Introduction
Den transkriptionsfaktor Nurr1 och dess homologer (Nur77 och NOR1) tillhör den nukleära receptorer underfamiljen 4A (NR4A) 1. De är också föräldralösa receptorer eftersom deras endogena ligander inte är identifierade ännu. Nurr1 klonades först 1992 och även känd för att uttryckas i hjärnan 2, var dess avgörande roll för utveckling och underhåll av mitthjärnan dopaminneuroner avslöjas genom knockout mus studier 3. Dessutom var dess viktiga roll för upprätthållandet av mitthjäman dopaminneuroner nyligen visats av en villkorlig knockout studie 4. På grund av dessa eleganta studier som visar Nurr1 kritiska roller för mitthjärnan dopaminneuroner har många senare studier i hög grad inriktad på mellanhjärnan dopaminneuroner och dopaminrelaterade neurodegenerativ sjukdom, Parkinsons sjukdom (PD) 5.
Noterbart är Nurr1 uttrycks inte bara i de mitthjärnan dopamin (MDA) neuroner, men också i divers hjärnområden 2, vilket tyder på att det kan ha funktionella roller i många icke-DA områden, som starkt stöds av flera nya studier som visar att Nurr1 spelar viktiga roller i olika hjärnfunktioner. För exempel, visade det sig att minnesframkallande aktiviteter såsom lärande, eller andra hippocampus beroende uppgifter resulterar i uppreglering av Nurr1 uttryck i hippocampus 6,7. Dessutom, slå ner av Nurr1-expression i hippocampus var tillräcklig för att försämra långtidsminnet och / eller synaptisk plasticitet 8-11, vilket starkt antyder att Nurr1 spelar olika roller i många områden i hjärnan. Således, för att ytterligare förstå den celltyp-specifika och subcellulär expression av Nurr1, är det önskvärt att använda Nurr1 specifika antikroppar, som inte uppvisar någon korsreaktivitet med dess homologer Nur77 eller NOR1. Detta dokument beskriver en pre-adsorption protokoll för att generera Nurr1 specifika antikroppar och presentera ytterligare uppgifter som visar dess specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Sammansättningen av alla lösningar som anges nedan kan hittas i Material / utrustning Tabell.
1. Protein A Kolumn antikroppsrening
- Jämvikta ett protein En spinnkolonn och alla nödvändiga buffertar till rumstemperatur under 15 minuter före start av förfarandet.
- Späd immunserumet 1: 1 med protein A-IgG-bindningsbuffert. (5 ml serum rekommenderas).
- Knacka försiktigt ett protein A spinnkolonn på bänken toppen att få bort kåda som kan lämnas in i den gemensamma jordbrukspolitiken. Ta bort övre locket och försiktigt bryt av bottenförslutningen. Placera kolonnen i en 15 ml uppsamlingsrör och tillåta lagring lösningen rinna.
- Tillsätt 5 ml protein A-IgG-bindningsbuffert och låt lösningen rinna.
- Applicera utspätt immunserum till kolonnen och samla genomströmning. För bästa resultat, lägga till en provvolym som innehåller en koncentration av antikroppar är mindre än 80% av kolonnantikroppsbindande capacity.
- Tvätta kolonnen med 15 ml protein A-IgG Binding Buffer eller tills absorbansen vid 280 nm är lägre än 0,1.
- Tillsätt 100 pl neutraliseringsbuffert till fem märkta uppsamlingsrör.
- Tillsätt 5 ml av IgG-elueringsbuffert till Protein A-kolonn och samla en ml fraktioner i vart och ett av rören innehållande de 100 pl av neutraliseringsbuffert.
- Mät absorbansen hos varje fraktion vid 280 nm och pool fraktioner med en absorbans större än 0,5. Håll de sammanslagna fraktionerna på is tills redo för dialys.
- Regenerera kolonnen genom tillsats av 8 ml av IgG-elueringsbuffert och tillåta lösningen att strömma genom kolonnen.
- Skölj kolonnen med protein A IgG-bindande lösning tills elueringsmedel pH återgår till 7,4.
