Abstract
Um seine menschlichen Wirt eingeben, müssen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) die Barriere von Schleimhäuten, Haut oder Hornhaut zu überwinden. HSV-1 Ziele Keratinozyten während der anfänglichen Eingabe und stellt eine Primärinfektion im Epithel, die durch latente Infektion von Neuronen folgt. Nach Reaktivierung können Viren deutlich an Schleimhaut Websites, die als Hautbläschen oder Schleimhautgeschwüre angezeigt zu werden. Wie HSV-1 dringt in Haut oder Schleimhaut und erreicht seine Rezeptoren ist wenig bekannt. Um die Invasion Route der HSV-1 in epidermale Gewebe auf zellulärer Ebene zu untersuchen, haben wir ein ex vivo-Infektionsmodell von murinen Epidermis, die den Ort der primären und rezidivierenden Infektion in der Haut darstellt. Der Test umfasst die Vorbereitung der Mäusehaut. Die Epidermis von der Dermis durch Dispase II Behandlung getrennt. Nach dem Aufschwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium wird das Gewebe fixiert und Infektion kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durch visualisiertFärbung infizierter Zellen mit einem Antikörper gegen HSV-1-immediate early protein ICP0. ICP0-exprimierenden Zellen kann in der basalen Keratinozyten-Schicht bereits bei 1,5 Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Mit längeren Zeiten der Infektion werden infizierte Zellen in Suprabasalschichten nachgewiesen, was anzeigt, dass die Infektion nicht auf die basalen Keratinozyten beschränkt, sondern das Virus verbreitet sich auf andere Schichten in dem Gewebe. Verwendung epidermalen Schichten von verschiedenen Mausmodellen erlaubt die Infizierungsprotokoll Bestimmung der Beteiligung von zellulären Komponenten, die zu HSV-1-Invasion im Gewebe beitragen. Darüber hinaus ist der Test geeignet, um Inhibitoren in Gewebe, das mit den ersten Eintrag Schritte stören, Zell-zu-Zell-Ausbreitung und die Virusproduktion zu testen. Hier beschreiben wir die ex vivo Infektion Protokoll im Detail und mit Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen präsentieren unsere Ergebnisse.
Introduction
Herpes-simplex-Virus (HSV) können eine Reihe von Erkrankungen bei Menschen von leichten unkompliziert mukokutane Läsionen zu lebensbedrohlichen Infektionen. HSV Typ 1 (HSV-1) wird überwiegend mit orofazialen Infektionen und Enzephalitis assoziiert, während HSV Typ 2 (HSV-2) eher verursacht Genitalinfektionen 1. Zwar gibt es deutliche Fortschritte im Verständnis, wie HSV tritt in Zellen in Kultur initiiert und produziert Infektion Virusnachkommen, wissen wir wenig über das virale Invasion Weg (e) in das Gewebe auf zellulärer Ebene 2. Bei Studien von HSV Haut- oder Schleimhautinfektionen, Mäuse, haben Kaninchen und Meerschweinchen als Tiermodelle verwendet. Hautinfektion wurde durch intradermale Injektion oder durch Kratzen der Haut in Gegenwart von Virus etabliert und die Entwicklung der Krankheit wurde mit der Virusproduktion korreliert. Diese Verfahren beigetragen, verschiedene Aspekte der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen, und werden verwendet, um antivirale Medikamente zu bewerten. Um HSV-Infektion am tissu studierene Ebene organotypischen Modelle der menschlichen Haut angewendet wurden. Als die Infektionsrate in diesen Floßkulturen beschränkt ist, nur eine begrenzte Anzahl von Studien, die Infektion, die Virusausbreitung und die Auswirkungen der antiviralen Komponenten veröffentlicht 3-6.
