Introduction
Ultralyd henviser til enhver oscillerende lydtryk bølge med en frekvens større end den øvre grænse af humane auditive kapaciteter (~ 20 kHz) 1. Lavfrekvente ultralyd i 20-60 kHz er blevet anvendt i laboratoriet som et middel til emulsioner, forberedelse celleprøver for nukleinsyre ekstraktion, for vævsødelæggelse, og for en række andre tests. Anvendeligheden af lavfrekvente ultralyd er også blevet udvidet til den industrielle indstilling for svejsning, rensning af forskellige materialer, og i materialer forarbejdning. Kommercielt tilgængelige ultralyd generatorer kommer i frekvenser spænder fra 18 til 60 kHz, og fuld-skala wattager fra 100-1,200 W.
Selv om ultralyd længe har været anvendt i kliniske omgivelser til diagnostisk billeddannelse, er det blevet anvendt som et terapeutisk modalitet for nylig. Ultralyd ≥1 MHz er i stand til sikkert forstyrre urinvejssten (nyresten) og biliær calculi (sten i the galdeblæren eller leveren) i patienter for at reducere symptomerne 2,3. Denne fremgangsmåde er kendt som ekstrakorporal chokbølge litotripsi (ESWL) er nu almindeligt anvendt i klinikken (mere end en million patienter behandles årligt med ESWL i USA alene 4), og tilbyder en modalitet, som til ikke-invasivt bryde op calculi med minimal sikkerhedsstillelse skader ved brug af eksternt påført, fokuseret, høj intensitet akustiske impulser 2-4.
På grund af de unikke direkte forskydningskræfter, samt kavitationsbobler genereret af høj intensitet ultralyd, er disse metoder blevet undersøgt i cancer terapi til behandling af kastrationsresistent prostata carcinom og pancreas adenocarcinom i en tilgang kendt som høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU ) 5-8. På en måde meget lig ESWL bruger HIFU flere ultralyd bjælker og fokuserer dem på et udvalgt fokusområde at generere temperaturer på 60 ° C eller HIGhende gennem brug af akustisk energi, inducere koagulerede nekrose i målvævet 5. Selv om andre retningslinjer for termisk ablation øjeblikket findes (radiofrekvens ablation og mikrobølgeovn ablation), HIFU tilbyder en klar fordel i forhold disse metoder i, at det er den eneste ikke-invasiv hypertermisk modalitet 5. HIFU har opnået blandede resultater i klinikken og er i øjeblikket kun tilgængelig i kliniske forsøg 8-11. Ikke desto mindre har den begrænset succes, den har opnået, og den meget lovende in vivo data indhentet fra prækliniske pattedyr modeller demonstreret potentialet i ultralyd i kræftbehandling.
I et forsøg på at forbedre HIFU har forskere forsøgt at kombinere ultralyd med passende antineoplastiske midler til at generere en form for sonochemotherapy. Sonodynamic terapi (SDT) er en lovende ny behandling modalitet som har påvist imponerende antineoplastisk aktivitet i både in vitro og
Vi har tidligere vist, at U937 humane monocytiske leukæmiceller er følsomme over for lavfrekvente ultralyd (23,5 kHz), og at denne følsomhed kan markant forøget ved anvendelse af antineoplastiske midler, som forstyrrer cytoskelettet 15. Vi har desuden vist, at celler fortrinsvis er beskadiget baseret på størrelse, med større celler, der udviser højere ultralyd følsomhed. Desuden normale humane hæmatopoietiske stamceller (hHSC'er) og leukocytter ved sammenlignelig cellestørrelser er meget mere modstandsdygtige over for lydbehandling end deres neoplastiske modstykker 15, forsøgsvis antyder, at lavfrekvente ultralyd kan anvendes til fortrinsvis at ødelægge maligne celler i nærvær af normalt væv.
