Introduction
공동 감염, 복수의 동시 감염 감염은 자연 환경의 규범이다. 공동 감염 질환의 병리에 각각 감염의 임상 적 관리에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 공동 감염, 백신 및 약물 효능뿐만 아니라 진단 테스트의 맥락에서 부정적인 영향을받을 수있다 (1에서 검토). 그러나, 그것의 중요성에도 불구하고, 병원균 연구의 대부분은 하나의 감염을 고려한다.
말라리아 및 HIV-1 (HIV)는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 원인을 선도하고 있습니다. 10 - 말라리아와 에이즈 endemicity 분야 공동 감염의 위험에 수백만의 사람들을 가하고 그 결과 더 심한 임상 질환 2의 위험, 넓은 지리적 중복을 공유 할 수 있습니다. 두 질환에 부정적인 상호 작용합니다. HIV 감염자 높은 HIV 바이러스 부하와 CD4 + T 세포 수가 일시적으로 감소하면서, 말라리아 감염 중에 알 수말라리아 기생충 부담과 임상 중증 말라리아의 위험이 공동 감염된 개인 2,3,5,7,8,10에서 더 높다. 에이즈 말라리아의 심각성을 증가하는 메커니즘은 완전히 이해하여 추가 조사를 보증하지 않습니다.
여기에서 우리는 체외에서 연구 할 수있는 말라리아 및 HIV 동시 감염하는 방법을 설명합니다. 특히,이 방법은 HIV 감염의 맥락에서 말라리아 특이 면역 반응의 시험을 허용한다. 우리 프로토콜 배양 P. HIV 만성 감염 기증자로부터 체외에서 격리 갓 절연 말초 혈 단핵 세포를 이용한 다기능 공 배양 시스템 (PBMC를)을 기술 원충은 적혈구 (PfRBC)를 기생. 이러한 응답에 HIV 항 바이러스 요법의 효과는 또한 HIV (+) 도너 전후 요법 전향 채취 한 PBMC를 사용하여 검사 할 수있다.
우리는 HIV 감염의 영향을 조사하기 위해,이 시스템을 사용한말라리아 관련 선천성 면역 반응에 대한 11, 12, 및 NK 세포에서 손상되는 말라리아 관련 IFNγ 및 TNF 반응을 확인할 수 있었다 HIV (+) 도너 전후 HIV 항 바이러스 요법에서 NKT 세포, γδ T 세포 . 또한, 우리는 단핵구 기능 또한 HIV (+) 기증자에 손상되는지 결정하지만, 이후 HIV에게 항 레트로 바이러스 치료를 복구하기 위해이 시스템을 사용할 수 있었다.
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Protocol
이 프로토콜은 기생충 문화에 사용되는 혈청과 적혈구에 대한 기증자의 채용이 필요하며, PBMC 분리에 대한 HIV (+)와 감염되지 않은 기증자. 기관 검토 보드는 모든 연구를 승인해야하고 모든 기증자 혈액 추첨 이전에 동의를 제공해야합니다.
주의 : 인간의 혈액 샘플과 인간 말라리아 기생충 작업은 예방 조치가 필요합니다. 항상 레벨 2 바이오 안전성 캐비닛에 실험실 코트, 장갑, 작업을 착용하십시오. 인간 말라리아에 실수로 경피 노출의 경우, 예방 적 치료에 대한 건강 및 안전에보고한다. 추가 안전 고려 사항은 또한 HIV (+) 혈액 작업을위한 장소에 넣어해야합니다. 다시 폐쇄 실험실 코트를 착용 할 것. (맨 장갑은 라텍스한다) 더블 장갑입니다. 레벨 2 바이오 안전성 캐비닛에 모든 처리를 수행합니다. 모든 유리 또는 날카로운 물체를 사용하지 마십시오. 흡입기를 사용하지 마십시오. 폐기에 앞서 1 시간의 최소 virox 솔루션 또는 표백제에 오염 된 모든 항목을 놓습니다.사용 다음 1 시간 동안 virox 및 UV와 모든 표면을 세척 할 것. 각 기관이 준수해야 할 필요가 자신의 특정 바이오 안전성 규제를해야합니다 있습니다. 평가 가능한 노출 후 예방의 고려에 대한 건강 및 안전에 HIV에 감염된 혈액에 대한 모든 사고 피폭을보고합니다.
참고 : P.의 다른 균주를 열대열 말라리아 기생충이 존재한다. ITG는 이들 실험을 위해 사용되었지만, 다른 변형이 사용될 수있다. 냉동과 해동 말라리아 원충 기생충에 뛰어난 지침은 MR4 웹 사이트 (13)에서 구할 수 있습니다.