Um zelluläre Determinanten, die während der HSV-1-Infektion in der intakten Epithels eine Rolle spielen, zu charakterisieren, haben wir ein Protokoll für die Ex-vivo-Infektionsstudien von murinen Epidermis 7. Haut von Neugeborenen oder von den Schwänzen von erwachsenen Mäusen hergestellt. Da HSV-1 kann er die vollständige Hautproben, die in virushaltige Medium eingetaucht wurden nicht infizieren, die Epidermis von der Dermis getrennt wir durch Behandlung Dispase II. Nach dem Schwimmen der epidermalen Schichten auf virushaltige Medium kann infizierte Zellen in der epidermalen Basalschicht zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (pi) 7 visualisiert werden. Um die Einleitung der Infektion in einzelnen Zellen vor der viralen Replikation eine Visualisierungnd Virusproduktion, gebeizt wir mit einem Antikörper gegen die infizierten Zellprotein 0 (ICP0), die eine der ersten Proteine während der HSV-1-Infektion exprimiert wird. Die zelluläre Lokalisation von ICP0 durchläuft verschiedene Phasen während der frühen Infektion. Während ICP0 ist in Kern Foci vorliegenden während einer frühen Phase der viralen Genexpression, Relokalisierung ICP0 zum Zytoplasma zeigt eine spätere Phase der Infektion 8.
Wir nutzten die Ex-vivo-Infektionsassay der epidermalen Schichten aus verschiedenen Mausmodellen, um die mögliche Rolle der verschiedenen zellulären Faktoren während der Infektion zu testen. Um die Auswirkungen von Rac1 als Schlüsselregulator der Aktindynamik adressieren, infizierten wir die Epidermis von Mäusen mit einem Keratinozyt-spezifische Deletion des Gens rac1 9. Dieses Modell erlaubt es, die Auswirkungen der mangel Rac1 auf den Wirkungsgrad der HSV-1-Infektion in epidermalen Keratinozyten Schichten zu studieren. Der Vergleich zu infizierten Epidermis der Steuerwurfwiedervealed keinen signifikanten Unterschied, was anzeigt, dass die Abwesenheit von Rac1 hatte keine Wirkung auf die Einleitung der Infektion in der Basalschicht der Epidermis 7. Die Verwendung weiterer Mausmodellen konnten wir Adresse, die zellulären Rezeptoren vermitteln den Eintritt in die Epidermis. Infizieren epidermalen Schichten entweder Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen mit HSV-1 zeigte, dass das anfängliche Eindringen des Virus in Gewebe hängt stark von der Gegenwart von Nectin-1 10. Darüber hinaus sind unsere Ergebnisse zeigen, dass HVEM auch als Rezeptor in murine Epidermis weniger effizient zu bedienen, auch wenn als Nectin-1 10.
Um die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in den Schichten der Epidermis zu adressieren visualisieren wir ICP0 Expression in Gewebeschnitten und epidermalen Gesamtpräparate (Abbildung 1). In Kryoschnitten von kompletten Haut, werden keine ICP0-exprimierenden Zellen detektiert (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu Kryoschnitte der epidermalen Schichten zeigen zytoplasmatischenICP0 Ausdruck in der basalen Schicht bereits nach 3 Stunden pi (Abbildung 1). Zu späteren Zeitpunkten, virale Verbreitung in Schichten suprabasale visualisiert werden. Die räumliche Verteilung der infizierten Zellen in der Basalschicht leicht in epidermalen Gesamtpräparate (Figur 1) folgen. Bei der Infektion mit HSV-1 mit 100 PFU / Zelle wurden etwa 50% der basalen Keratinozyten in der Epidermis zeigen interfollikuläre ICP0 Expression bei 1,5 hr pi Zu diesem Zeitpunkt die meisten infizierten Zellen exprimieren Kern ICP0. Die Relokalisierung ICP0 in das Cytoplasma, das einen späteren Stadium der frühen Genexpression ist in nahezu allen Zellen in 3 h pi (Figur 1) vorhanden ist. Diese Modi auf ex vivo HSV-1-Infektion zu visualisieren infizierten Zellen über eine starke Assay zur Bestimmung der Wirkung von Inhibitoren oder gelöschter / mutierten zellulären Komponenten auf die virale Eintritt und die Ausbreitung im Gewebe zu untersuchen.
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Protocol
Ethik-Anweisung.
Die Herstellung von epidermalen Schichten von geopferten Tiere erfolgt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Führer von Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen (Deutschland) durchgeführt. Die Studie wurde von LANUV NRW (Anzahl 8.84-02.05.20.13.018) zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kultur Medien
- Kulti epidermalen Schichten in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose enthaltenden Glutamindipeptid, 10% FCS, 100 IE / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als "DMEM" bezeichnet).