For yderligere at undersøge den unikke properties af lavfrekvent ultralyd til potentiel terapeutisk brug, har vi udviklet rengørings- og stabilisering procedurer for at øge effektiviteten og pålideligheden af en af vores nuværende sonikering systemer Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Cell Disrupter, er udstyret med en 20 mm horn monteret ind i en 7,62 cm kop. Derudover har vi været i stand til at bestemme nøjagtige prøve kavitation energier, samt konsistente kurver og amplitude inden for 40 kHz ved anvendelse af en kavitation meter og oscilloskop med hydrofon. Ved raffinering og systematisere vores protokoller, har vi været i stand til at etablere konsistens i vores eksperimentelle sonications, tillader os at kvantitativt sammenligne de soniske følsomhed neoplastiske og normale celler af forskellige histogenetic afstamninger. Vores protokol til 40 kHz-system præsenteres i omfattende detaljer, for at interesserede laboratorier til at være i stand til at udføre sammenlignelige eksperimenter, og vurdere vores resultater i de antineoplastiske virkninger fremkaldt aflavfrekvente ultralyd. Desuden undersøger vi den dosis-afhængige effekter af methyl-β-cyclodextrin (MeβCD, figur 1), en kolesterol-nedbrydende middel, om at øge ultralyd følsomhed U937 og THP1 humane monocytiske leukæmiceller.
Protocol
1. Rengøring Cell Sonifier System
- Rengør union mellem hornet og omformer ved hjælp af chloroform og en vatpind af bomuld. Påfør en let olie eller mineralsk olie til gevindet på hornet og konverteren for yderligere at fjerne ophobning af metalspåner, rust eller oxidering.
- Brug chloroform for at fjerne olie og andre forurenende stoffer fra EU efter aftørring tråde med olie.
2. Samling af Cell Sonifier og Opsætning af systemet
- Sæt hornet til konverteren. Til korrekt drejningsmoment systemet, fjernes samlet konverteren og horn fra bægeret samling ved at trække hornet ud af bunden af koppen (figur 2A). Placer en slids skruenøgle inde i en af de tre små huller nær toppen af konverteren (figur 2B). Derefter placere et drejningsmoment-skruenøgle udstyret med en ½ tomme krage fod på den opslidsede del af hornet (figur 2B). Spænd i standard uret, indtil drejningsmoment måleren læser 54,23 N. m (Figur 2C), momentet af fabrikanten anbefalede 16. Monter strammet konverter og horn tilbage i koppen, og monter hornet og omformer til en ring stå i oprejst stilling. Sæt konverteren til strømforsyningen, før du indstiller systemet til eksperimentel puls dosering.
- Indstil systemet til puls dosering hjælp 1 sek af lydbehandling med 1 sek mellem impulser. Forskellige dosering modeller kan anvendes til andre forsøgsbetingelser. Mange variabler, såsom vand volumen og horn diameter ville potentielt kræve ændringer i denne dosering. Brug af førnævnte celle prøvetyper, volumen og koncentration, er empirisk data og observation førte til formuleringen af denne dosering.
- Tilpasse systemet til den ønskede amplitude. I denne protokol, bruge 33% og 50% amplitude til at forhindre fuldstændig destruktion celle, hvilket ville gøre effekten af sonosensitizers vanskeligt eller umuligt at måle.
BEMÆRK: I denne undersøgelse amplituderne sammenlignes.
3. Vurdering System Intensitet og funktion
- Hold kavitation meter på 1,5 cm, hvilket er niveauet af prøven lydbehandling. Bemærk aflæsningerne til at vurdere, at systemet kører på en forventet intensitet. Ved hjælp af de nuværende system og vandstand, forventer mellem 100-110 W / cm 2 for 33% amplitude og 115-125 W / cm 2 for 50% amplitude. Bemærk kavitation måleraflæsninger fra apparatets display som repræsenterer kavitation energi i W / cm2 direkte. Tag disse aflæsninger på overfladen af vandet, og sikre, at ingen bobler er til stede på forsiden af målere sonden.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at disse procedurer er gjort uden hætten for adgang over hornet. De behøver ikke blive gentaget efter hver sonikering. I stedet bør de kun udføres efter rengøring, genmontering, og opsætning af systemet. Placer hydrofon i en prøve hætteglas indeholdende 12,5 ml vand for fuldt ud at fordybe hydrofonføleren. Suspender hydrofon med ringen stativ. - Fastgør hydrofon til indgangen af oscilloskopet for at vurdere bølgeform karakteristika. Undersøg oscilloskopet for en klar sinusbølge, som afvigende bølger kan ændre den hyppighed systemet fra fabrikantens specifikationer. Både kavitation måleren og oscilloskop giver en frekvens læsning, men kun oscilloskopet vil vise afvigende bølger, der er betegnende for en defekt system eller forkert montering.
