Bioengineering

Твердые липидов Наночастицы (SLNS) для внутриклеточного Ориентация Приложения

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Средств его доставки на основе наночастиц показали большие перспективы для внутриклеточных нацеленных приложений, обеспечивая механизм специально изменить сотовой сигнализации и экспрессию генов. Эти транспортные средства могут быть загружены с препаратами, белков и нуклеиновых кислот, предназначенных для воздействия клеточных ответов и достичь желаемого эффекта в тканях-мишенях. Многие типы наноносителей были исследованы на терапевтического и диагностического пользу в том числе липидов, полимеров, кремний и магнитных материалов. Эти системы являются привлекательными из-за их потенциала для локализованной доставки лекарств, повышения терапевтической концентрации в тканях-мишенях, и снижение системной токсичности.

Твердые липидные наночастицы (SLNS) являются хорошо изученным примером системы доставки наночастиц, которая возникла в качестве перспективного средства доставки лекарственных в последние годы. SLNS может быть легко сформулированы для нескольких приложений, включая био-зондирования ^{1, 2,} косметики и тЛечебно доставка ^3-7. Их полезность проистекает из того факта, что они полностью состоит из рассасывающихся, нетоксичных липидов, что приводит к усилению биосовместимости. Во время синтеза, липофильных лекарственных средств могут быть включены в SLn транспортных средств, тем самым увеличивая растворимость лекарственного и пригодность для парентерального введения. SLN транспортные средства также помогают стабилизировать инкапсулированные терапии, уменьшая их деградации и оформление, и максимизации терапевтического действия. Эти транспортные средства, особенно хорошо подходит для длительного действия с контролируемым высвобождением препаратов из-за их стабильности при температуре тела ^3,4,8,9. Важно отметить, что инкапсуляция наркотиков в липидных наночастиц изменяет внутренние Фармакокинетические профили молекул наркотиков. Это обеспечивает потенциальное преимущество, позволяя контролируемое высвобождение лекарств с узким терапевтическим индексом. Скорость высвобождения SLn-терапии включены могут быть настроены на основе скорости деградации липидов или скорости диффузии лекарственного средства влипидов матрица.

SLNS часто инженерии накапливаться в тканях-мишенях конкретных. Например, их размер (как правило, больше, чем 10 нм) потенцирует удержание в обращении, где вытекающей сосудистая опухолевой ткани облегчает осаждение. Кроме того, путь введения частиц, как было показано изменить биораспределение с потенциалом для решения конкретных физиологических структур, таких как лимфатические узлы ^10,11. По отложения в тканях-мишенях, достижения соответствующих клеточных взаимодействий и возможной интернализации наночастиц является сложной задачей из-за способности клеточных мембран для селективного управления потоком ионов и молекул в и из клетки ^12. Для облегчения клеточное поглощение, можно изменить наноносителей с специфическими лигандами, включая пептиды, небольшие молекулы, и моноклональных антител ^13,14. Некоторые механизмы, включая как пассивного проникновения и активного транспорта наночастицчерез клеточную мембрану были описаны ранее ^3,12,15. В общем, было продемонстрировано, что клетки-наночастиц взаимодействия зависит от физико-химических свойств наночастиц в том числе размер, форма, поверхностный заряд и поверхностной химии, в дополнение к параметрам соты, таких как тип клеток или фазе клеточного цикла ^12.

Предыдущая исследования показали, синтез суб-10 нм SLNS для местного и ¹⁶ биомаркеров приложений обнаружения ¹ с использованием метода ¹⁷ температура обращения фаз (PIT). Это нежный метод синтеза, где ² композиция остается постоянной, пока температура постепенно изменяется. Непрерывное перемешивание нагретого раствора, при охлаждении результатам RT в наноэмульсии. Этот процесс приводит к синтезу SLNS с меньшим размером частиц, чем ¹ сообщалось ранее, используя различные методы синтеза липидов нанoparticles ^17-22. Полученную фактический размер менее 20 нм, обеспечивает преимущество для нацеливания внутриклеточных применения благодаря увеличенной площади поверхности и возможности для обеспечения клеточных взаимодействий.