- Zur Herstellung von epidermalen Schichten sorgfältig aufzulösen Dispase II-Pulver (5 mg / ml) in PBS erhitzt (bis zu 37 ° C). Die Lösung wird durch ein 0,22 um Filter und ihn direkt für die Behandlung.
- Für die Herstellung der gesamten epidermalen Halterungen 13, bereiten blockiert Buffer mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS. Substanzen ermöglichen, durch Inkubieren des Gemisches für mindestens 2 h bei RT auf einem Rotationsmischer aufzulösen. Bereiten auch 0,2% Tween 20 in PBS als Waschpuffer. Zur Fixierung vorzubereiten 3,4% und 4% Formaldehyd in PBS.
- Für die Immunfärbung von Gefrierschnitten, bereiten Blockierungspuffer mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS. Zur Fixierung, bereiten 0,5% Formaldehyd in PBS.
2. Herstellung der epidermalen Schichten von Mäusehaut
- Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Rückenhaut für Infektionsstudien
- Legen Sie eine enthauptete Maus (1 bis 3 Tage nach der Geburt) in eine Dissektion Gericht und abgeschnitten Extremitäten und der Schwanz in der Nähe des Oberkörper, um eine effiziente Entfernung der Haut von der komplette Oberkörper zu ermöglichen. Während der Entfernung der Extremitäten, versuchen, die Einschnitte so klein wie möglich im Durchmesser zu halten.
- Befestigen Sie den Oberkörper mit gekrümmten feinen Pinzette einnd sanft bewegen stumpfe Spitze Schere unter der Haut von kranial nach kaudal entlang der Rückseite, um die Haut vom Rumpf zu trennen. Slit die Haut entlang der Rückseite.
- Für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA, ziehen Sie die komplette Haut vor den Oberkörper mit einer Pinzette, um das Gewebe und die stumpfe Spitze Schere zu beheben, um den Oberkörper abstoßen. Für die Herstellung von Gefrierschnitten oder ganzen Halterungen nehmen Sie nur Teile der Rückenhaut.
- Hacken Sie die Rückenhaut mit einem Skalpell in 1-2 Stücke von ca. 10 x 10 mm. Setzen Sie die Stücke in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ~ 1 ml sterilem PBS. Stellen Sie sicher, dass die dermale Seite der Bodenflächen.
- Ersetzen PBS mit 1,5 ml Dispase II (5 mg / ml PBS) und Inkubation für entweder 30 min bei 37 ° C (für Gesamtpräparate) oder O / N bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis als intaktes Blatt mit einer Pinzette, um die darunter liegenden Dermis und die anderen Pinzette zu beheben, um die Epidermis zu heben. Verwenden Sie ein Fernglas, um diesen Schritt zu machen easy. Übertragen Sie die epidermale Schicht in DMEM mit seinen basalen Seite nach unten. Verwenden Sie die Blätter sofort für Infektionsversuche.
HINWEIS: Verwenden Sie die Vorbereitung der Epidermis von Neugeborenen Haut vor allem für die FACS-Analyse, Isolierung von Keratinozyten oder die Zubereitung von RNA. Wegen ihrer Zerbrechlichkeit, ist die Herstellung von infizierten Platten für Kryoschnitte oder Gesamtpräparate weniger geeignet.
- Vorbereitung der Epidermis von Erwachsenen Schwanzhaut für Infektionsstudien
- Euthanize die Mäuse im Alter von 1-3 Monaten durch zervikale Dislokation. Nehmen Schwanz statt Rückenhaut, da die lang eingebettet Haarfollikel auf der Rückseite beeinträchtigen Trennung von intakten epidermalen Schichten. Schneiden Sie den Schwanz von Mäusen geopfert und schlitzte es der Länge nach mit einem Skalpell.
- Ziehen Sie weg der Haut vom Knochen und hacken sie mit einem Skalpell in Stücke von etwa 5 x 5 mm. Legen Sie bis zu 4 Stück in einem gut und fahren Sie mit der Inkubation in Dispase II wie unter 2.1.5 beschrieben,
HINWEIS: Verwenden Sie für Erwachsene tail Haut zu Gefrierschnitten oder ganzen Lager vorzubereiten. Alternativ zur unmittelbaren Verwendung kann Schwänzen gelagert oder für etwa 24 h bei 4 ° C, ohne signifikante Infektionseffizienz transportiert werden. Wenn Schwänze sind bis zu 48 Stunden aufbewahrt, könnte epidermalen Schichten kaum mit HSV-1 infiziert.