4. Fremstilling af celler og Medium
- Forbered mediet ved hjælp af 240 ml Iscoves Modified Dubecco Medium (IMDM) og 50 ml føtalt bovint serum. Ikke tø føtalt bovint serum i et varmt vandbad, som en hurtig stigning i temperaturen kan føre til et kompromis i serum stabilitet. Kombiner 240 pi gentamicin 50 mg / ml og 5 ml penicillin/ Streptomycin 100x i en standard kultur-kolbe, og der tilsættes til mediet. Opbevar ved 4 ° C.
- Frø U937 celler ved ~ 4 x 10 4 celler / ml i en 25 cm2 kolbe det klargjorte medium. Vurdere celler til koncentration og levedygtighed under anvendelse af en TC20 celletæller og trypanblåteksklusion ved at placere 15-20 pi af celler og 15-20 pi trypanblåt i et mikro-centrifugerør og blande indholdet. Pipette15-20 pi af denne blanding i en TC20 sampling dias, og initiere tæller ved at placere dias i TC20 celletæller.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2, og tjek for cellelevedygtighed under anvendelse trypanblåteksklusion og TC20 celletæller. Når cellerne er i en passende koncentration og / eller er blevet behandlet med sonosensitizers for en passende tidsramme, overførsel 3 ml celler fra kulturen kolben til et 20 ml glasscintillationshætteglas. I denne protokol, dyrke U937-celler i 48 timer, og derefter behandle med 0,5, 1,eller 5 mM MeβCD i 30 min til tilstrækkelig nedbryder kolesterol af celler før sonikering.
5. Cell Sonikering
- Afgasse deioniseret, destilleret vand under anvendelse af et vakuum, og Buchner-kolbe. Overføre vandet til bægeret horn, og fyld op til et niveau på 15 mm over toppen af hornet. Sonication proces medfører yderligere afgasning af vand i en periode på nogle få minutter, og kan føre til uoverensstemmelser i løbet af forsøget, hvis systemet ikke køres før prøve sonikering. Derfor køre systemet for ~ 7 min før at prøve lydbehandling.
- Fastgør scintillationshætteglas indeholdende cellerne til holdeindretningen. Derefter lægger holdeindretningen til toppen af koppen horn og indstillet til en højde af 15 mm fra toppen af hornet (ved vandoverfladen ved hjælp af glidende mekanisme).
- Cellerne er typisk sonikeret under anvendelse af tre 1 sec impulser af ultralyd, med 1 sek afstand mellem hver af disse impulser. For detprotokol, soniker celler ved 33% og 50% amplitude ved hjælp af ovennævnte puls dosering.
6. Vurdering Celler til Damage Post-lydbehandling
- Vurdere de suspenderede celler for skader og levedygtighed under anvendelse af trypanblåt og TC20 celletæller. Desuden analysere prøven under anvendelse af en Z2 tæller. For Z2 tæller analyse, afpipetteres en 100 pi cellesuspension i 20 ml isotonisk saltvand (200: 1 forhold). Før analyse skylle åbningen i Z2 partikelanalysator mindst to gange ved anvendelse af isotonisk saltvand. Placer Z2 prøve i tælleren holder, og hæv platformen til åbningen inden den indleder tæller.
- Erhverve de data fra TC20 og Z2 tællere bruger software leveret af producenten. Analysere disse data til celleskader, levedygtighed, og oprettelsen af celleaffald fra lydbehandling.
7. XTT Assay til Bestem Cell Levedygtighed og Mitochondrial aktivitet af behandlede U937 og THP1 Cells
- Prior til XTT assays, vokser U937 og THP1 celler under de samme betingelser. Forbehandle celler med samme koncentrationsområde på MeβCD i 30 minutter forud for sonikering. Brug de samme ultralyd parametre som før, bortset fra at cellerne nu sonikeres ved hjælp af en vifte af 1-3 én sec pulser afstand ét sek fra hinanden for at udvikle en række skader til XTT kit til at vurdere.