1. 말라리아 기생충 문화에 대한 RPMI-만들기
- DDH 2 O 950 ㎖, RPMI-1640 분말 1 패킷의 HEPES 6g, 탄산 수소 나트륨 2g, 및 하이포크 산틴 1.35 mg을 혼합하여 RPMI-0을 만든다.
- 해동 열 두 개의 서로 다른 기증자로부터 인간 혈청을 불 활성화. 기생충 O 유형에서 성장하는 경우 AB 도너 가장 있지만 사용할 수 있습니다적혈구 (RBC). 혼합하는 튜브 전환. 혈청은 입자상 물질을 포함하거나 두꺼운 스핀 2,000 rpm으로하고 있다면 0.45 μm의 필터 유닛을 이용하여 액체 부분을 필터링.
- 0.2 μm의 필터 유닛의 필터를 RPMI-0 180 ㎖, 인간 혈청 (각 공여자 10 ㎖)을 20㎖ 및 / ㎖ 겐타 마이신 10 mg을 0.5 ml의 사용.
참고 : 하나 이상의 필터 유니트가 요구 될 수 있도록 인간 혈청이 필터를 막히게 할 수있다. - RPMI-A와 매체 병, 날짜, 및 혈청의 소스 레이블. 필요 냉장 때까지. 냉장 때 RPMI-A는 흐린 설정 할 수 있습니다. 이는 정상이지만, 증가 운량은 오염의 표시이다.
참고 : 기생충 성장이 다른 기증자의 혈청에 따라 다를 수 있습니다. 그것은 사용하기 전에 좋은 기생충 성장을위한 모든 인간 혈청 배치를 테스트하는 것이 좋습니다.
기생충 문화 2. 준비 인간의 붉은 혈액 세포
주 : 혈액 기증자 유형 오해야
- 산 CIT에 혈액의 7-10 ml의 수집속도 - 덱 스트로스 (ACD) 튜브. 기증자의 ID 및 레이블 컬렉션의 날짜를 기입합니다.
- 4 O C에서 보관 혈액이 필요할 때까지. 한 달 이내 기생충 문화 혈액을 사용합니다.
- 70 % 에탄올로 튜브의 상단을 닦아주십시오. 조심스럽게 마개를 제거하고 폐기합니다. 15 ML 튜브에 혈액을 전송합니다. 1,000 X g에서 3 분간 스핀. 흡인에 의해 플라즈마를 제거합니다.
- 따뜻한 RPMI-0의 동량 적혈구를 일시 중단합니다. 1,000 X g에서 5 분 스핀. RPMI-0 5ml에, 흡인에 의해 재현 탁를 버피 코트를 제거하고 세척을 2 회 이상 반복한다.
- 상층 액을 제거하고 볼륨에 의해 50 % RBC 인 혼합물을 생성하기에 충분한 RPMI-를 추가합니다.
- 필요할 때까지 4 ℃로 보관합니다.
3. 기생충 문화를 유지
- 사전 따뜻한 RPMI-37 O C.
- RPMI-5 ㎖와 ~ 3 %의 용적률에 대한 세척 인간 적혈구의 75 μL와 T25 플라스크에 해동 기생충 (해동 절차에 대한 MR4 프로토콜 참조) 놓습니다.주 : 헤마토크릿 전체 부피에 비해 RBC의 볼륨을 측정한다. 계산할 헤마토크릿 매질 플러스 RBC의 총량 팩형 RBC의 볼륨을 측정한다. 해동 기생충은 적혈구의 75 μl를 기여할 것으로 가정합니다. 3 %의 용적률 (150 μL / 5,000에 해당 매체 5 ㎖로 RBC의 150 μL의 총,이 플라스크에 (포장 된 적혈구의 75 μl를 추가하는 것과 인) RBC 주식의 150 μL를 추가하여 μL)의 혼합물을 100 % = 3 % X.
- 기생 가스 혼합물 (1 % O 2, 3 % CO 2, 밸런스 N 2)와 함께 30 초 동안 플라스크 가스. 인감 및 가스 교환을위한 큰 표면적을 허용하는 등 37 O를 C 배양기에서 아래로 플라스크 넓은면을 배치합니다.
- RBC 층을 방해하지 않도록으로 매체를 변경하고 기생충 (매일 수행해야합니다)를 확인하려면, 조심스럽게 플라스크를 이동합니다. 무균 분리 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈액 층을 방해하지 않고 배양액을 그린다.
- PA를 확인하려면rasitemia, 혈액 층에서 10 μL 샘플을 제거 유리 슬라이드에 배치하고 얇은 혈액 영화를 두 번째 유리 슬라이드를 만들 사용. 슬라이드가 건조하도록 허용합니다.
