Bioengineering

Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Published: November 17, 2015 doi: 10.3791/53102

Xiomara Calderón-Colón¹, Giorgio Raimondi², Jason J. Benkoski¹, Julia B. Patrone³

¹Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, ²Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, ³Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

Introduction

Veículos de entrega baseado em nanopartículas têm mostrado uma grande promessa para aplicações dirigidas intracelulares, fornecendo um mecanismo para alterar especificamente sinalização celular e expressão gênica. Estes veículos podem ser carregados com medicamentos, proteínas, ácidos nucleicos e concebidos para influenciar as respostas celulares e conseguir um efeito desejado em tecidos-alvo. Muitos tipos de nanocarriers têm sido exploradas para benefício terapêutico e de diagnóstico, incluindo lipidos, polímeros, silício e materiais magnéticos. Estes sistemas são atraentes devido ao seu potencial para a entrega da droga localizada, aumento da concentração terapêutica em tecidos-alvo e redução de toxicidade sistêmica.

Nanopartículas de lípidos sólidas (NLS) são um exemplo bem estudado de um sistema de entrega de nanopartículas que surgiu como um veículo de entrega de droga promissora nos últimos anos. SLNs pode ser facilmente formulado para várias aplicações, incluindo bio-sensor ^1, cosméticos ^2, e tentrega herapeutic ^3-7. A sua utilidade advém do facto de que eles são constituídos inteiramente de reabsorvíveis, lípidos não tóxicos, resultando em melhor biocompatibilidade. Durante a síntese, os fármacos lipofilicos podem ser incorporados em veículos SLN, aumentando assim a solubilidade do fármaco e da aptidão para administração parentérica. SLN veículos também ajudam a estabilizar terapêuticas encapsuladas, reduzindo sua degradação e depuração, e maximizando a ação terapêutica. Estes veículos são particularmente bem adequados para longa actuação, preparações de libertação controlada devido à sua estabilidade à temperatura do corpo ^3,4,8,9. Importante, a encapsulação de fármacos em nanopartículas de lípidos altera os perfis farmacocinéticos intrínsecas das moléculas de fármaco. Isto proporciona uma vantagem potencial de permitir a libertação controlada de fármacos com um índice terapêutico estreito. A taxa de libertação de agentes terapêuticos incorporados-NLS pode ser regulado com base na taxa de degradação do lípido ou a taxa de difusão da droga namatriz lipídica.

SLNs são muitas vezes modificados para se acumular nos tecidos alvo específicos. Por exemplo, o tamanho (tipicamente maior do que 10 nm) potencia a retenção na circulação, em que a vasculatura de tecido tumoral gotejante facilita a deposição. Além disso, a via de administração da partícula foi mostrado para alterar a biodistribuição com o potencial para segmentar estruturas fisiológicas específicas tais como os nódulos linfáticos ^10,11. Após a deposição nos tecidos alvo, conseguindo interacções celulares apropriados e eventual internalização de nanopartículas é um desafio devido à capacidade das membranas celulares para controlar selectivamente o fluxo de iões e moléculas para dentro e para fora da célula ^12. Para facilitar a absorção celular, é possível modificar nanocarriers com ligandos específicos, incluindo péptidos, moléculas pequenas, anticorpos monoclonais e ^13,14. Vários mecanismos incluindo tanto passiva penetração e transporte activo de nanopartículasatravés da membrana celular foram previamente descritos ^3,12,15. Em geral, demonstrou-se que as interacções célula-nanopartículas são influenciadas pelas propriedades físico-químicas das nanopartículas, incluindo o tamanho, forma, carga de superfície e a química de superfície, além de parâmetros específicos de células, tais como tipo de célula ou a fase do ciclo celular ^12.

Uma investigação anterior demonstrou a síntese de sub-10 SLNs nm para ¹⁶ tópicos e aplicações de detecção de biomarcadores ¹ utilizando o método de ¹⁷ temperatura de inversão de fase (PIT). Este é um método de síntese ² suave onde a composição permanece constante enquanto a temperatura é gradualmente alterado. Agitação contínua da solução aquecida, à medida que arrefece a resultados de RT em uma nanoemulsão. Este processo resulta na síntese de NLS com tamanho de partícula menor do que ¹ relatado anteriormente usando vários métodos para a síntese do lípido nanoparticles ^17-22. A escala de tamanho resultante, menos de 20 nm, proporciona uma vantagem para aplicações de segmentação intracelulares devido ao aumento da área superficial eo potencial para interações celulares avançados.