Bemærk: Mange af disse trin er taget direkte fra XTT kit manual og kun gentages for den bekvemmelighed af interesserede laboratorier. - Indsamle cellerne ved centrifugering ved 200 x g i 10 min. Resuspender cellepelleten i vækstmediet tidligere beskrevet. Resuspender celler ved ~ 1 x 10 5 celler / ml. Seed U937-celler ved 100 pi per brønd i en fladbundet 96-brønds mikrotiterplade i tre eksemplarer, og derefter gentag for THP1-celler under anvendelse af en separat plade med 96 brønde. Omfatter 3 kontrol brønde indeholdende 100 ul komplet vækstmedium alene som tomme absorbanslæsninger. Derefter inkuberes de inokulerede plader i 24 timer.
- Afrimning to portioner af XTT reagens og aktivering reagens ved 37 ° C før brug. Swirl portioner forsigtigt, indtil klare opløsninger opnås. Tilsættes 0,1 ml af aktiveringspeptidet reagens til 5,0 ml af XTT-reagens, som danner nok aktiveret XTT opløsning til en 96-brønds mikrotiterplade-assay. Gentag processen for den anden plade.
- Der tilsættes 50 pi af den aktiverede-XTT-opløsning til hver brønd. Returnere pladen til cellekulturen CO2-inkubator i 2 timer. Ryst pladen forsigtigt efter inkubationsperioden for at fordele den orange farve i de positive brønde. Absorbansen af de assay-brønde, der indeholder celler og datoer baggrund kontrolbrønde ved en bølgelængde mellem 450-500 nm bølgelængde under anvendelse af en mikrotiterpladelæser.
- Enten nul mikrotiterpladelæser bruge de tomme kontrolbrønde eller trække deres gennemsnitlige værdi fra de konkrete resultater. Absorbansen af alle assaybrønde igen på et wavelength mellem 630-690 nm og trække værdierne fra 450-500 nm opnåede værdier. Bemærk: Denne anden absorbans beslutsomhed hjælper med at fjerne ikke-specifikke aflæsninger fra analyseresultaterne. XTT-assayet blev gentaget fire gange for begge cellelinier.
Representative Results
System stabilitet er altafgørende at opnå reproducerbare og pålidelige resultater. Den korrekte drejningsmoment specifikation af 54,23 N. M opnået korrekt kobling af transduceren og sonotrode 2, med konsistensen af bølgeform, der vurderes ved hjælp af et oscilloskop og hydrofon (figur 3A). Figur 3B afbilder målinger inde i hætteglasset prøven, og Figur 3C vurderer stabilitet inde i hætten horn. Som forventet blev amplituden svagt reduceret på grund af noget energi absorberes af glasset. Imidlertid blev bølgeform ikke forstyrres eller forvrænget i enten panel B eller C, som er nødvendig for pålidelig levering af sonisk energi til prøven. En bølgeform, der ikke vises som en klar ental sinusbølge indikerer en defekt transducer eller forkert opsætning. Dette er udtrykt i figur 3D, som viser flere afvigende bølger, en klar mangel på en sinusbølge, og en frekvens læsning nejt forventet med et velfungerende system. Kavitation meter anvendes til at måle kavitation energi, der genereres (figur 4) fandt lyden intensitet til at være 100-110 W / cm2 ved 33% amplitude og 125-130 W / cm2 ved 50% amplitude.
Når 40 kHz systemet blev behørigt kalibreret og samlet i sin helhed (figur 5), blev pålidelig celledestruktion let nås, som bestemt af både TC20 og Z2 tællere (Figur 6). Som forventet blev mere omfattende celleskader observeret i cellepopulationer sonikeret ved 50%, snarere end ved 33% amplitude. , 33% amplitude er alligevel anvendelig som udgangspunkt til at opdage potentielle sonic sensibiliserende virkninger af administrerede midler, da det producerer mærkbar skade, men giver plads til mere skade skal opdages, når agenter anvendes til at vurdere deres potensering af ultralyd følsomhed. Dette påvises i figur 7A, hvordosisafhængige virkninger af MeβCD på potensere det ultrasoniske følsomhed U937-celler er præsenteret. Selvom ikke-sonikerede MeβCD-behandlede celler var meget ens i levedygtighed på ikke-sonikeret, ubehandlede celler, levedygtigheden faldt markant efter tre pulser af 1 sek 40 kHz ultralyd blev anvendt. Desuden faldet i levedygtigheden efter lydbehandling synes at have været dosisafhængig, som 5 mM MeβCD produceret det største fald i celletal, efterfulgt af 1 mM, og derefter 0,5 mM MeβCD.