- 부드럽게, 플라스크에 신선한 RPMI-4 ml에 놓고 30 초 동안, 가스를 혼합하고, 37 ° C에서 인큐베이터에있는 장소.
- 제조사의 프로토콜에 따라 Hema3 염색 키트를 사용하여 슬라이드 얼룩.
- 최적의 염색을 위해, 수영은 10 초, 나는 10 초 동안 솔루션, 30 초 동안 솔루션 II에 대한 고정 용액에 슬라이드. 물에 세척하여 건조하는 슬라이드를 둡니다.
- PfRBC의 수를 계산하여 기생충을 계산 RBC (스테인드 핑크)의 총 수 대 (어두운 보라색 염색). 정확도를 보장하기 위해 셀 (300)의 총 개수.
- 기생충은 5 %의 기생충에 도달하면, RPMI-40 ㎖, 및 RBC 500 μL를 사용하여 T75 플라스크에 배양을 확장.
4. 기생충 동기화
참고 : T 전날그는 실험 알라닌으로 처리하여 기생충 문화를 동기화 할 수 있습니다. 만 링 단계 기생충과 감염되지 않은 RBC는이 치료를 살아남을 것입니다. 알라닌 동기화 trophozoite 순수 배양 당신에게 공동 배양 실험에 사용될 수 다음날을 줄 것이다. 링 단계 기생충의 대부분을 포함하는 기생충 문화로 시작해야합니다.
- 알라닌 8.01 g (300 mM)을하고 DDH O. 2의 300 mL의에 트리스 (10 mM)을 0.365 g의 혼합함으로써 알라닌 용액을 조제 7.4으로 산도를 가져와. 필터는 0.2 ㎛의 필터 유닛을 이용하여 살균.
- 사전 따뜻한 알라닌 솔루션 (37) O C.
- 기생충 문화 (5 분 X 1,000 XG)를 스핀 다운, 그리고 매체를 제거합니다.
- 알라닌 용액 (19) 볼륨에서 재현 탁 펠릿 (1 ㎖를 19 ml의 알라닌 솔루션을 RBC 포장). 실온에서 15 분 동안 품어.
- 스핀 5 분 X 1,000 X g. 기음 뜨는. RPMI-0 번에 씻으십시오. 기음 뜨는에 resuspend RPMI-A와 2 ~ 3 %의 용적률을 조정합니다. G37 O C.에 플라스크 및 반환 등
주 : 공존 배양 실험에 5 %의 최소 trophozoites 기생충 최적 간주 10 % 기생충으로 필요하다.
공동 배양 실험 5. 기생충 및 RBC 준비
- 염증 반응을 유도하기 위해 공동 배양 실험에서 PBMC 당 3 PfRBC의 비율을 사용합니다. PfRBC 합계를 계산하기 위해, 3.5에 기재 한 헤마토크릿 혈구를 사용 기생충 배양 1 ㎖ 당 RBC 수를 카운트하여 같은 얇은 혈액 도말함으로써 기생충을 정량화.
PfRBC = %의 기생충의 수는 문화의 총 RBC / ㎖의 X ml의를 X. 예를 들어, 10 × 106 RBC / ㎖ 및 10 %에서 배양 기생충 10 ㎖, 0.1 × 106 / ㎖ X 10 ㎖ = 10 × 106 PfRBC 같다. - 1,000 XG (RT)에서 5 분 동안 기생충 문화를 스핀. RPMI-S + ㎖의 당 6 × 10 6 PfRBC (500 ml의 RPMI-1640에서 대기음 매체와 재현 탁은 L- 글루타민과 HEPES, 10 %의 열 보충불 활성화 된 FBS, 1.5 ml의 겐타 마이신, 5 내지 100 mM의 피루브산 나트륨의 ㎖, 10 mM의 MEM 비 필수 아미노산 5 ㎖ 된 5mm의 β 머 캅토 에탄올 5 ㎖).
- 기생충 문화 ml의 당 RBC의 동일한 번호로 RPMI-S의 +에서 적혈구 용적률 및 재현 탁을 계산, (기생충 문화를 유지하기 위해 사용되는 것과 같은 기증자로부터 감염되지 않은 RBC) 제어 피하십시오.
사람 말초 혈액 단핵 세포의 6. 분리 (PBMC)
- (-) 제어 만성 HIV (+) 기증자 및 HIV 모두에서 나트륨 헤파린 튜브에 정맥혈 (녹색 위) 수집합니다. EDTA의 칼슘 킬레이트 작용은 세포의 기능에 영향을 미치는 등의 항응고제로 EDTA를 사용하지 마십시오. 평균적으로 혈액 10 ㎖ 당 6 10 × 5 ~ 10 사이의 PBMC를 기대합니다. 전형적인 실험을 위해 각 기증자의 혈액 30 ml의를 수집합니다. 혈액량은 실험 조건에 따라 조절해야 할 것이다.
