants
- Laver la résine avec 4 ml de tampon de trempe. Égoutter et remettre le bouchon en bas. Ajouter 2 ml de tampon de trempe et suspendre la résine.
- Évaluer le volume total de réaction en mesurant le volume de la résine et le volume de tampon de trempe, puis ajouter 10 ul de 5 M NaCNBH3 par ml de volume réactionnel.
- Mélanger délicatement à la température ambiante pendant 30 min fin sur la fin. Après 30 minutes, amener la colonne dans la hotte. Retirez délicatement le haut, puis retirez le bouchon de fond et laisser l'évacuation de la colonne dans un tube de déchets.
- Laver la colonne avec 5 volumes de résine de la solution de lavage. Surveiller les lavages de la présence de protéines résiduelles en mesurant la abso de l'éluatrbance à 280 nm. Protéines non couplées sont lavés par la forte concentration en sel.
- Laver la résine avec 6 ml de PBS dégazé pH 7,4 contenant de l'azoture de sodium à 0,02%. Garder la colonne à 4 ° C jusqu'à utilisation.
4. Purification de l'anticorps spécifiques NURR1
- Rincer la colonne couplé Nur77 LBD avec 10 ml de PBS pH 7,4 et laisser l'évacuation de la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne couplé Nur77 LBD drainé dans un nouveau tube de 15 ml de collecte.
- Ajouter 5 ml de la protéine A des anticorps anti-NURR1 purifiés, plafonner la colonne et le placer sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 heure. Retirez les capuchons supérieurs et inférieurs et de recueillir l'écoulement à travers. Mettez de côté sur la glace jusqu'à ce que prêt à ajouter à la colonne couplé Nor1 LBD.
- Rincer la colonne couplé Nor1 LBD avec 10 ml de PBS pH 7,4 et laisser l'évacuation de la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne Nor1 LBD couplé à un tube de 15 ml de collecte.
- Ajouter le flux à travers du coup Nur77 LBDcolonne conduite, plafonner la colonne et le placer sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 heure. Retirez les capuchons supérieurs et inférieurs et de recueillir l'écoulement à travers.
- Mesurer la concentration d'anticorps en mesurant l'absorbance à 280 nm.
Analyse des purifiée d'anticorps anti-Nurr1 à base d'ELISA 5.
- Ajouter 100 ul de protéine (2,5 pg / ml) dans les puits d'une plaque à 96 puits. Si l'essai 3 protéines différentes, ajouter 100 ul de protéines 1 à godets A1 à H4, 100 pi de la protéine 2, à godets A5 à H8 et 100 pi de la protéine 3 à puits A9 à H12. Couvrir la plaque et incuber une nuit à 4 ° C.
- Laver deux fois les puits revêtus avec 300 pi par puits de PBS pH 7,4 et ajouter 300 ul de tampon de blocage ELISA pour les antigènes des puits revêtus entiers et incuber 2 heures à température ambiante.
- Bien que la plaque bloque préparer une dilution de départ désirée de l'anticorps purifié anti-Nurr1 (allant de 10 à 100 pg / ml) dans du tampon de blocage ELISA.
- Après 2 h de blocage, remplacer le tampon de bloc ELISA avec 100 pi de tampon frais de bloc ELISA à tous les puits.
- Ajouter 100 ul d'anticorps anti-Nurr1 purifié dilué dans tous les puits dans la ligne A. diluer en série les anticorps en transférant 100 ul de solution de la ligne A dans les puits de la rangée B suivie par le transfert de 100 pi de solution de la ligne B à la ligne C continue jusqu'à la ligne G. Après le mélange des solutions dans les puits dans la rangée G jeter le supplément de 100 pi. Wells dans la rangée H ne reçoivent les premiers 100 pi de tampon de blocage. Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
- Laver la plaque trois (3) fois avec 300 pi par puits de 0,05% de Tween 20 dans du PBS pH 7,4 et épongez la plaque pour éliminer le tampon de lavage en excès.
- Ajouter 100 pi de la peroxydase de raifort (HRP) conjugué de chèvre anti-IgG de lapin dilué dans du tampon de bloc ELISA (1: 8000 dilution; la gamme typique est de 1: 5000 à 1: 25.000). Incuber à température ambiante pendant 1 heure.
- Laver les e plaqueree (3) fois comme décrit en 5.6. Rincez tous les puits en les remplissant avec 300 pi d'eau déminéralisée. Éponger l'excès d'eau en inversant la plaque sur du papier absorbant.
- Ajouter 100 ul de 3, 3 ', 5, 5' tétraméthylbenzidine (réchauffé à température ambiante) à tous les puits et incuber 15 à 30 min à l'obscurité à température ambiante.
- Arrêter la réaction en ajoutant 50 ul de 2 NH 2 SO 4.
- Lire l'absorbance à 450 nm soustraction du fond à 650 nm.