- Dissoziation der Epidermis für die FACS-Analyse
Hinweis: Der Nachweis von Oberflächenprotein-Expression durch FACS-Analyse erfordert geeignete Zelldissoziation Techniken, die nicht die Zelloberfläche und das Protein von Interesse schaden.- Inkubieren neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite auf 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C.
- Stoppen Sie die Inkubation durch Zugabe von 3 ml DMEM. Distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in der 6-Well-Platte, so dass die Keratinozyten erhalten gelöst. Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 malimmer mit frischem DMEM.
Hinweis: Diese Dissoziation Verfahren ist angebracht, Nectin-1 auf der Oberfläche der Keratinozyten zu erkennen. - Alternativ inkubiere die epidermalen Blätter auf enzymfreien Zelldissoziationslösung (CDS) für 15 min bei RT und 15 Minuten bei 37 ° C. Inkubieren Sie weitere 15 min bei RT, um sanft spülen die Keratinozyten durch Pipettieren von CDS auf und ab.
- Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie den Spülvorgang 3 mal mit frischem DMEM.
Hinweis: Diese Dissoziation ist geeignet, um die Oberflächenexpression von HVEM zu erkennen. Der Nachteil der CDS-Lösung ist, dass weniger Zellen als bei rekombinante Trypsin-basierten Zelldissoziationslösung dissoziiert. Zusätzlich zur Oberflächen nach Dissoziation der infizierten epidermalen Schichten mit rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung Expression kann nukleare oder cytoplasmatische Expression wie ICP0-Expression durch FACS analysiert werden.
- Dissoziation von Epidermis-Keratinozyten oder ex isolierenRNA-Darm-Trakt
- Gesetzt neugeborenen epidermalen Schichten in einer 6-Well-Platte mit der basalen Seite in Richtung der Unterseite der Schale, die 1,5 ml / well rekombinantem Trypsin basierten Zelldissoziationslösung enthält. Inkubation für 30 min bei RT. In 3 ml DMEM und distanzieren Keratinozyten unter Verwendung einer gekrümmten feinen Pinzette vorsichtig bewegen die Epidermis in die Schüssel.
- Sammeln Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal mit frischem DMEM. Verwenden Sie diese Zellsuspension in RNA oder zur Kultur primären murinen Keratinozyten zu extrahieren.
3. Die Infektion von epidermalen Schichten mit HSV-1
- Es wird eine Lösung von HSV-1 Stamm 17 Gew 11 in nicht weniger als 500 & mgr; l DMEM-Medium ersetzt und die durch die Viruslösung auf dem die epidermalen Schichten schwimmen. Dieser Zeitpunkt wird als Zeitpunkt 0 12 definiert. Führen Infektion eines epidermalen Schicht in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C. Die Berechnung der Virustiter über die geschätzte Anzahl basierendvon Zellen in der Basalschicht pro epidermale Schicht (etwa 2 x 10 5 Zellen pro 5 x 5 mm Blech).
- Infizieren mit HSV-1 mit ungefähr 100 Plaque-bildende Einheiten (PFU) / Zelle und ersetzen das virushaltige Medium durch DMEM bei 1 h pi
HINWEIS: Bei epidermalen Schichten von Neugeborenen Haut, bedenken Sie, dass Blätter beginnen, während der Inkubation zu distanzieren.
4. Visualisierung der infizierten Zellen
- Epidermal Whole Halterungen 13
- Fix epidermalen Schichten mit 3,4% Formaldehyd entweder für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C. Zwei Mal mit PBS waschen und blockieren mit 0,5% Milchpulver, 0,25% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut und 0,5% Triton X-100 in TBS 1 h bei RT 14.
- Inkubieren Sie die Platten O / N mit Maus-Anti-ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) 15 verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer bei RT. Um die Intermediärfilament Netzwerk visualisieren inkubieren gleichzeitig mit polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus Keratin 14 (100 ng / ml).
- Während 4 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-0,2% Tween 20 waschen 4-5 mal. Inkubieren O / N mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml), AF555-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG (1 ug / ml) und DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) (100 ng / ml) in Blockierpuffer bei Raumtemperatur.