Схема SLNS, предназначен для доставки флуоресцентного красителя или терапевтического, показан на рисунке 1. В SLNS состоят из липидов внутреннего (например, линейные алканов), что позволяет включение липофильных соединений (например, красителей или терапевтических) и поверхностно-активного вещества внешней (например, линейные неионное ПАВ) окружен водой. В этом исследовании, были загружены SLNS флуоресцентным красителем и использовали в качестве модели для исследования частиц клеточных взаимодействий. Первичные фибробласты кожи человека и мыши дендритные клетки подвергали воздействию красителя загружены SLN с течением времени для того, чтобы охарактеризовать взаимодействие по отношению к токсичности и поглощение частиц. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-diphenylphenyltetrazolium бромид (МТТ) был Utiliзет, чтобы установить соответствующие уровни дозировки. Флуоресцентная микроскопия и проточной цитометрии было два методы, используемые для изучения поглощения частиц в пробирке.

фигура 1
Рисунок 1. Схема СЛН показывающую основные компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Обработка SLNS

Синтез SLNS
Примечание: Используйте метод PIT ^1,17,20 подготовить нм SLNS ¹ суб-20.
1. Используйте асептики, биореагентов или культуры клеток реагенты класса, и стерильные материалы (например, пипетки, шпатели, флаконы и т.д.).
2. Используйте шкаф биобезопасности для синтеза SLNS (рис 2).
3. Смешайте 0,6 мг флуоресцентного красителя (нильский красный (NIR), концентрация НИР примерно 0,3 мг / мл) и 0,10 г Heneicosane (липидный, 5 вес / вес% липидов концентрации) в пробирку (15 мл), со-расплава при 90 ° С, и размешать.
4. Добавить 0,11 г полиоксиэтилен (10) олеиловый эфир (поверхностно-активное вещество, 5,5 вес / вес% поверхностно-активного вещества концентрации). Полученную смесь CO-расплава при температуре 90 ° С и перемешивают.
5. Добавить 1,79 г стерильной воды к смеси, тепловой до 90 ° С, и перемешать до прозрачного наноэмульсия не образуется.
  Примечание: В продолжение перемешивания и регулируемого охлаждения, SLNs создаются. Эти условия вызывают инверсию эмульсии вода-в-масле в эмульсию масло-в-воде. Липофильные молекулы, такие как Нир раздела в липидных капель.
6. Приготовьте наноэмульсии параллельно без добавления флуоресцентного красителя, чтобы служить в качестве контрольного образца. Смешайте 0,10 г Heneicosane и 0,11 г полиоксиэтилен (10) олеиловый эфир во флакон (15 мл) со-расплава при температуре 90 ° С и перемешивают.
  1. Добавить 1,79 г стерильной воды к смеси, тепловой до 90 ° С, и перемешать до прозрачного наноэмульсия не образуется.
7. Кроме того стерилизации каждый наноэмульсии используя стерильный фильтр 0,2 мкм.
Рисунок 2. Схема синтеза SLNS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Размер частиц и Полydispersity
1. Используйте динамического рассеяния света (DLS) для измерения размера частиц и полидисперсности SLNS ¹ с использованием стекла кюветы и инструмент предназначен для измерения размера частиц.
2. Перед проведением измерений образцов, измерения размеров частиц двух известных стандартов в соответствии с протоколом производителя для стандартов подготовки и измерения.
3. Заполните стеклянную кювету с 1,5 мл стандартного раствора и измеряют стандартный раствор с использованием тех же условий измерения, как образцы.
  Примечание: Предыдущая шаг повторяется для каждого стандарта.
4. Измерьте образцы подготовленный. Для каждого, использовать следующие экспериментальные параметры: время пробега 100 сек, преломления воды (1.33), вязкость воды при 20 ° C (1,002 мПа · сек).
  Примечание: Этот метод использует частоты сдвигается свет для измерения размеров наночастиц.
5. Сообщить средний диаметр частиц и полидисперсность ПартиейРаспределение размера НКУ.
Точка плавления и скрытой теплоты плавления
1. Используйте дифференциальный сканирующий калориметр (DSC), оснащенного автоматической пипетки и источника охлаждения жидким азотом, чтобы исследовать термическое поведение SLNS ^1.
2. Внесите в подготовленные SLNS в 40 мкл алюминиевую кастрюлю с массой примерно 25 мг и герметизации кастрюлю с помощью универсального обжимных щипцов нажмите, чтобы свести к минимуму потерю влаги во время сканирования DSC.
3. Измерьте каждый наноэмульсии от 5 до 80 ° C.
4. Сообщить точка плавления и скрытой теплоты плавления от участка ДСК, где долина представляет точку плавления и интеграл от площади под кривой на графике ДСК, деленное на количество материала представляет собой скрытую теплоту плавления.