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Representative Results
Une comparaison de colonne de protéine A purifiée d'anticorps spécifiques de NURR1 avec la protéine A des anticorps purifiés anti-NURR1 suivis par le passage à travers Nur77 LBD et Nor1 LBD colonnes est illustrée sur la figure 1. Comme on peut le constater, la protéine A purifiée anticorps Nurr1 montré une forte liaison à Nurr1 LBD. Toutefois, il a également montré une liaison significative à Nur77 LBD et Nor1 LBD. Lorsque la protéine d'anticorps A purifié NURR1 ont été encore purifiés contre Nur77 LBD et Nor1 LBD, l'affinité finale purifiés des anticorps NURR1 ont présenté une liaison spécifique à Nurr1 LBD avec indétectable liaison à Nur77 LBD ou Nor1 LBD, ce qui démontre que la réactivité croisée de Nur77 et Nor1 était complètement enlevé.
Cette spécificité a également été démontrée par une analyse Western blot d'extraits de cellules CHO transfectées avec des vecteurs d'expression portant longueur Nurr1, Nor1 ou Nur77 fusionnés à la protéine MYC marquage (Figure 2). Comme prévu, ANTIB anti-mycOdies révélé que chaque protéine pleine longueur a été exprimée lors de son poids moléculaire attendu. En accord avec les résultats ELISA, un anticorps spécifique purifié Nurr1 Protein robuste détecté pleine longueur Nurr1 mais aussi détecté Nor1 et Nur77 quoique moins efficacement. En revanche, l'anticorps entièrement purifiée Nurr1 ne présente aucune réactivité croisée détectable à Nor1 et Nur77 par ELISA ou analyse par transfert de Western.
Enfin, l'anticorps entièrement purifié Nurr1 a été utilisé pour l'analyse immunohistochimique des neurones MDA. Il est bien documenté que Nurr1, mais pas ses proches homologues NOR1 et Nur77, est exprimée en évidence des taux de protéines 14,15 rongeurs et neurones humains MDA à la fois l'ARNm et. L'utilisation de l'anticorps purifié Nurr1 pleinement confirmé que Nurr1 est presque exclusivement exprimé dans les neurones du noyau de MDA dans le domaine substance noire (figure 3).
Figure 1: comparaison ELISA de réactivité croisée des anticorps anti-NURR1 avant et après purification par passage à travers Nur77 et NOR1 LBD colonnes couplées Protéine A d'anticorps anti-NURR1 purifiés (0,156 ug / ml) (a) ou la protéine A purifié, puis. Chromatographie sur des colonnes et Nor1 Nur77 LBD couplés des anticorps anti-NURR1 (0,156 ug / ml) (b) ont été ajoutés à des puits d'une plaque à 96 puits revêtues de 100 ul de 2,5 ug / ml de chacune des Nurr1 LBD, ou LBD Nor1 Nur77 LBD. Le test ELISA a été effectuée comme décrit dans la section des méthodes.
Figure 2: Détection spécifique de pleine longueur Nurr1 exprimé dans des cellules CHO en utilisant l'anticorps spécifique à l'Nurr1 entièrement purifié sur toute la longueur Nurr1, Nor1 protéines, et ont été exprimés en tant que Nur77 myc marqués.des protéines de fusion dans des cellules CHO et détectées par des anticorps spécifiques Myc (a), la protéine A-anticorps purifié Nurr1 (b), et l'anticorps Nurr1 complètement purifié (C). Les anticorps anti-actine utilisés pour le contrôle des protéines de chargement (D). Chaque ADN étiquetée Myc-pleine longueur (poids moléculaire de 65, 66 et 69 kDa pour Nurr1, Nur77, Nor1, respectivement) ont été transfectées de manière transitoire dans des cellules CHO et la même quantité d'extraits cellulaires ont été chargés dans chaque voie. Piste 1: contrôle négatif constitué de cellules CHO extraits transfectées avec un vecteur vide; piste 2: Myc-Nurr1; piste 3: Myc-Nur77; piste 4: Myc-Nor1.
Figure 3:. L'anticorps spécifique Nurr1 entièrement purifiée détecte spécifiquement les neurones dopaminergiques tyrosine-hydroxylase positif neurones dopaminergiques Mésencéphale dans la substance noire sont positives pour Nurr1, comme examined par immunohistochimie en utilisant des anticorps spécifiques à la NURR1 entièrement purifiés. Notamment, Nurr1 a été localisé dans le noyau des neurones MDA. TH (tyrosine hydroxylase). Barre d'échelle = 100 um. La barre d'échelle dans la case blanche fusion est de 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le succès de ce protocole repose sur la disponibilité de protéines pures pour la caractérisation des anticorps dirigés contre un membre spécifique de la famille de la protéine d'intérêt. Il n'y a aucune nécessité de purifier les anticorps à l'aide de protéine A / G jusqu'à ce qu'il soit clairement établi qu'il existe des réactivités croisées significatives par ELISA et Western blot.