- Waschen mit PBS-0,2% Tween 20 für 4 h bei RT. Berg epidermalen Schichten mit ihren basalen Seite auf einem Objektträger, einbetten in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen.
- Epidermal Kryoschnitte
- Erwachsenen epidermalen Schichten wurden in 4% Formaldehyd in PBS für 20 min bei RT fixiert und 2 mal mit PBS gewaschen. Einbetten festen Blätter in Gewebegefriermedium und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Geschnitten 8-10 um-Schnitte mit einer Kryomikrotom.
- Befestigen Sie die Profile wieder mit 0,5% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT, wäscht 2 mal mit PBS, Block mit 5% normalem Ziegenserum und 0,2% Tween 20 in PBS für 30 min bei RT und dann für 60 min mit m FleckOUSE Anti ICP0 (monoklonaler Antikörper 11060) 15 verdünnt 1:60 in Blocking-Puffer, gefolgt von 3 Mal Waschen mit dem Blockierungspuffer.
- Dann Inkubieren mit AF488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1 ug / ml) und DAPI (100 ng / ml) in Blockierungspuffer für 45 Minuten bei RT und 3 x waschen. Betten Sie Abschnitte in fluoreszierende Einschlussmittel geben und mit Deckgläschen.
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Representative Results
Die Aufgabe des Verfahrens ist es, epidermalen Blätter in dem HSV-1 kann von der basalen Schicht eindringen vorzubereiten. Der entscheidende Schritt ist die Trennung der Epidermis von der Dermis durch Dispase II-Behandlung, die in Abhängigkeit von der Mausstamm, angepasst werden muss. Die Konzentration von Dispase II kann 2,5 bis 5 mg / ml, und die Zeit der Inkubation von 20 bis 45 min liegen. Die Färbung der Intermediärfilamente Protein Keratin 14 ermöglicht leicht vorherzusagen, ob der basalen Epidermis infiziert werden können, oder ob sie nur eine sehr begrenzte Anzahl von infizierten Zellen (Figur 2) zeigen. Idealerweise sollte das Keratin 14-Färbung von epidermalen Gesamtpräparate zeigen eine intakte Schicht aus Basalzellen (2A). Im schlimmsten Fall zerstört Behandlung Dispase II der Basalschicht und keine Zellen in der Epidermis interfollikuläre gefärbten anzeigt, daß das Keratin 14-exprimierenden Basalkeratinocyten dissoziiert (2B 16 (2B) . Nur nach Reduktion Dispase II auf 2,5 mg / ml für 30 min wurde eine intakte Grundschicht erhalten, wie durch Keratin 14-Färbung (2C) sichtbar gemacht.
Wegen der dichten Haarfollikel als Anhängsel der Epidermis, ist die Trennung der Epidermis von der Dermis am bequemsten, wenn die Haut aus den Schwänzen von erwachsenen Mäusen entnommen. Alternativ können Rückenhaut neugeborener Mäuse mit Entwicklungs Haarfollikel verwendet werden, obwohl die Zerbrechlichkeit der Blätter nach der Inkubation begrenzt die Größe der auswertbaren Bereiche. Bisher wurde kein Unterschied in der Effizienz der HSV-1-Infektion, je nachdem ob Epidermis wurde aus neugeborenen oder erwachsenen Mäusen (Figur 3) entnommen bemerkt. Ganze Berge von newborn Epidermis visualisieren effiziente Infektion der interfollikulären Epidermis als auch der dicht gepackten Zellen entlang der Entwicklung von Haarfollikeln (Abbildung 3). Während die interfollikuläre Epidermis adulter Epidermis effizient infiziert werden Haar Keime und nur Teile der äußeren Wurzelscheide von Haarfollikeln infiziert sind (Figur 3). Die Talgdrüsen unter dem Haarschaft immer gefärbt, was aber aufgrund der unspezifischen Markierung des sekundären Antikörpers wie in infizierten Kontrollen (Figur 3) dargestellt.