2. Взаимодействие с SLNS фибробластов и дендритных клеток

Культура первичных фибробластов человека
1. Культура основной человеческой фантастическиефибробластов в соответствии с инструкциями завода-изготовителя в жидкой среде для культуры фибробластов кожи человека (средних 106), с добавлением низкого дополнением рост сыворотки (МСУ) комплект. Поддержание клеток в увлажненной атмосфере при 37 ° С, 5% СО ₂ и субкультуры по достижении 80% слияния.
2. Для обоих МТТ и анализа изображений, семенных клеток в 96-луночный планшет при плотности 2 х 10 ⁴ клеток на лунку, и позволяют прийти в равновесие при 37 ° CO / N до SLN воздействия.
3. В нулевой момент времени, разбавленные SLNS в полной среде, как указано (рисунок 4), по отношению к концентрации липидов, и добавить 10 мкл на лунку в каждую лунку репликации в 96-луночный планшет.
4. Поддержание клеток при 37 ° С, _5% СО 2, в течение инкубационного периода.
МТТ Анализ токсичности
1. Через 24 часа инкубации с SLNS, определить жизнеспособность клеток с использованием МТТ, в соответствии с протоколом производителя. </ LI>
2. Промыть клетки один раз и добавить свежую среду в каждую лунку (100 мкл / лунку). Убить контрольные лунки путем инкубации в 70% -ном растворе метанола в течение 10 мин перед заменой свежей средой.
3. Добавить МТТ реагента (10 мкл на лунку) в каждую лунку микропланшета и инкубируют O / N при 37 ° С.
4. После вывода / N инкубации, растворения кристаллов внутриклеточные Formazin с прилагающимся раствором моющего средства (100 мкл на лунку) в соответствии с протоколом производителя.
5. После 3 ч инкубации при комнатной температуре, получают значения абсорбции при длине волны измерения 570 нм с использованием микропланшет-ридера.
  Примечание: МТТ реагент, используемый должно быть меньше, чем 1% (вес / объем) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-дифенил-тетразолия бромидом.
Флуоресцентной микроскопии
1. В определенные моменты времени после дозировки фибробластов с SLN, мыть фибробласты дважды стерильной фосфатным буферным раствором (PBS) и зафиксировать в течение 10 мин с холодным 70% -ным метанолом.
2. Через 10 минЗаменить метанола с PBS и захвата изображения с помощью инвертированного микроскопа, используя полосу пропускания (BP) 690/50 нм набор фильтров.
Культура костного мозга мыши дендритных клеток
1. Индуцируют костного мозга мыши, полученные дендритные клетки (BMDC), как описано ранее ^23,24. Вкратце, пластина одной клетки суспензии C57BL / 10 костного мозга в 100 мм чашках Петри на 2 ^× 10 6 / пластины с рекомбинантный мышиный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, 300 ед / мл) и рекомбинантный мышиный IL-4 (В-клеточным стимулирующим фактором, 200 Ед / мл). Изменить СМИ каждые 3 дня.
2. На 7 день, добавить НИР-нагруженные SLNS к блюдам в конечной концентрации 0,5 и 5,0 мкг / мл липида и поддержания клеток в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение требуемого времени экспозиции.
3. Сбор клеток из блюд путем аспирации всех средств массовой информации в своей тарелке, собирая его в 50 мл трубки, с последующей тщательной промывкой пластины (выбить затягивая объявлениекогерентные клетки) с 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), содержащем 4 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Собирают полученное клеточной суспензии в той же пробирке на 50 мл.
Оценка SLNS Регистрации с помощью проточной цитометрии
1. Определить концентрацию суспензии клеток, полученной в пункте 2.4.3 и распространять 3x10 ⁵ клеток в 12 мм х 75 мм с круглым дном FACS трубы.
2. Промыть клеток путем добавления 1 мл PBS, а затем центрифугируют пробирки в течение 5 мин при 400 х г при температуре 4 ° С.
3. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку с 100 мкл PBS / 2 мМ ЭДТА / 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (окрашивание буфер), содержащим анти-CD11c-FITC моноклональных антител (0,25 мкг / мл конечная). Инкубировать в течение 30 минут на льду в темноте.
4. Промыть клеток с 1 мл PBS и затем центрифуги трубки в течение 5 мин при 400 х г при температуре 4 ° С.
5. Удалите супернатант и ресуспендируют каждыйосаждения с 400 мкл окрашивающего буфера. Клетки готов к приобретению образцов с цитометра потока (возможно, оснащенного синего и красного лазеров).
6. Использование проточной цитометрии программного обеспечения для анализа, оценки уровня включения SLNS по ДК стробирования на население CD11c + клеток (FITC положительный) и сравнивая интенсивность флуоресценции SLNS-связанные (измеряется в каналах PerCP-Cy5.5 или APC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Способ PIT был использован для синтеза SLNS и температура обращения фаз была определена с использованием водяной бани. Образцы медленно нагревают и осторожно перемешивают, пока раствор не появилась ясно. Температура инверсии фазы для SLNS сделаны с помощью heneicosane липида 45 ° С. В таблице 1 приведены размеры частиц, полидисперсности, температуру плавления и скрытой теплоты плавления для SLNS. В SLNS синтезированные с использованием условий обработки, описанных выше в результате управления SLNS и НИР загруженных SLNS со средним диаметром частиц 18,59 16,87 нм и и полидисперсности 5,83 и 4,47 соответственно (рис 3). Стабильность дисперсии SLNS контролировали путем измерения размера частиц в течение 6 дней при двух различных температурах хранения (4 и 23 ° С). Размер частиц не изменилось в течение 6 дней (данные не показаны).