- 가능한 한 빨리 확실히 혈액의 시간이 수집 내에서와 같은,플라스틱 50 ML 튜브에 튜브와 장소에서 피를 제거합니다. 특히, 단핵 세포는 활성화되고 유리 고수하므로 유리 혈액 수집 튜브가 사용되는 경우, 세포가 가능한 한 빨리 제거하는 것이 중요 할 것이다.
- 15 분 동안 1,000 XG에서 피를 스핀 플라즈마를 수집 (-하지이 단계가 생략 될 수 있다면이 필요한 경우 다른 연구에 사용할 수 있습니다). 감기 DPBS의 같은 부피의 혈액을 희석.
- 50 ㎖ 튜브에 RT 피콜 15 ml에 놓습니다. 천천히 멸균 플라스틱 이전 피펫을 사용하여, 임의의 혼합없이 피콜 위에 혈액 / DPBS 용액 층을 포함한다. 혈액 / DPBS 용액 25 ㎖의 피콜 최대 각 15 ㎖의 위에 적층 될 수있다.
- 600 × g으로 실온에서 30 분 동안 구배 스핀. '더 브레이크'설정이 켜져 있는지 확인합니다.
- 세포가 회전하면, 두 단계 사이의 인터페이스를 찾습니다. PBMC는 곳이다. 인터페이스에서 PBMC를 수집 멸균 플라스틱 전송 피펫을 사용 (참조그림 1). RBC에 의한 오염을 최소화합니다.
- 튜브 당 최대 20 ㎖로, 50 ㎖ 튜브에 수집 된 세포를 놓습니다. 무균 감기 DPBS와 50ml로 구성 Top 튜브.
- 300 x g에서 4 ℃로 10 분 동안 세포를 스핀.
- 5 ml의 멸균 감기 DPBS에 뜨는,에 resuspend 펠렛을 버리고 하나의 튜브에 같은 기증자의 모든 세포를 풀. 무균 DPBS와 50ml로까지 위쪽을 세척 2 번 단계를 반복합니다.
- 10 ml의 RPMI-S + 매체에 재현 탁 세포.
- 20 μL 나누어지는을 제거하고 트리 판 블루 20 μL와 혼합. 피펫 (10) 혈구의 μL 및 살아있는 세포 (파란색 염료를 채택하지 않은 세포 - 모든 푸른 세포가 죽은)을 계산합니다. 다음과 같이 용액에 세포 수를 계산하는 혈구를 사용합니다.
참고 : 혈구는 라인이 적용되는 영역이 알려져 있도록 지정된 크기의 격자가있다.- 혈구가 깨끗한 지 확인합니다. counti 통해 coverslip에 배치NG 지역. 부하 V 형 웰 중 하나에 피펫 팁을 배치하여 세포 용액 10 μL. 커버 슬립 아래 지역은 모세관 작용에 의해 채워집니다.
- 현미경으로로드 된 혈구를 놓습니다. 혈구의 전체 그리드는 1mm 2 각 9 사각형이 포함되어 있습니다. 각각의 큰 사각형 내의 모든 세포를 계산합니다. 너무 많은 셀들이 존재하는 경우, 상기 용액을 희석하고 재검.
- 다음과 같이 세포 농도를 계산 : 총 세포 / ㎖ = (사각형의 총 세포가 계산 / #) × 희석 배수 X 10,000 세포 / ml, 20 × 10,000 세포 / ㎖ = 20의 예를 들면, (500 세포 / 5 제곱) × 희석 배수 × 106 총 세포.
- ml의 당 10 × 10 6 (RPMI-S + 중)의 최종 농도 매체를 조정합니다.
7. 말라리아 / HIV 공동 감염 문화
- 플레이트 고립 된 PBMC를 100 ㎕, 24 웰 플레이트 (물론 당 1 × 106 PBMC)에 RPMI-S + 매체의 400 μL. 확인우물이 중으로 설정되어 있는지 : 감염되지 않은 RBC 3 우물, PfRBC 3 우물, 중간 3 우물, 그리고 PMA / 이오 노마 이신 3 우물. (-) 샘플이 모두 HIV (+) 및 HIV이다.
- PfRBC 우물, 우물 (5.2 준비 기생충 문화의 500 μL)에서 각각 3 × 10 6 PfRBC 놓습니다.
- 감염되지 않은 RBC 우물, 우물 각 5.3에서 제조 된 감염되지 않은 RBC 문화의 500 μl를 놓습니다.