Verwendung Inhibitor Studien untersuchten wir, ob Cholesterin spielt eine Rolle für die HSV-1 Eintritt in die Epidermis. Epidermalen Schichten der erwachsenen Mäuse wurden mit Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD), das Cholesterol aus der Plasmamembran 17-19 depletes vorbehandelt. Vor der Infektion, MßCD wurde von mehreren Waschschritten, um jede abbauende Wirkung auf Cholesterin in der viralen Envel vermeiden entferntope. Nach Vorbehandlung mit 20 mM MßCD fast keine infizierten Zellen wurden entweder in den interfollikuläre Epidermis oder der Haare Keime gesehen, jedoch nur die nicht-spezifische Färbung der Talgdrüsen sichtbar war (4A). Als Kontrolle, dass das Gewebe nicht von Inhibitorbehandlung beschädigt, haben wir 500 & mgr; g / ml Cholesterin zur MßCD behandelt epidermalen Schichten (4A) aufzufüllen. Diese Behandlung komplett restauriert Infektiosität nachzuweisen, dass die Vorbehandlung mit dem Inhibitor nicht mit Lebensfähigkeit des Gewebes stören.
Verwenden von Maus-Modellen haben wir uns die Beteiligung der Nectin-1 und Herpesvirus entry mediator (HVEM) als zelluläre Rezeptoren für HSV-1 in der Epidermis 10. Beide Proteine sind dafür bekannt, so effizient Rezeptoren für HSV in verschiedenen Zelllinien 20,21 handeln, und sie ausreichend für die Entwicklung der Krankheit in Mäusen 22. Wir stellten fest, die Epidermis-spezifischen Rollen der Nectin-1 und HVEM als HSV-1 -Rezeptoren 10. Nach dem Aufschwimmen epidermalen Schichten aus Wildtyp, Nectin-1- oder HVEM-defizienten Mäusen auf virushaltige Medium wurden Gesamtpräparate in 3 h pi hergestellt, um die Anzahl der infizierten Zellen sichtbar. Der Vergleich der interfollikuläre Epidermen bedeutet, dass nur Nectin-1-Mangel der Anzahl von ICP0-exprimierenden Zellen (4B) drastisch reduziert. Darüber hinaus wurde die Virusausbreitung ziemlich begrenzt in Abwesenheit von Nectin-1, wie in Kryoschnitten bei 18 h pi gezeigten (4C). Zur Quantifizierung der infizierten Zellen ist es wichtig, zu überwachen, ob die Anzahl der infizierten Zellen wird gleichmäßig auf die interfollikuläre Epidermis oder ob Cluster von infizierten Zellen beobachtet verteilt sind. In Nectin-1-defizienten Epidermis beispielsweise die Infektionseffizienz mit ca. 10% Infektion in einigen Bereichen und ca. 30% in anderen Bereichen der Epidermis interfollikuläre 10 variiert. Daher haben wir beschlossen, to geben keine Zahlen von infizierten Zellen, um die Abnahme der Infektion, sondern vorliegenden Gesamtpräparate als qualitative Daten demonstrieren.
Abb. 1: Visualisierung der infizierten Zellen in der Epidermis Teile oder ganze Halterungen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
An der Spitze ist ein Schema komplette erwachsenen Hautproben, epidermale Sektionen nach der Trennung von Dermis und Epidermis-Gesamtpräparate mit der sichtbaren Oberfläche der basalen Keratinozyten-Schicht. Der Pfeil zeigt auf einem Haarfollikel und der Stern zeigt die interfollikulären Epidermis. Hautproben und epidermale Blätter von 3 Wochen alten Mäusen hergestellt wurden, wurden mit HSV-1 bei etwa 100 PFU / Zelle infiziert und bei 1,5 oder 3 h pi Proben wurden Staine festend mit Anti-ICP0 (grün) nach Mock-Infektion oder mit 1,5 oder 3 h pi infizierten Zellen sichtbar zu machen und Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI (blau) zeigt alle Zellen in den verschiedenen Schichten. Als Kontrolle scheininfizierten komplette Hautproben werden im Vergleich zu infizierten Proben bei 3 h pi demonstrieren keine ICP0 Färbung (linker Teil) gezeigt. Mock-infizierten oder infiziert epidermalen Schichten als Gefrierschnitten vorbereitet sind im Mittelteil dargestellt. Epidermalen Gesamtpräparate für 1,5 oder 3 h infiziert sind, im rechten Teil gezeigt ist. Bar, 25 um (Gefrierschnitte) und 40 & mgr; m (Gesamtpräparate).