- Förvara kolonnen genom tillsats av 5 ml lagringslösning (0,02% natriumazid i PBS). När approximativt 3 ml kvar i kolonnen, locket botten och fäst topplatta. Förvara kolonnen vid 4 ° C.
- Bestäm längden of dialysrör behövs enligt tillverkarens anvisningar. Använda slangen platt diametern 16 mm använda 5,47 cm av rörlängden per ml lösning som skall dialyseras. Skär slangen och skölj med PBS pH 7,4 i 15 till 30 minuter.
- Vik och klämma en ände av dialysslangen, överföra den poolade IgG fraktionerna till dialysrör jämviktad i PBS pH 7,4 och stänga den andra änden.
- Dialysera vid rumstemperatur mot 200 volymer av PBS, pH 7,4 under 2 timmar.
- Ändra dialysbuffert (färsk PBS pH 7,4) och dialysera under ytterligare 2 h vid rumstemperatur.
- Ändra dialysbuffert (färsk PBS pH 7,4) och dialysera över natten vid 4 ° C.
- Håll den dialyserade antikropplösning vid 4 ° C tills den ska fortsätta med ytterligare reningssteg.
- Bedöm antikroppskoncentrationen med hjälp av dess absorbans vid 280 nm och den molära absorptionskoefficienten av antikroppar vid 280 nm av 210 tusen M -1 cm -1 12.
2. Koppling av LBD proteiner att Aminolink Koppling Resin
- Bered två kolumner, en för NOR1 och den andra för Nur77. Följ samma protokoll för båda proteinerna.
- Tina det protein som skall kopplas till hartset på is. Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av dess molära extinktionskoefficienten och dess absorbans vid 280 nm 12.
- Alternativt kan du använda en proteinbestämning analys såsom bicinkoninsyra analysen 13. Om proteinet upplöses i en aminhaltig buffert Dialysera eller buffertutbyte mot kopplingsbuffert. Om proteinet är i en lämplig buffert (inga fria aminer) späda ut det 4-faldigt i kopplingsbuffert.
- Använd 2 ml harts för 2 mg protein. Alla steg som följer är för 2 ml harts i en 10 ml kolonn. Upp till 10 mg protein kan kopplas per 1 ml harts (2 ml av en: en uppslamning).
- Bered en 10 ml kolonn genom att trycka en fritta till botten och kör PBS pH 7,4 genom den. Cap than botten av kolonnen och tillsätt 2 ml kopplingsbuffert.
- Lägg den önskade volymen av uppslamning (4 ml för att erhålla 2 ml harts) och kolonnen, bort bottendelen och låt kolonnen rinna. Skölj kolonnen med totalt 6 ml (3 harts-bäddvolym) av kopplingsbuffert och låt kolonnen rinna. Efter kopplingsbuffert runnit, byt ut bottenplatta.
- Lägg 2-4 ml av protein suspenderades i kopplingsbuffert till kolonnen (hålla en alikvot av proteinlösningen för att bedöma kopplingseffektiviteten genom att jämföra proteinkoncentration av eluatet i steg 2,11 med användning av antingen absorbansen vid 280 nm eller den bicinchoninic analys) . Cap och blanda ände över ände för att ha en homogen lösning.
- Väg en tom 1,8 ml mikrocentrifugrör och flytta till dragskåp. Försiktigt överföra NaCNBH3 (ca 0,05 g) i det på förhand vägda rör. Tillslut röret och väga rör innehållande NaCNBH3. Öppna inte röret utanför huven.
- Baserat på vikten avNaCNBHs 3 överförs in i röret, gör en 5 M lösning genom att tillsätta 1 M NaOH. Molekylvikten för NaCNBHs 3 är 62,84 g därför 0,05 g är lika med (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mol) 7,96 x 10 -4 mol. För att göra en 5 M lösning add (7,96 x 10 -4 / 5) 159 pl 1 M NaOH.
- Mät reaktionen totala volym tar hartsvolym beaktas. Lägg 10 pl av 5 M NaCNBH3 per ml reaktion.
- Till exempel: för en 4 ml reaktionsvolym lägga 40 pl 5 M NaCNBH3. För en ml harts och 3 ml tillsatt protein, är den totala volymen 4 ml.