- 매체 우물, 우물의 각 RPMI-S + 매체의 500 μl를 놓습니다.
- PMA / 이오 노마 이신 우물은 (/는 각각 ml로 2.5 페이지 / ㎖, 250 페이지) PMA / 이오 노마 이신 용액을 제조. 각 웰에이 용액 500 μl를 놓습니다.
주 : T 세포의 사이토 카인 분비의 강력한 자극제는, PMA와 이오 노마 이신 세포가 작동되도록 양성 대조군으로 사용 된 바와 같다. - 5 % CO 2 배양기에서 37 O C에서 개최 판.
- 옵션 : RN에 유동 세포 계측법 또는 저장하여 표현형 분석을 위해 여분의 세포를 사용미래의 mRNA 발현 분석을위한 안정화 용액.
8. 감지 말라리아 면역 응답의
참고 : 한 4로 일 동안 공동 배양 실험을 수행합니다. 어떤 매체 변화는이 시간 동안 필요하지 않습니다. 최적 시점 관심 세포 유형 및 요청 질문에 의존 할 것이다. 림프구 응답이 가장 72-96 시간에서 관찰하는 동안 12-48 시간의 배양은 PfRBCs에 단핵구 응답에 최적입니다. 시점은 실험 질문을 기반으로 최적화 될 필요가있을 것이다. PBMC를 그대로 PfRBC과 사이의 상호 작용은 흥미 롭다 경우 짧은주기 (2-4 시간)이 사용될 수있다.
- 펠렛 세포에 3 분 300 XG에 스핀 플레이트. 각 우물에서 배양 상층 액 700 μl를 수집합니다.
- 어떤 부스러기에 5 분 동안 1,000 XG에 뜨는 스핀.
- 나누어지는 아래에서 필요한, 레이블 및 동결 등의 상층 액을 삭제 -20 ° C 분비 요인 분석 PERFO 될 때까지rmed.
- ELISA 또는 비드 어레이 (제조업체의 제안 프로토콜에 따라)에 의해 사이토 카인 / 케모카인 응답을 분석합니다.
- RNA 안정화 용액으로 플레이트에 남아있는 세포를 수집하여 실시간 정량적 PCR에 의해 14 ~ 16 mRNA 발현 분석에 이용한다.
사용 셀 특정 Ccytokine 응답 9. 세포 내 유동 세포 계측법 PBMC (P)와 공동 배양 원충에 감염된 적혈구
주 : 관심의 세포 유형에 의존 할 것이다 공 배양의 길이 전술 한 바와 같이. 짧은 잠복기를 PfRBC하는 단핵구 반응에 관심이있는 경우 필요합니다. 선천성 림프구 반응은 CD4 및 CD8 T 세포가 여전히 긴 T 세포, NK 세포, NKT 세포) γδ 등에 대한 시간이 더 길어질 수. 최적화가 필요합니다.
- 이전의 분석에 6-8 시간은 모든 우물에 1000 배 brefeldin A의 1 μl를 추가합니다. 판 37 O C 인큐베이터에를 돌려줍니다. 6-8 시간의 incub 후ATION, 15 분 동안 얼음에 장소 판.
- 활발한 피펫을 사용하여 우물에서 세포를 제거하고 표시 microcentifuge 튜브에 배치합니다. 스크래핑은 단핵구를 제거 할 필요가있을 수있다.
- 1,000 X g에서 5 분 스핀 세포. 상층 액을 제거합니다. 500 μL에 재현 탁 된 세포를 유동 세포 계측법 버퍼 (1X DPBS, 2 % 열 불 활성화 된 FBS, 0.02 % 나트륨 아 지드).
- 분할 세포까지 각각의 샘플을 가지고 : 전체 항체 염색 (240 μL)에 대해 하나의 튜브, 형광 빼기 하나 (FMO) 제어 항체 염색 (240 μL)에 대해 하나의 튜브를. 제어 흠 유동 세포 계측법 (이것은 사이토 흐름을 설정하는 데 사용한다)에 대한 각 시료 (20 μL)을 소량 풀.
- 500 X g에서 5 분 스핀 세포. 상층 액을 제거합니다.
- 된 Fc 수용체를 차단하기 위해 4 ℃로 15 분 동안 버퍼 세포 계측법 50 μl의 흐름에 접합 항 - 인간 CD16 / CD32 (5 μg의 / ㎖)와 세포를 품어.
- 각각의 튜브에 버퍼 유동 세포 계측법의 1 ML을 추가합니다. 스핀 CE500 X g에서 5 분 LLS. 상층 액을 제거합니다.