Lignende virkninger på cellernes levedygtighed og mitokondriel aktivitet blev observeret i både U937 og THP1-celler, som var behandlet med varierende koncentrationer af MeβCD før lydbehandling, som vurderet med XTT kittet (figur 7B). Selvom THP1-celler synes at være lidt mere sonic modstandsdygtig end U937 celler, både humane leukæmi linjer beskadiget på en dosisafhængig måde. Højere koncentrationer af MeβCD og flere pulser af ultralyd produced den laveste reduktion af XTT til et opløseligt, brogede appelsin derivat for både U937 og THP1-celler, svarende til lavere cellelevedygtighed og mitokondriel aktivitet.
Figur 1. Molekylær struktur af methyl- β-cyclodextrin. (A) Komplet struktur af methyl-β-cyclodextrin (MeβCD). (B) MeβCD er en polymer af syv gentagelsesenheder med en R-gruppe af enten H eller CH3. Molekylær Formel: C 56 H 98 O 35. Molecular Weight = 1331,36.
Figur 2. Korrekt nde 40 kHz ultralydssystemet. (A) Hornet og konverteren fjernes fra bægeret prieller til at nde. (B) Placer slot skruenøgle og momentnøgle på deres respektive holdninger. (C) Apply 54,23 N. M af drejningsmoment i urets retning, inden genmonteres hornet og omformer til koppen.
Figur 3. Anvendelse af et oscilloskop til at karakterisere bølgeformen af ultralyds-system. (A) et oscilloskop med hydrofon kan anvendes til at evaluere amplitude og bølgeform konsistens. (B) En optagelse taget med koppen direkte over hornet på 1,5 cm og fastsat til 33% amplitude. (C) bølgeform afbilledet her er fra en læsning erhvervet når hydrofonføleren placeres i 20 ml glasscintillationshætteglas. Hætteglasset er placeret ved 1,5 cm over hornet og igen sat til 33% amplitude. (D) En oscilloskop screenshot ofa-system med afvigende frekvenser som ville forventes med en defekt system eller forkert kobling af hornet konverter union. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Anvendelse af en kavitation meter for at karakterisere lydstyrken af det ultrasoniske system. Den kavitation meter ses her anvendes til at repræsentere kavitation energi i W / cm2. Dette er et meget vigtigt instrument til at vurdere sammenhængen af energi i forhold til prøven.
Figur 5. De vigtigste komponenter i 40 kHz ultralyd system. Er den ultralyd viste system komplet med kop horn (
Figur 6. Virkning af forskellige niveauer af amplitude på det ultrasoniske lyse af U937 celler med TC20 og Z2 tællere. Celler blev sonikeret med 40 kHz celle Dismembrator ved 33% amplitude (100-110 W / cm2) eller 50% amplitude (125-130 W / cm2) ved anvendelse af tre 1 sec impulser af ultralyd, med 1 sek afstand i mellem hver af disse impulser. (A) Et skærmbillede fra Z2 tæller softwaren viser virkningen af sonikering på U937-celler. (B) af data fra TC20 tælleren blev samlet i en graf til at demonstrere reproducerbarheden af resultatets. Disse data omfatter totalt og levende celletal samt trypanblåt vurderede cellelevedygtighed. Barer afspejler standardfejlen af middelværdien (SEM) til 4 uafhængige cellepopulationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Virkninger af methyl- β-cyclodextrin på potensere det ultrasoniske følsomhed U937 og THP1-celler. (A) U937-celler blev behandlet med varierende koncentration af MeβCD i 30 minutter forud for at blive sonikeret med 40 kHz ultralyd (105 W / cm2 ) under anvendelse af tre 1 sec pulser adskilt 1 sek hinanden. Cellepopulationer blev grupperet i ≥12 um og ≥17 um. (B) U937 eller THP1-celler blev igen behandlet med varierende concentrationer af MeβCD i 30 minutter, inden de blev sonikeret med 40 kHz-system under anvendelse af 1-3 impulser af 1 sek ultralyd afstand 1 sek hinanden. Cellelevedygtighed og mitokondriel aktivitet blev vurderet med XTT kittet. 100 pi celler blev udsået per brønd i en fladbundet 96-brønds mikrotiterplade. Pladen blev inkuberet i 24 timer før tilsætningen af XTT-opløsning. Celler blev derefter inkuberet i yderligere 2 timer, før bølgelængde blev aflæst. Barer afspejler SEM for 4 uafhængige cellepopulationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
For at opnå optimale resultater, skal der tages særlig omhu for at omhyggeligt placere prøven og rengør omformer-horn union. Placeringen af prøven i hornet er vigtig for at opnå ensartet destruktion celle, som vil ændre ændre afstanden fra hornet den akustiske foci, og derfor ændrer energien prøven udsættes for. Den akustiske energi inde i hætten horn kan kortlægges ved hjælp af kavitation måleren til at finde positionen med maksimal kavitation. Hertil kommer, at kavitation meter, sammen med oscilloskopet er afgørende for bestemmelse af lydintensitet cellerne bliver udsat for, samt homogeniteten af bølgeformen. Derfor bør disse instrumenter anvendes til at detektere problemer med systemet, og hjælpe med at bestemme, hvad fejlmelding kan være nødvendig for at korrigere systemet ustabilt.