- Förslut kolonnen och blanda ände över ände. Fäst kolonnen på en tub rotator och låt reaktionen fortsätta över natten vid 4 ° C.
- På morgonen, ta kolumnen till kemisk huva och försiktigt bort locket som en del gas kan ha bildats. Töm kolonnen i ett rent rör och spara eluatet för att mäta protein concentra med användning av absorbansen vid 280 nm metod 12 eller bicinkoninsyra analysen och jämföra den med startproteinkoncentrationen i steg 2.6.
- Tvätta hartset med 4 ml kopplingsbuffert och låt kolonnen rinna.
3. Blockering Återstående webbplatser
- Tvätta hartset med 4 ml av släckning buffert. Töm och byt den undre lock. Tillsätt 2 ml av släckning buffert och avbryta hartset.
- Bedöm den totala reaktionsvolymen genom att mäta hartsvolym och släckningsbuffertvolym tillsätt sedan 10 pl av 5 M NaCNBH3 per ml reaktionsvolym.
- Blanda försiktigt vid rumstemperatur under 30 minuter end-over-end. Efter 30 minuter, bringa kolonnen i dragskåpet. Ta försiktigt bort den övre och sedan ta bort den nedre locket och låt kolonnen rinna in i en avfallsröret.
- Tvätta kolonnen med 5 hartsvolymer av tvättlösning. Övervaka tvättar för förekomst av rest proteiner genom att mäta eluatet är absorbance vid 280 nm. Okopplade proteinerna tvättas ut av den höga saltkoncentrationen.
- Tvätta hartset med 6 ml avgasad PBS, pH 7,4 innehållande 0,02% natriumazid. Håll kolonnen vid 4 ° C tills de behövdes.
4. Rening av Nurr1 specifika antikroppar
- Skölj Nur77 LBD kopplade kolonn med 10 ml PBS pH 7,4 och låt kolumnen avloppet. Cap botten av kolonnen och placera den avrunna Nur77 LBD kopplad kolonn i ett nytt 15 ml uppsamlingsrör.
- Tillsätt 5 ml protein A-renade anti Nurr1 antikroppar, cap kolonnen och placera på en rotator vid 4 ° C under 1 timme. Ta bort de övre och undre lock och samla flödet genom. Ställ åt sidan på is tills redo att lägga till NOR1 LBD kopplade kolumnen.
- Skölj NOR1 LBD kopplade kolonn med 10 ml PBS pH 7,4 och låt kolumnen avloppet. Cap botten av kolonnen och placera NOR1 LBD kopplad kolonn i en 15 ml uppsamlingsrör.
- Lägg flödet genom från Nur77 LBD stötenledde kolonn, cap kolonnen och placera på en rotator vid 4 ° C under 1 timme. Ta bort de övre och undre lock och samla flödet genom.
- Mäta koncentrationen antikroppen genom mätning av absorbansen vid 280 nm.
5. ELISA-baserad analys av renat anti-Nurr1 antikropp
- Lägg 100 | il protein (2,5 jig / ml) till brunnarna i en 96-brunnsplatta. Om testning tre olika proteiner, tillsätt 100 | il av protein 1 till brunnar A1 till H4, 100 pl av protein 2, till brunnarna A5 till H8 och 100 | il av protein 3 till brunnarna A9 till H12. Täck plattan och inkubera över natten vid 4 ° C.
- Tvätta de belagda brunnarna två gånger med 300 | il per brunn av PBS pH 7,4 och tillsätt 300 | il av ELISA-blockeringsbuffert till hela antigenbelagda brunnarna och inkubera två timmar vid rumstemperatur.
- Medan plattan blockerar framställa en önskad startspädning av renat anti-Nurr1-antikropp (från 10 till 100 pg / ml) i ELISA blockeringsbuffert.
- Efter 2 timmar av blockering, ersätta ELISA blockbuffert med 100 pl av färskt ELISA blockeringsbuffert till alla brunnar.