Тепловая поведение SLNS был Investigованные использованием дифференциальной сканирующей калориметрии. Синтезированные SLNS имеют температуру плавления 38,0 (± 0,4) и 36,8 (± 0,2) ° C для контроля SLNS и НИР-нагруженных SLNS, соответственно. В противоположность этому, температура плавления для объемного липида 40,0 ° С, что указывает на подавление точки плавления SLNS по отношению к объемной липидов. Как и ожидалось, помещение в небольших размерах и соотношении с большой площадью поверхности к объему нажмите точку плавления наночастиц ^1. Кроме того, скрытая теплота плавления для управления SLNS и НИР загруженных SLNS 5,1 (± 0,2) и 4,0 (± 0,1) Дж / г, соответственно. Эти результаты показывают, что уровень кристалличности SLNS зависит от полезной нагрузки, где НДК-нагруженные SLNS показали более низкую степень кристалличности по сравнению с контрольными SLNS.

Рисунок 3. Распределение размера частицтипичные наноэмульсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Образец	Размер частиц (нм)	Полидисперсности	Температура плавления (° С)	Скрытая теплота плавления (Дж / г)
SLNS (контроль)	18.59	5.83	38,0 ± 0,4	5,1 ± 0,2
Нир-SLNS	16.87	4.47	36,8 ± 0,2	4.0 ± 0.1

Таблица 1. Резюме физических свойств и теплового поведения управляющих SLNS и НИР загруженных SLNS включая размер частиц, полидисперсности, температура плавления и скрытой теплоты плавления.