- 유량의 50 μL에 재현 탁 세포 계측법 원하는 세포 표면 마커에 항체를 형광 접합 미리 적정 농도 버퍼. 모든 샘플에 대한 사전 혼합 충분한 항체 솔루션은 염색한다. 20 분 동안 4 ℃로 세포를 품어. light.Note로부터 보호 : 각 항체의 양을 최적화해야합니다. 우리는 일상적으로 CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14에 대한 얼룩. 이들 항체 적정 양을 표 1에 나타낸다.
- 각각의 튜브에 버퍼 유동 세포 계측법의 1 ML을 추가합니다. 500 X g에서 5 분 스핀 세포. 상층 액을 제거합니다.
- 각각의 튜브에 cytofix / cytoperm 솔루션의 100 μl를 추가합니다. 4 O ℃에서 20 분 동안 세포를 품어 빛으로부터 보호합니다.
- 파마 / 세척 버퍼의 1ml를 추가 - 각각의 튜브 (10 배 농축 제공을 DDH 2 O를 사용하여 1 배 희석). 500 X g에서 5 분 스핀 세포. 상층 액을 제거합니다.
- 100 μ 추가파마의 난 / FMO 제어 항체 염색 튜브에 버퍼를 씻어 세포를 재현 탁하는 섞는다.
- 전체 항체 염색 튜브에 원하는 세포 마커 (예, 사이토 카인 / 케모카인)에 형광 - 복합 항체의 사전 적정 농도 파마 / 세척 버퍼의 100 μl를 추가합니다.
주 : 각 항체의 양을 최적화해야합니다. 우리는 일상적 항 및 항 TNF IFNγ 항체로 염색. 이들 항체 적정 양을 표 1에 나타낸다. - 4 O ℃에서 30 분 동안 모든 튜브를 품어 빛으로부터 보호합니다.
- 각각의 튜브에 파마 / 워시 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 500 X g에서 5 분 스핀 세포. 상층 액을 제거합니다.
- 300 μL에 재현 탁 세포는 1 % 파라 포름 알데히드와 버퍼 유동 세포 계측법. HIV를 중화하기 위해 15 분의 최소 방치.
- 흐름 cytometer에 설정 보상에 사용되는, 보상 구슬을 사용하여 단일 항체 염색 샘플을 준비합니다. 보상의 종류구슬이 사용되는 항체에 따라 달라집니다 (예., 항 - 마우스 IG, 안티 쥐 / 햄스터 IG). 소용돌이 구슬. 항체 당 구슬 한 방울을 추가합니다. 염색을 위해 사용되는 항체의 동일한 금액을 추가합니다. 버퍼 유동 세포 계측법의 200 μl를 추가합니다. 다음은 이제 사용할 준비가되어 있습니다. 비드를 세척 할 필요가 없다.
- 가능한 한 빨리 사이토와 최상의 결과를 24 시간 내에 흐름에 샘플을 획득. 가능하면 우리가 즉시 취득을 권장하도록 탠덤 염료 스토리지와 해리에 민감하다.
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Representative Results
그래프 NKT 세포 집단을 수득 CD56 + CD3 + γδ- 게이트들을 이용하여, NKT 세포에서 IFNγ 생산 (도 2)의 레벨을 도시한다 (데이터는 보이지 않음). 세포 염색 전에 72 시간 동안 배양 하였다. 일단 10 만 CD3 + 세포는 사이토 NK, NKT 및 γδ 세포 (관심의 세포)의 충분한 인구를 얻는 흐름에 취득한, 스테인드. 5,600 NKT 세포의 최소 각 그래프에 표시된다. TNF 생산은 동일한 방식으로 수득된다 (데이터는 미도시). (-)에 노출 된 개인 PfRBC 그래프 명확 IFNγ 생산은 HIV (+) HIV에 비해 개인의 세포에서 낮은 것을 보여준다.
유동 세포 계측법 분석은 매우 주관적이다. 이는 각각의 실험에 대한 모든 적절한 제어를 갖는 것이 필수적이다 (도 2 참조). 배경 레벨은 사이토 카인 염색 진정한 표현 가능 FMO 샘플들을 이용하여 계산된다.PMA / 이오 노마 이신 자극 된 세포를 양성 대조군으로 사용되었다 (데이터는 미도시). PMA와 이오 노마 이신은 T 세포의 사이토 카인 생산의 강한 자극이다. 이러한 샘플에서 IFNγ 생산의 부족은 것 대부분 염색 프로토콜에 문제가 있음을 나타냅니다. 그러나, 세포 생존 또는 비활성 시약과 같은 다른 변수도 잘못 될 수있다.
PBMC를의 위치를 보여 피콜 그라데이션 포스트 스핀 그림 1. 묘사.