- Tillsätt 100 ni utspätt renad anti-Nurr1 antikropp till alla brunnar i rad A. Seriellt utspädd antikropparna genom att överföra 100 fil lösning från rad A till brunnarna i rad B följt av överföring av 100 | il av lösning från rad B till rad C fortsätter ner till rad G. Efter blandning av lösningar i brunnar i rad G kasta de extra 100 pl. Wells i rad H endast ta emot de första 100 pl blockeringsbuffert. Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme.
- Tvätta plattan tre (3) gånger med 300 pl per brunn av 0,05% Tween 20 i PBS, pH 7,4 och blot plattan för att avlägsna överskott av tvättbuffert.
- Lägg 100 | il pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerad get anti-kanin IgG utspätt i ELISA-blockbuffert (1: 8000 utspädning; det typiska området är från 1: 5000 till 1: 25.000). Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme.
- Tvätta plattan: teree (3) gånger, såsom beskrivs i 5.6. Skölj alla brunnarna genom att fylla dem med 300 | il avjoniserat vatten. Blot överflödigt vatten genom att vända plattan på absorberande papper.
- Lägg 100 pl av 3, 3 ', 5, 5' tetrametylbenzidin (värmdes till rumstemperatur) till alla brunnar och inkubera 15 till 30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 | il av 2 NH 2 SO 4.
- Läs absorbans vid 450 nm subtrahera bakgrunden vid 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En jämförelse av protein A-kolonn renades NURR1 specifika antikroppar med protein A renade anti Nurr1 antikroppar följt av passage genom Nur77 LBD och NOR1 LBD kolumner visas i fig 1. Såsom kan ses, protein A-renad Nurr1 antikropp uppvisade en stark bindning till Nurr1 LBD. Men visade det också signifikant bindning till Nur77 LBD och NOR1 LBD. När protein A-renat Nurr1 antikropparna renades ytterligare mot Nur77 LBD och NOR1 LBD, den slutliga affinitetsrenat Nurr1 antikroppar uppvisade specifik bindning till Nurr1 LBD med odetekterbar bindning till Nur77 LBD eller NOR1 LBD, vilket visar att dess korsreaktivitet med Nur77 och NOR1 var bort helt.
Denna specificitet visades ytterligare genom Western blot-analys av extrakt från CHO-cell transfekterad med expressionsvektorer som bär fullängds Nurr1, NOR1, eller Nur77 fuserad till MYC tagging proteinet (Figur 2). Som förväntat, anti-myc-AntibOdies avslöjade att varje fullängdsproteinet uttrycktes vid dess förväntade molekylvikten. I samförstånd med ELISA resultat, protein A-renat Nurr1 specifik antikropp kraftigt upptäckt fullängds Nurr1 men också upptäckt NOR1 och Nur77 men mindre effektivt. Däremot gjorde helt renade Nurr1 antikropp inte uppvisar någon detekterbar korsreaktivitet till NOR1 och Nur77 genom ELISA eller Western blot-analyser.
Slutligen tillsattes den fullständigt renad Nurr1 antikropp användes för immunhistokemisk analys av mda neuroner. Det är väl dokumenterat att Nurr1, men inte dess nära homologer NOR1 och Nur77 är tydligt uttryckt i gnagare och mänskliga MDA neuroner både mRNA och proteinnivåer 14,15. Användningen av den fullständigt renad Nurr1 antikropp bekräftade att Nurr1 nästan uteslutande uttrycks i kärnan hos mda neuroner i substantia nigra området (Figur 3).
Figur 1: ELISA-jämförelse av korsreaktiviteter av anti-Nurr1-antikroppar före och efter rening genom passage genom Nur77 och NOR1 LBD kopplade kolonner Protein A-renade anti Nurr1 antikroppar (0,156 | ig / ml) (a) eller protein A renat följt av. kromatografi på NOR1 och Nur77 LBD-kopplade kolonner anti Nurr1 antikroppar (0,156 ^ g / ml) (b) sattes till brunnarna i 96-brunnsplatta belagd med 100 | il av 2,5 | ig / ml av antingen Nurr1 LBD NOR1 LBD eller Nur77 LBD. ELISA genomfördes såsom beskrivits i metoddelen.