Fig. 2: Keratin 14-Färbung von epidermalen Gesamtpräparate nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von Dispase II Epidermis von C57BL / 6 oder B6.A2G-Mx1 Mäusen wurde aus Dermis mit Dispase II getrennt. Epidermalen Gesamtpräparate wurden mit Anti-Kerati gefärbtenn 14 (rot) und DAPI (blau). Epidermale Schichten wurden mit 5 mg / ml inkubiert (A, B) oder 2,5 mg / ml (C) Dispase II für 30 min bei 37 ° C. Bar, 25 um. Abkürzungen:. Haarfollikel (HF), interfollikulären Epidermis (IFE), Talgdrüsen (SG) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: Visualisierung der ICP0 Expression in ganzen Bergen von Neugeborenen oder Erwachsenen Epidermis Schemata veranschaulicht epidermalen Gesamtpräparate mit Haarfollikel oder die Entwicklung von Haarfollikeln, die die sichtbare Oberfläche der basalen Schicht von Erwachsenen und Neugeborenen Epidermen sind. Epidermale Schichten wurden mit HSV-1 bei etwa 100 PFU / Zelle infiziert und Gesamtpräparate wurden mit gefärbtenAnti-ICP0 (grün) und mit DAPI (blau) bei 3 h pi Als Kontrolle wurden nicht-infizierte epidermalen Gesamtpräparate aus adulten Schwanzhaut nur mit sekundärem Antikörper Nachweis der nicht-spezifische Färbung der Talgdrüsen gefärbt. Bar, 25 um. Abkürzungen: Entwicklungs Haarfollikel (DHF), Haarfollikel (HF), interfollikulären Epidermis (IFE), Talgdrüsen (SG). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 4: Bewertung der Auswirkungen der zellulären Faktoren entweder mit dem Inhibitor MßCD oder Nectin-1- oder HVEM-defizienten Epidermen (A) Epidermal Blatt aus adulten Schwanzhaut von 3 Wochen alten WT-Mäusen (C57BL / 6) wurden mit MßCD vorbehandelt (20 mM) gelöst und mit HSV-1 in infizierten approxirungsweise 100 PFU / Zelle. Als Kontrolle wurden unbehandelte epidermalen Schichten infiziert und epidermalen Schichten mit 35 mM MßCD vorbehandelt wurden mit 500 ug / ml Cholesterin vor der Infektion behandelt. Epidermalen Gesamtpräparate wurden mit Anti-ICP0 (grün) und mit DAPI (blau) in 3 h pi gefärbt, um die Zahl der infizierten Zellen nach Erschöpfung von Cholesterin MßCD Behandlung zu demonstrieren. Wie in 3 gezeigt, ist Färbung von Talgdrüsen (SG) unspezifisch. Abkürzungen: HF (Haarfollikel), IFE (interfollikulären Epidermis), SG (Talgdrüsen). Bar, 150 & mgr; m. (B) Erwachsene Schwanz Epidermen von wt (C57BL / 6), Nectin-1- 23 oder HVEM-defizienten Mäusen 24 (1 Monat alt) wurden bei etwa 100 PFU / Zelle infiziert. Epidermalen Gesamtpräparate wurden mit Anti-ICP0 (grün) und mit DAPI (blau) in 3 h pi (C) Kryoschnitte von epidermalen Blätter von wt (C57BL / 6) oder Nectin-1-defizienten Mäusen 23 wurden bei 18 h pi befleckt Resultate in (B) und (C) gezeigt, werden aus Referenz 10. modifiziert In A, B und C konfokalen Projektionen und fusionierte Bilder angezeigt werden. Bar, 150 & mgr; m (A) und 25 & mgr; m (B, C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wenn epidermalen Schichten der Haut von Erwachsenen aus C57BL / 6 sind mit HSV-1 infiziert bei etwa 100 PFU / Zelle beobachten wir Infektion in fast allen Zellen der Basalschicht der interfollikuläre Epidermis während geringere Virusdosen korrelieren mit weniger infizierten Zellen und einer langsameren Fortschritt der Infektion. Im allgemeinen Haarfollikel zeigen eine variable Anzahl von infizierten Zellen; während die meisten der eher klein Keratinozyten säumen die Entwicklung Haarfollikel infiziert sind, wird nur der Haar Keim der erwachsenen Haarfollikel komplett infiziert. Je nachdem, wie sanft die Trennung der Epidermis durch Dispase II Behandlung erfolgt, Teile der Haarfollikel verloren gehen. In den meisten Fällen werden die Keratinozyten-Schichten zwischen den Talgdrüsen und der