Som tidligere nævnt kan den lavfrekvente systemet virke til yderligere afgasse vandet under hele eksperimentet, hvis ikke køre foradskillige minutter før prøve sonikering. Denne første kørsel skal udføres til opnåelse af en relativt afgasset sonikering medium og dermed ensartede resultater ved forsøg. Desuden bør celler ikke sonikeret ved eller nær den maksimale amplitude ved vurderingen af effektiviteten af sonosensitizers, som det sande omfang af overfølsomhed ville være vanskeligt at vurdere. Ved hjælp af 33% amplitude på 40 kHz-system er en ideel ramme, da det producerer bemærkelsesværdige skader, men giver sonosensitizers rigelig plads til at demonstrere deres effektivitet, som påvist med MeβCD mod U937 og THP1 celler (figur 7). Disse data bekræfter også, at MeβCD sensibiliserer flere leukæmi linjer til lavfrekvente ultralyd på en dosisafhængig måde.
Der har været en række forsøg gennemført med højere frekvens i området fra 0,75 MHz til 8 MHz, der viser tegn på intramembrane kavitationsbobler, der genereres gennem lydbehandling 17-19. Dog questions stadig i forhold til den nøjagtige mekanisme af ultralyd-induceret cellelysis 18. Vi har vist en sammenhæng mellem fluidiserende cytoskelettet og øget sonic sensitiviteten med ultralyd 15, et fænomen påvist af andre laboratorier 20, lav 21. Derudover har vi fundet, at Microfilament forstyrrelser, såsom cytochalasin B potensere ultralyd følsomhed i flere leukæmi linjer, men ikke hHSC'er eller leukocytter 22, hvilket indikerer, at inhibering af actin-polymerisation kan være en sonosensitizing mekanisme af særlig interesse. Vi har også observeret, at vincristin, en mikrotubulus-forstyrrende middel, der inhiberer tubulin polymerisering 23, 24, øger markant den ultrasoniske følsomhed forskellige leukæmi typer in vitro herunder akut myeloid leukæmi, kronisk myeloid leukæmi og akut lymfoid leukæmi. Derimod cytoskeletale-rettet midler, som stabiliserer cytoskeletale komponenter (paclitaxel end jasplakinolid) ser ud til at gøre celler resistente over for lydbehandling, afspejles i lavere cellelysis 22. Samlet set viser disse data understøtter den hypotese, at fluidisering af cytoskeletale komponenter af neoplastiske celler er faktisk en vigtig faktor i at øge effektiviteten af SDT 25. Den foreliggende undersøgelse viser også, at cholesterol udtømning kan være en anden metode til at yderligere forstærke den ultrasoniske følsomhed af neoplastiske celler, som MeβCD-behandlede U937-celler markant sensibiliseres til 40 kHz ultralyd.