Figur 2: Specifik detektion av fullängds Nurr1 uttryckt i CHO-celler genom att använda det fullt renade Nurr1-specifik antikropp Hellång Nurr1, NOR1 och Nur77 Proteinerna uttrycktes som myc taggade.fusionsproteiner i CHO-celler och detekteras genom Myc specifika antikroppar (a), protein A-renad Nurr1 antikropp (b), och fullt renad Nurr1 antikropp (c). Anti-aktin-antikroppar användes för proteinladdning kontroll (D). Varje Myc-tagged fullängds-DNA (molekylvikt av 65, 66, och 69 kDa för Nurr1, Nur77, NOR1, respektive) transfekterades transient i CHO-celler och samma mängd av cellextrakt laddades i varje spår. Spår 1: negativ kontroll bestående av CHO-celler extrakt transfekterade med en tom vektor; bana 2: Myc-Nurr1; bana 3: Myc-Nur77; bana 4: Myc-NOR1.
Figur 3:. Den helt renade Nurr1-specifik antikropp detekterar specifikt tyrosin-hydroxylas-positiva dopaminneuroner mitthjärnan dopaminneuroner i substantia nigra är positiva för Nurr1, som examined genom immunhistokemi med användning av de fullständigt renade Nurr1 specifika antikroppar. Notably var Nurr1 lokaliserad i kärnan hos mda neuroner. TH (tyrosinhydroxylas). Skalstreck = 100 | am. Skala bar i vit ruta merge är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgången för detta protokoll bygger på tillgången på rena proteiner för karakterisering av antikroppar mot en specifik medlem av proteinfamiljen av intresse. Det finns inget behov att rena antikropparna med användning av protein A / G tills det inte tydligt framgår att det finns betydande korsreaktiviteter med ELISA och Western blotting.
Såsom anges i texten, är det viktigt att undvika att avbryta protein (er) för att vara tvärbunden till kolonnen i en amininnehållande buffert, såsom Tris eller glycin. Vidare den optimala proteinkoncentrationen som används för tvärbindning måste bestämmas empiriskt. För mycket protein på kolonnen kan resultera i steriskt hinder medan för låg skulle minska effektiviteten i adsorptionen. Därför är det en god idé att testa protein koncentrationer som sträcker sig från 2 till 10 mg / ml och att bedöma kvaliteten på de resulterande antikropparna.
Flera faktorer måste beaktas när thär tekniken inte ge mycket specifika antikroppar. Dessa inkluderar: tvärbindning effektivitet, förlust av immunreaktiv domän, och tvärbunden proteindenaturering. Såsom anges i protokollet, övervakning tvärbindningseffektivitet tillåter bestämningen att för mycket eller för lite protein är immobiliserat på kolonnen. Om man misstänker att förstöra immunreaktiv domän (er), immobilisering via karboxylgruppen eller genom kolhydrater tvärbindning med användning av reaktiva aminer bör övervägas.
Det är viktigt att övervaka effektiviteten i förfarandet att konsekvent ge mycket specifika antikroppar. För regenereringsändamål, måste kolonnerna skalas av de korsreaktiva antikroppar bundna till dem med hjälp av svåra förhållanden (hög eller låg pH). Detta orsakar en allt högre procentandel av tvärbundna proteiner som skall effektivt denatureras, vilket minskar kolonnprestanda.
Tillsatsen av blockerande medel i ELISA och Western blotting används ofta med en rättvis nivå av framgång. Emellertid ökar den metod som beskrivs i den här videon sannolikheten för framgång och minskar behovet av underhåll av stora mängder av de korsreaktiva proteiner till hands. Som reagens och metoder för att immobilisera proteiner kromatografi media fortsätta att förbättra, kommer denna strategi att bidra till identifiering av cirkulerande transformerade celler specifika antikroppar.
Detta tillvägagångssätt begränsas av tillgängligheten av rena proteiner. En annan begränsning av detta protokoll är beroendet av korrekt vikning när du använder proteindomäner. Om proteindomäner inte vika som i hela proteinet, kan pre-adsorption strategin inte ge antikroppar som lätt kan identifiera protein-medlem av intresse vid analys av cell- eller vävnadsextrakt.