interfollikulären Epidermis fehlt und die Schicht entlang der äußeren Haarwurzelscheiden kann gestört werden. In jedem Fall kann das Verfahren der Trennung der Epidermis von der Dermis und der Infektionseffizienz von einem Mausstamm zum anderen variieren ( Zusammengenommen ist die Herausforderung der Ex-vivo-Infektionstest die Vorbereitung und Wartung der epidermalen Schichten. Die Zerbrechlichkeit des Gewebes erfordert eine sehr sorgfältige Handhabung und steuert, wie gut das Gewebe nach der Trennung von der Dermis erhalten. Ein weiteres Problem ist die begrenzte Tragfähigkeit der Platten in der Kultur. Da die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit verschlechtert, sollte die Infektionsversuchen sofort oder mindestens 3 Stunden nach der Herstellung der Folien erfolgen. Zusätzlich zu der Mäusehaut kann epidermalen Schichten auch aus der menschlichen Haut oder Schleimhaut Proben zubereitet. Abhängig von der Natur und der Dicke der Epidermis, hat das Dispasebehandlung angepasst werden. Um den Verlauf der Infektion folgen, ist es am geeignetsten, um infizierte Zellen in Gefrierschnitten sichtbar zu machen. Man muss bedenken, dass mit hoher PFU / Zelle und längere Zeiten der Infektion, die epidermalen Schichten beginnen eine Art von disintegration. Bezogen auf die cytopathische Wirkung Zellen aufrunden und Zell-Zell-Kontakte erhalten gestört. Mit dem 24-Stunden-pi mit 100 PFU / Zelle konnten einige infizierte Basalzellen verloren gehen, was auch auf die Behandlung Dispase II abhängen kann. Mit niedrigeren PFU / Zelle, kann die Infektion Zeiten ohne die zu schweren Gewebeschäden erweitert werden. Alternativ könnte das Ausmaß des Schadens als Marker, wie pathogene verschiedenen Virusstämme verwendet werden. Wir bevorzugen es, infizierten Zellen durch Färbung ICP0 Ausdruck zu visualisieren. Der Vorteil ist eine sehr frühe Erkennung von infizierten Zellen, und auf der Grundlage des ICP0 Färbemuster können Zellen in einem frühen Stadium während der Infektion von denen in einer fortgeschrittenen Phase unterschieden werden. Alternativ können infizierte Zellen durch Anfärben Expression anderer frühen Gene, wie der virale Kapsidprotein VP5 und das virale Hüllprotein gD visualisiert werden. Wir haben auch versucht, eingehende Viruspartikel vor der viralen Genexpression entweder durch inf visualisierenReflexion mit GFP-markierten HSV-1 oder durch Färbung Kapside in festen Proben. Nach unserer Erfahrung ist das Muster der GFP-Fluoreszenz oder das Färbemuster in Gewebeschnitten zu komplex sind, um das Vorhandensein von internalisierten Viruspartikel zeigen deutlich. Alternativ können Viruspartikel durch Elektronenmikroskopie, visualisiert, wenn hohe Virustiter von ~ 1.000 werden - 1.500 PFU / Zelle eingesetzt werden. Bei geringeren Virusdosis können Viruspartikel kaum erkannt werden. Statt Visualisierung infizierten Zellen in intakten epidermalen Schichten Die Epidermis kann dissoziiert werden, um RNA-Werte zu analysieren oder zu quantifizieren, die Anzahl der Zellen mit Oberflächen cytoplasmatische oder nukleare Expression von Genen von Interesse durch FACS-Analyse. Wir vermuten, dass ex vivo Infektion Protokoll kann zumindest auf diejenigen Viren, die dafür bekannt sind, Basalkeratinocyten infizieren angepasst werden.
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Acknowledgments
Wir danken Peter Staeheli zur Bereitstellung B6.A2G-Mx1 Mäusen und Semra Özcelik für technische Beratung.
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft über SFB829 und KN536 / 16 und der Köln Fortune-Programm / der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
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