자연 살해 T 세포에 의해 그림 2. 인터페론 γ 생산. 흐름도는 CD56 + CD3 + 세포 γδ- (5,600 이벤트 최소) 게이팅에 의해 수득 하였다. (-)로 자극 샘플 IFNγ 생산은 HIV에 검출 될열대열 원충은 적혈구를 감염. 이 사이토 카인 응답이 더 이상 명백한 만성 HIV 감염의 맥락에서이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 주시기 바랍니다.
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Discussion
우리의 프로토콜은 가장 사실적으로 체외에서 HIV-말라리아 공동 감염을 연구하기 위해 최적화되었습니다. 첫째, 신선한 인간의 적혈구와 혈청은 말라리아 기생충 문화가 필요합니다. 이 말라리아 기생충의 건강한 인구를 얻기 위해 매우 중요합니다. 라이브 P. 사용시 사이토 카인 생성을 훨씬 더 빠르고 강력한 같이 기생충 해물 라이브 기생충 치환 될 수 없다 원충은 적혈구 (PfRBC) 17, 18에 감염된. 또한, NK 세포와 같은 세포 유형의 활성화는, 전체 PfRBCs 필요하고, 기생충 해물으로 효율적으로 작동하지 않는다. 이는 PfRBC와 백혈구 사이의 직접 접촉의 필요성에있을 수 있습니다 또는 세포 표면 수용체 (18)과 상호 작용하는 기생충 유도 리간드의 불안정한 성격 때문일 수 있습니다. 말라리아 PfRBC 문화는 물론 실험에 앞서 (프로토콜 4) 동기화해야합니다. 동기화 PfRBCs은 실험 데이터의 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜 드 비록서기 공동 배양 trophozoite PfRBC 스테이지의 사용은, 그것을 용이 PfRBC 링 단계의 연구를 위해 변형 될 수있다.
인간 백혈구 인위적 HIV에 감염 될 수 있으며,이 방법은 말라리아 HIV 감염 공동 (20)의 조사 연구에 사용되었다. 그러나, 이것은 HIV 만성 감염으로 인한 면역 조절 장애를 모델링하지 않는다. 이 공동 배양 시스템에서 우리는 만성적 인 HIV-1에 감염된 인간의 참가자들로부터 분리 된 PBMC를 사용합니다. 참가자가 연구에 필요한 때는 신중 모집단을 선택하는 것이 중요하다. 포함 및 제외 기준은 최소한의 변화 및 최대 재현성을 보장하기 위해 매우 중요합니다. 우리의 기준은 만성 HIV 감염에 대한 명확한 정의를 포함하고 동시 감염된 사람의 배제 (> 50 세포 / mm 3 / 년의 CD4 + T 세포 수의 감소와 함께,> 1 년 동안 HIV는 감염). 이렇게 얻어진 결과는 매우 기인 할 수 있음을 보장HIV 만성 감염의 효과가 아닌 다른 감염 렐리. 우리가 말라리아에 타고난 면역 반응에 관심이 있기 때문에 또한, 우리는 이전의 말라리아 감염을했다 기증자를 제외.
HIV-비감염 컨트롤은 데이터 정규화 있도록, 각 샘플링 시점에서, 각각의 HIV (+) 도너 사용된다. 시도는 적어도 세에 대한 각각의 HIV (+) 기증자에 컨트롤과 일치하도록해야한다 바람직 또한 섹스는 (비록 우리의 이전 연구 (12)에서 우리는 세포 하위 집합 또는 여성과 남성 사이의 사이토 카인 반응에 유의 한 차이가 관찰되지 않았다 HIV- 감염되지 않은 참가자). 예비 샘플링 각 샘플링 시점에서 동일-HIV 감염되지 않은 제어를 유지 계획되어 있으면 유리하다. 응답은 PfRBCs의 건강, 동기화, 기생충 수준과 PfRBCs의 성숙 단계의 학위 및 적혈구 용적률 등의 여러 요인에 의한 실험 실험에 따라 다를 수 있습니다. 주의실험 사이의 이러한 일관성의만큼을 유지하기 위해주의해야합니다. HIV에 감염되지 않은 컨트롤을 정규화하는 것은 이러한 변수에 대한 몇 가지 회계 수 있습니다.
신선한 세포를 사용하여 인공적인 결과를 피하기 위해 매우 중요합니다. 동결 및 해동 된 샘플은 세포 생존 능력의 21, 22에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 사이토 카인 생성 및 23-26 세포 표면 표현형 27 마커.
단핵구가 특히 관심이 있다면, 이것은 유리 프로토콜 동안 사용되지 않는 것이 중요하다. 단핵구 유리 및 기타 플라스틱 (28)에 준수합니다. 우리는 우리의 연구의 세포 집단에서 단핵구의 부착 및 궁극적 인 제거를 최소화하기 위해 전역 폴리 프로필렌 플라스틱 피펫, 전송 피펫, 튜브를 사용합니다.