Många proteiner intresse tillhör (under) familjer av proteiner med hög aminosyra sekvenshomologier. Funktionell karakterisering och identifiering av fördelningen av proteiner är ofta beroende av tillgängligheten av specifika antikroppar mot varje familjemedlem. Den höga aminosyrahomologi mellan protein medlemmar i samma familj bidrar till svårigheterna i att generera mycket specifika antikroppar. Med hjälp av dessa korsreaktiva antikroppar ofta leder till motstridiga resultat.
Ett sådant exempel är föräldralös nukleära receptorer Nurr1 som tillhör NR4A familj av nukleära receptorer, tillsammans med Nur77 och NOR1. Eftersom dessa tre faktorer delar en hög grad av aminosyrahomologi, antikroppar mot varje faktor visar signifikanta tvär reaktiviteter som hindrar exakt analys av varje faktor.
Med hjälp av dessa NR4A medlemmar som ett exempel, var det möjligt att generera mycket specifika Nurr1 antikroppar fria från reaktivitet till NOR1 eller Nur77. Eftersom LBD dela mindre homologi än de DNA-bindande domänerna, var LBD hos varje protein uttrycktes och renades och användes sedan för att improve specificiteten hos anti-Nurr1 antikroppar. Inledningsvis antikroppar mot Nurr1 s LBD uppvisade måttliga men signifikanta nivåer av korsreaktivitet till andra proteiner, som undersöktes med ELISA och Western blot-analyser. Emellertid, när protein A-renat Nurr1 antikropparna renades ytterligare genom pre-adsorption mot korsreaktiva LBD domäner av Nur77 och NOR1, den erhållna Nurr1 antikropp visade inte någon korsreaktivitet, som undersöktes med Western blöt och ELISA-analyser av framträdande detekteras Nurr1 uttryckande DA nervceller i mellanhjärnan områden. Western blot uppgifter och ELISA analyser nära överens med varandra, vilket tyder på att dessa analyser kan komplettera och stödja varandra.
Sammantaget kommer denna antikropp reningsstrategi vara extremt användbara för att generera en specifik antikropp genom att eliminera korsreaktivitet till homologa proteinmedlemmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Purified Ligand Binding Domain from Nurr1, Nor 1 and Nur77 | Column Storage solution | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| Protein A spin column | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| 96 well Flate-bottom plates, High Flange, 330 μl | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10% Normal Goat Serum | KPL | 50-675-69 | |
| Milk Diluent/ Blocking Concentrate | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| Horse Radish Peroxidase conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine | Thermo Scientific | 34028 | |
| 2N H2SO4 | Macron Fine Chemicals | H381 05 | |
| Protein A IgG Binding Buffer | Thermo Scientific | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| Column Storage solution | Phosphate Buffered Saline containing 0.02% sodium azide | ||
| Spectra/Por 7 pre-treated dialysis tubing | Spectrum Labs | 132128 | |
| 10 ml Disposable columns | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M sodium phosphate, 0.05% NaN3, pH 7.0 | ||
| Quenching buffer | 1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH 7.4 |
||
| Wash Solution | 1M NaCl, 0.05% NaN3 | ||
| ELISA Blocking buffer | 1% Normal Horse serum (NHS), 1% Normal Goat Serum (NGS) in 1X KPL milk diluent | ||
| Storage Solution | PBS pH 7.4 containing 0.02% sodium azide | ||
| Micropipettes: 10 μl; 20 μl; 200 μl; 1000 μl |
References
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).
- Zetterström, R. H., et al. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science. 276 (5310), 248-250 (1997).
- Kadkhodaei, B., et al. Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons. J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).
- Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).
- Peña de Ortiz, S. Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning. Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).
- Vecsey, C. G., et al. Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation. J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).
- Colón-Cesario, W. I., et al. Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory. Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).
- McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).
- Hawk, J. D., et al. NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors. J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).
- Bridi, M. S., Abel, T. The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity. Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
- Smith, P. K., et al.
- Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system. Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).
- Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization. Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).