Mens vores sonikering protokoller har vist markant antineoplastisk aktivitet in vitro, er den nuværende metode begrænset til arbejde i kultur og små hvirveldyr modeller, der er i stand til at passe i hætteglassene, der anvendes til lydbehandling. Vi har vist, at zebrafisk kan sikkert sonikeret under anvendelse pulseret lavfrekvent ultralyd (20 kHz), og at deres tolerance over for kemoterapeutiske midler er kvantitativt sammenlignelig meddoser tolereres af murine modeller 26, hvilket antyder, at tumor-bærende zebrafisk kan anvendes i indledende undersøgelser for at vurdere in vivo antineoplastiske aktivitet af disse protokoller. Alligevel indgivelse kemoterapeutiske midler før sonication af mammale modeller er blevet rapporteret i MHz-området 1, og sådanne protokoller kan sandsynligvis blive udvidet til at optage lavfrekvente ultralyd, samt kolesterol-depletterende og cytoskelet-rettet midler.
Potentielle kliniske anvendelser af denne form for SDT kan involvere ekstrakorporal blod lydbehandling, hvor antineoplastiske midler indgives intravenøst (iv) før blodet fjernes for lydbehandling 25. Denne metode fjerner potentielle hindringer lyd i forbindelse med den menneskelige anatomi, og kan være en effektiv måde at ødelægge leukæmiske blaster, samt metastaser fra solide tumorer. Det er også muligt at cholesterol-depletterende og cytoskelet-rettet midler kunneanvendes i HIFU-protokoller, der allerede er til behandling i klinikken i et forsøg på at forbedre effektiviteten af denne behandling modalitet.
De er beskrevet i den foreliggende undersøgelse metoder er i stand til at vurdere værdien af potentielle sonosensitizers, og yderligere system finjustering kan forbedre dette værktøj. Men der er mange variabler, der skal overvejes, når der benyttes ultrasoniske anordninger, herunder strømforsyning kvalitet, akustisk foci, og individuel variation blandt omformere. Derfor vil den fremtidige forskning fokusere på at visualisere lydbølger og forstå deres indflydelse på resultater. SDT har vist at forøge celle lysis in vitro og kan vise sig at være klinisk levedygtigt hvis mere in vivo data i mammale modeller erhverves. Forsøg undersøger andre potentielt udnyttelige egenskaber ved maligne celler, såvel som forskellige kombinerede modaliteter involverer flere midler og ultralyd fortsætte i vores laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes | Life Technologies | 12440079 | |
| Amphotericin B Solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Life Technologies | 10378-016 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12105 | |
| Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn | Branson Ultrasonics | 101-063-726 | sonication device |
| Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater | Brisk Heat | SDCJF1A-GBH1000-1 | heater used for temperature control |
| Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software | Beckman-Coulter | 6605700 | |
| Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks | Fisher Scientific | 353082 | |
| Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl | Lonza | 17-605C | |
| Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps | Beckman-Coulter | A35473 | |
| AccuJet Pro Auto Pipet | BrandTech Scientific | 26330 | |
| USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets | USA Scientific | 1071-0810 | |
| Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips | USA Scientific | 1120-1840, 1126-7810 | |
| 100 μl Micropipette | Wheaton | 851164 | |
| 1,000 μl Micropipette | Wheaton | 851168 | |
| BioRad Dual Chamber Counting Slides | Bio-Rad | 145-0015 | |
| Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator | Forma Scientific | 3131 | |
| Tektronix DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO2002B | used to measure the ultrasonic waveform |
| PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter | PPB Megasonics | PB-500 | used to assess the sound intensity in W/cm2 |
| Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone | Teledyne | TC4013-1 | connects to the oscilloscope |
| Wheaton 250 ml Flasks | Sigma-Aldrich | Z364827 | |
| 20 ml Glass Scintillation Vials | Sigma-Aldrich | Z190527 | |
| Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution | Beckman-Coulter | N/A | diluent for Z2 counter |
| Chloroform 99% | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol 200 Proof Anhydrous | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Mineral Oil | N/A | ||
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | ATCC | 30-1011K | |
| 96-Well Microplate Reader | Cole-Palmer | EW-13055-54 | |
| U937 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | CRL1593.2 | |
| THP1 Human Monocytic Leukemia Cells | ATCC | TIB-202 |
References
- Trendowski, M.
- Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).
- Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).
- McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).
- Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).
- Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).
- Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).
- Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).
- Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).
- So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).
- Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).
- Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
- Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).
- Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).
- Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).
- Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. , Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
- Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).
- Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).
- Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).
- Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).
- Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11 (95), 20140071 (2014).
- Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
- Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).
- Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).
- Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
- Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).