В целях изучения взаимодействий частиц и клеточных моделей, ограничения дозы СЛН также непосредственно применяется к первичным клеток в культуре, впервые были созданы. Использование МТТ, эффект доза-ответ на клеточный метаболизм измеряли, где увеличение концентрации частиц приводит к уменьшению жизнеспособности клеток (по отношению к необработанными контрольными клетками). Там не было наблюдаемое различие в токсичности между клетками, подверженных СЛН одиночку против НИР загруженной СЛН на этих предварительно определенных дозах. Параллельно клетки визуально проверены на соблюдение в культуре ткани полистирола и изображения были взяты, чтобы продемонстрировать как представительный клеточной морфологии и поглощение флуоресцентных частиц с течением времени (рис 5). Использование дозу, равную 5 мкг липида / мл (примерно 80% жизнеспособность клеток) поглощение частиц наблюдали после воздействия 2 ч.

YS ">

Рисунок 4. Жизнеспособность первичных человеческих кожных фибробластах после 24 ч инкубации с наночастицами. Жизнеспособность измеряли с помощью МТТ и данные представляют процентов жизнеспособных клеток по отношению к необработанным контролем. Концентрации представляют вес / объем липидов. Данные отражают, по крайней мере в трех независимых экспериментах, выполненных в трех экземплярах. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Основные фибробласты человека кожные после (A) 2 и (B) 24 час инкубации с НИР загруженных наночастиц. Концентрация наночастиц равна 5 мкг / мл липида.Изображения представитель по крайней мере, в трех независимых экспериментах, выполненных в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Основываясь на результатах исследований, ограничения доз, была исследована корреляция между дозой SLNS и уровню включения в мышиной BMDC. Эти клетки широко считается лучшим в модели пробирке нескольких DC подмножеств существующих в естественных условиях и позволяют основных исследований уровня исследования обеих клеточных и молекулярных эффектов, предназначенных манипуляций. BMDC были лечить или подвергать O / N либо 0,5 или 5,0 мкг / мл липидного НДК загруженных SLNS (аналогично человеческого фибробласта, использование 50 мкг / мл липида в результате меньше, чем 10% жизнеспособных клеток) и уровень наночастиц включение определяется путем измерения интенсивности флуоресценции Нир в BMDCs помощью проточной цитометрии. Прямое соотции между концентрацией SLNS используемых и количество флуоресценции, начисленного в BMDCs наблюдалось (рис 6а). Анализ кинетики НИР загруженной SLNS включения показал очень быстрое поглощение по BMDC. ФСЛ флуоресцентный сигнал уже очевидно, после 1 часа воздействия, в то время как на плато около 5 часов облучения (рис 6В).

Рисунок 6. SLN включение путем дендритных клеток коррелирует с концентрацией воздействия. (A) мышиной из костного мозга дендритные клетки (BMDC) подвергались O / N, чтобы NIR-SLNS, при концентрации липида указано, и уровень включения оценивали с помощью проточной цитометрии. Гистограмма накладки все воротами на CD11c + населения. (Б) Кинетическая СЛН регистрации по BMDC. Клетки подвергаются Нир-SLNS (5мкг / мл) в течение указанного времени и уровня флуоресценции (на закрытом CD11c + клеток) была оценена с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании, синтез SLNS и их применимость для внутриклеточных нацеленных приложений были изучены. Эти наночастицы биосовместимые показали обещание как средства доставки для нескольких приложений, включая поставки наркотиков, сайленсинга, вакцин и технологий ^25-30. Крохотные SLNS были синтезированы с использованием легкое процесс, были исследованы их взаимодействия с первичными клетками кожи и первичных иммунных клеток. SLNS были разработаны, чтобы включить инкапсуляцию флуоресцентного красителя (NIR), который служил в качестве модели терапевтического груза.