Comme il est indiqué dans le texte, il est important d'éviter la suspension de la protéine (s) d'être réticulé à la colonne dans un tampon contenant une amine, tels que le Tris ou la glycine. De plus, la concentration optimale de protéine utilisée pour la réticulation doit être déterminée de manière empirique. Trop de protéines sur la colonne peut entraîner un empêchement stérique tandis que trop peu réduirait l'efficacité de l'adsorption. Par conséquent, il est une bonne idée de tester les concentrations en protéines allant de 2 à 10 mg / ml et d'évaluer la qualité des anticorps résultants.
Plusieurs facteurs doivent être pris en considération lors èmeest la technique ne parvient pas à produire des anticorps hautement spécifiques. Ceux-ci comprennent: l'efficacité de reticulation, de la perte de domaine immunoréactif, et la dénaturation de la protéine réticulée. Comme indiqué dans le protocole, le suivi de réticulation efficacité permet de déterminer que la protéine trop ou trop peu est immobilisée sur la colonne. Si réticulation en utilisant des amines réactifs est soupçonné de détruire domaine (s) immunoréactif, l'immobilisation par le groupe carboxylique ou par les hydrates de carbone doivent être considérés.
Il est important de surveiller l'efficacité de la procédure pour obtenir constamment des anticorps hautement spécifiques. Aux fins de régénération, les colonnes doivent être dépouillés de les anticorps à réaction croisée liés à leur utilisation des conditions difficiles (pH élevé ou faible). Cela provoque un pourcentage de plus en plus élevé de protéines réticulées à être effectivement dénaturée, ce qui réduit les performances de la colonne.
L'addition d'agents de blocage en ELISA et Western blot est couramment utilisé avec un bon niveau de réussite. Cependant, l'approche décrite dans cette vidéo augmente la probabilité de réussite et réduit la nécessité de maintenir de grandes quantités de protéines cross-réactifs sur la main. Comme les réactifs et les méthodes pour immobiliser des protéines à une chromatographie médias se tiennent à l'amélioration, cette approche contribuera à l'identification des cellules circulantes transformées anticorps spécifiques.
Cette approche est limitée par la disponibilité des protéines pures. Une autre limitation de ce protocole est la dépendance sur un pliage approprié lors de l'utilisation des domaines protéiques. Si les domaines de protéines ne se replient pas comme dans la protéine entière, la stratégie de pré-adsorption peut ne pas donner des anticorps qui peuvent facilement identifier le membre de la protéine d'intérêt lors de l'analyse d'extraits de cellules ou de tissus.
De nombreuses protéines d'intérêt appartiennent au (sous-) familles de protéines avec une grande homologie de séquence amino-acide. Caractérisation fonctionnelle et iDENtification de la distribution des protéines dépendent souvent de la disponibilité d'anticorps spécifiques dirigés contre chacun des membres de la famille. Les homologies d'acides aminés élevée entre les membres de protéines de la même famille contribuent aux difficultés dans la production d'anticorps hautement spécifiques. L'utilisation de ces anticorps à réaction croisée conduisent souvent à des résultats contradictoires.
Un tel exemple est la Nurr1 du récepteur nucléaire orphelin qui appartient à la sous-famille des récepteurs nucléaires NR4A, avec Nur77 et Nor1. Depuis ces trois facteurs partagent un degré élevé d'homologie des acides aminés, des anticorps contre chaque facteur montrent réactivités croisées importantes, qui entravent l'analyse précise de chaque facteur.
L'utilisation de ces éléments de NR4A à titre d'exemple, il a été possible de générer des anticorps hautement spécifiques NURR1 libre de réactivités à Nor1 ou Nur77. Étant donné que les parts LBD moins une homologie de domaines de liaison à l'ADN, le LBD de chaque protéine a été exprimée et purifiée et ensuite utilisé pour improve la spécificité des anticorps anti-Nurr1. Initialement, les anticorps contre LBD de Nurr1 présentaient des niveaux modestes, mais significatifs de réactivité croisée aux autres protéines, comme examiné par ELISA et analyse Western blot. Cependant, lorsque la protéine d'anticorps A purifié NURR1 ont été encore purifiés par pré-adsorption sur des domaines de LBD réactivité croisée de Nur77 et Nor1, l'anticorps Nurr1 résultant ne montre aucune réactivité croisée, comme examiné par buvardage de Western et ELISA analyse de évidence détecté Nurr1 exprimant neurones dopaminergiques dans les domaines du mésencéphale. Les données Western blot et ELISA analyses près d'accord avec l'autre, ce qui indique que ces analyses peuvent être complémentaires et se soutenir mutuellement.
L'ensemble de cette stratégie de purification de l'anticorps sera extrêmement utile dans la génération d'un anticorps spécifique en éliminant la réactivité croisée pour les membres de protéines homologues.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