유세포 분석을 설정하는 경우, 항체의 결합은 관심있는 세포에 따라 사용될 수있다. 우리는 IFNγ와 TNF 생산에 특히 관심NK 세포, NKT 세포 γδ T 세포로부터. 이것은 우리의 항체 패널을 정의했다. 다른 조합을 사용하는 경우에는, 각 패널에 대한 항체의 양을 최적화하는 것이 중요하다. 이것은 잘못된 데이터를 피하기 위해 매우 중요합니다. (-) 및 HIV (+), 그림 2, HIV () 또한, 유효성을 변동성을 피할 수 있도록, FMOs 각 조건 (RBC, PfRBC, 중간 및 PMA / 이오 노마 이신)와 참가자의 인구 배경 사이토 카인 수준을 평가하기 위해 필요합니다. 시험 관내 세포 내 사이토 카인 생산 측정은 통상적으로 세포 염색하기 전에 배양 된, 특히 높은 배경 수준을 초래한다. 배양 조건은 배경 레벨을 결정하므로, 적절한 FMOs 각 샘플에 대한 배경 지식 수준을 보장한다. 세포의 우리의 공급 그러므로 우리는 모든 표면 얼룩 있지만 세포 내 얼룩을 포함하는 우리의 FMOs 설계, 제한되었다. 이 연구는 모든 다른 세포 유형에 사이토킨 배경 레벨의 구체적인 비교를 허용한다.우리는 또한 배경 수준을 확인하는 표면 마커 각 실험 당 하나의 얼룩을 달렸다.
기술 된 프로토콜은 관심 셀에 따라 몇 시간 또는 며칠 이내에 응답을 검사하는데 사용될 수있는 다목적 한 것이다. 선천성 림프구에서 최적 PfRBC 유발 사이토 카인 생성을 위해, 우리는 2 ~ 3 일 후에 출력 유동 세포 계측법 측정. 단핵 세포에서 볼 때, 이전 시점 (1 또는 2 일)을 권장합니다. 이 시스템은 추출한 RNA에서 평가하기 위해 여러 종류의 세포 및 세포 반응의 흐름에 의해 구별되는 세포 계측법, 분비 응답 세포 상청액에서 측정하고, 발현 양상을 허용한다. 또한, 항체의 사용은 특정 수용체를 차단하거나 사이토킨은 상기 메커니즘을 해부이 시스템에서 이용 될 수있는 중화. 우리는 성공적으로 PfRBC 유도 IFNγ 응답 12, IL-18 수용체를 연루 IL-18 수용체 봉쇄를 사용했다. 이 시스템은 현실을 나타냅니다HIV 감염의 컨텍스트에서 말라리아 선천성 면역 반응의 수를 평가하는 IC 방법.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alanine | Sigma | A7377 | |
| antibodies (see other table) | |||
| BD Cytofix/Cytoperm with BD GolgiPlug | BD | 555028 | includes brefeldin A, cytofix/cytoperm buffer and perm/wash buffer |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD | 17-1440-02 | |
| DPBS (no calcium, no magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F1051 | heat inactivate before use |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 Staining Set | Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM non-essential amino acids (10 mM) | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 powder | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine and HEPES | Thermo Scientific | SH30255.01 | |
| sodium bicarbonate (powder, cell culture) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360 | |
| Tris (Trizma base) | Sigma | T6066 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| Trypan Blue (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843, 552845 | depends on antibodies used |
| Parasite Gas Mixture | By special order | 3% CO2, 1% O2, balance N2 | |
| Equipment | |||
| 0.2 μm filter unit | |||
| Glass slides | |||
| T25 flasks | |||
| T75 flasks | |||
| 50 ml tubes | |||
| 24 well culture plates | |||
| unplugged Pasteur pipettes | |||
| plugged Pasteur pipettes | |||
| sterile transfer pipettes | |||
| hemocytometer | |||
| flow cytometer (3 laser) | |||
| Antibodies used for flow cytometry | |||
| Anti-TNF | eBiosciences | 551487 | FITC (fluorophore) 2 μl |
| Anti-IFNγ | Biolegend | 506507 | PE (fluorophore) 20 μl |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (fluorophore) 1 μl |
| Anti-CD14 | Biolegend; BD Biosciences | 325624; 551487 | Biotin (fluorophore) 0.5 μl Streptavin PE-TR (fluorophore) 0.1 μl |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP/Cy5.5 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-γδ | Biolegend | 331212 | APC (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (fluorophore) 5 μl |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (fluorophore) 1 μl |
References
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