Способ PIT был использован для синтеза SLN и результирующие свойства частиц (размер частиц, полидисперсности, температура плавления и скрытой теплоты плавления) оценивали с помощью динамического светорассеяния и дифференциальной сканирующей калориметрии. Размер частиц и анализ полидисперсности показали синтез ультра-малых SLNS с узкой полидисперсности, идеально подходит для внутриклеточного целиING приложений. Как сообщалось ранее, размер частиц может играть важную роль на клеточных взаимодействий ^12. Размер наночастиц было показано, что существенное влияние, влияющих поглощения эффективность, интернализации выбор тропинка, внутриклеточную локализацию и цитотоксичность ^12. Некоторые из общих тенденций в отношении клеток-наночастиц взаимодействий описаны в литературе включают в себя: критический размер может варьироваться в зависимости от типа клеток и поверхностных свойств наночастиц, и маленькие наночастицы имеют высокую вероятность быть усвоены пассивный вверх принять, чем крупные ¹² , Термический анализ частиц в данном исследовании показали разный уровень кристалличности (т.е., скрытая теплота плавления) между контрольными SLNS и те, что загружены с Нир красителя. Кристалличность SLNS уменьшилось из-за добавления флуоресцентного красителя, который действует в качестве примеси. Кристалличность терапевтической системы доставки, как было показано бе важный фактор, который влияет на доставку и дозы ^31. Снижение кристалличности автомобиля СЛН могут влиять такие параметры, как терапевтического грузоподъемностью и кинетики высвобождения лекарственного ^31. Способ PIT является более мягким метод синтеза по сравнению с другими методами, с тем ограничением, что только липофильных лекарственных средств могут быть включены в частицы. Несмотря на это ограничение, SLNS синтезированные с помощью этого метода весьма биосовместимого, делая то подходящее платформу доставки для многих приложений в области биомедицинских исследований.

Эффекты SLN взаимодействия на человека жизнеспособности кожной фибробластов были проанализированы с помощью МТТ. Зависимый от дозы снижение жизнеспособности наблюдалось при увеличении концентрации SLN. Во SLN синтеза, липидные частицы стабилизированы слоем ПАВ. При уменьшении размера частиц, увеличивается площадь, как и потенциал для клеточной поверхности взаимодействия и сотовой экспозиции тО поверхностно слоя, которые могут повредить клеточные мембраны. Эти эксперименты позволили определить концентрации дозирования, при котором поглощение клетками частиц можно было наблюдать, избегая при этом значительное снижение жизнеспособности клеток из-за нарушения мембраны. Анализ МТТ является количественным методом, который может широко применяться для понимания клеточного здоровья. Параллельно клетки исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии для визуализации флуоресценции красителя грузов, флуоресцентного НДК. С помощью этого метода, поглощение частиц наблюдалось только после 2 часов инкубации с фибробластами человека. Флуоресцентная микроскопия позволяет получить качественную информацию, связанную с клеточной морфологии и характеристик. Уход должны быть приняты, чтобы избежать чрезмерного фонового окрашивания и визуализации артефактов. Кроме того, как мышиные модели, как правило, первым выбором для углубленного клеточной и молекулярной исследований, мы проанализировали взаимодействие между SLNS и мышиных клеток. В частности, большойИнтерес заключается в использовании наночастиц для селективного и регулируемым высвобождением лекарств, которые бы модифицировать поведение иммунной системы. Следовательно, проточной цитометрии был использован для измерения поглощения частиц на мышь дендритных клеток. Эти данные подтвердили, что фагоциты, как дендритные клетки могут переносить подобную диапазоне концентраций SLNS (с снижению жизнеспособности наблюдается при 50 мкг / мл липида, как с человеческих кожных фибробластах) и уровень включения прямо коррелирует с концентрацией SLN воздействия. Кроме того, округ Колумбия показала очень быстрый включение SLNS, предполагая, что это население, возможно, представляют собой ценный цель через СЛУ-опосредованной доставки лекарств.

Это исследование включает в себя описание способа синтеза ультра-малых популяций биосовместимых наночастиц, а также несколько методов в пробирке для оценки их клеточных взаимодействий. В будущих исследованиях, дополнительные анализымогут быть использованы для дальнейшего характеризуют частиц межклеточных взаимодействий и в конечном итоге направлять успешное развитие терапевтических наноносителей. Они могут включать в себя изучение кинетики высвобождения лекарственного, анализ клеточного тропизма, измерения провоспалительных цитокинов, уровнях и анализа клеточных транскриптомных изменения с течением времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).