Um esquema de NLS, concebido para proporcionar um corante fluorescente ou terapêutico, é mostrado na Figura 1. Os SLNs consistem de um lípido interior (por exemplo, alcano linear), que permite a incorporação de compostos lipófilos (por exemplo, corantes ou agentes terapêuticos) e um exterior surfactante (surfactante não iónico por exemplo, linear) rodeada por água. Neste estudo, SLNs foram carregadas com um corante fluorescente e utilizado como um modelo para investigar interacções célula-partículas. Fibroblastos dérmicos humanos primários e células dendríticas de rato foram expostos a corante carregado-NLS ao longo do tempo, a fim de caracterizar as interacções com respeito à toxicidade e a absorção das partículas. Um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) foi utilized, a fim de estabelecer níveis de dosagem adequados. A microscopia de fluorescência e citometria de fluxo foram utilizados dois métodos para analisar a absorção de partículas in vitro.

Figura 1. Esquema da SLN mostrando os principais constituintes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. Processamento de SLNs

Síntese de SLNs
Nota: Use o método PIT ^1,17,20 para preparar os sub-20 SLNs ^NM 1.
1. Utilizar técnicas assépticas, biorreagentes ou reagentes de grau de cultura de células, e materiais estéreis (isto é, pipetas, espátulas, ampolas, etc.).
2. Usar uma cabine de segurança biológica para a síntese de NLS (Figura 2).
3. Combinar 0,6 mg de corante fluorescente (Vermelho do Nilo (NIR), a concentração de NiR é de aproximadamente 0,3 mg / ml) e 0,10 g de heneicosano (lípido, 5% p / p de concentração de lípido) para um frasco (15 ml), o co-fundido a 90 ° C, e mexa.
4. Adicionar 0,11 g de polioxietileno (10) éter oleilico (surfactante, 5,5% p / p de concentração de surfactante). A co-fundir a mistura resultante a 90 ° C e agitar.
5. Adicionar 1,79 g de água estéril à mistura, aquecer a 90 ° C, e agita-se até que uma nanoemulsão transparente é formado.
  Nota: Sob agitação contínua e arrefecimento controlado, SLNs são criados. Estas condições causar a inversão da emulsão de água-em-óleo para uma emulsão óleo-em-água. Moléculas lipofílicas como partição NiR para as gotículas lipídicas.
6. Prepara-se uma nanoemulsão em paralelo sem a adição do corante fluorescente, a fim de servir como amostra de controlo. Combinar 0,10 g de heneicosano e 0,11 g de polioxietileno (10) éter oleílico para um frasco (15 ml) co-fundido a 90 ° C, e agita-se.
  1. Adicionar 1,79 g de água estéril à mistura, aquecer a 90 ° C, e agita-se até que uma nanoemulsão transparente é formado.
7. Além disso esterilizar cada nanoemulsão utilizando um filtro estéril de 0,2 um.
Figura 2. Esquema de síntese de SLNs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tamanho da Partícula e Polydispersity
1. Use dispersão de luz dinâmica (DLS) para medir o tamanho de partícula e polidispersidade dos NLS ¹ utilizando uma cuvete de vidro e um instrumento concebido para medir o tamanho de partícula.
2. Antes das medições de amostras, medir as dimensões das partículas de dois padrões conhecidos seguindo o protocolo do fabricante para a preparação de padrões e de medição.
3. Encher a cuvete de vidro com 1,5 ml de solução padrão e a medição da solução padrão, utilizando as mesmas condições de medida que as amostras.
  Nota: passo anterior foi repetido para cada padrão.
4. Medem-se as amostras tal como preparado. Para cada, utilizar os seguintes parâmetros experimentais: um tempo de funcionamento de 100 seg, índice de refracção de água (1,33), a viscosidade da água a 20 ° C (1,002 mPa).
  Nota: Esta técnica utiliza uma frequência deslocada luz para medir o tamanho das nanopartículas.
5. Relate o diâmetro médio das partículas e polidispersividade de partidistribuição de tamanho de cle.
Ponto de fusão e Calor Latente de fusão
1. Use um calorimetria exploratória diferencial (DSC) equipado com um amostrador automático e fonte de resfriamento de nitrogênio líquido para investigar o comportamento térmico de SLNs ^1.
2. Pipetar os SLNs como preparados em uma panela de alumínio de 40 l com uma massa de cerca de 25 mg e fechar hermeticamente a panela utilizando uma prensa crimper universal para minimizar a perda de umidade durante a varredura DSC.
3. Medir cada nanoemulsão de 5 a 80 ° C.
4. Indica-se a ponto de fusão e do calor latente de fusão de DSC a partir do lote, em que o vale representa o ponto de fusão e o integral da área sob a curva de DSC na trama dividida pela quantidade de material representa o calor latente de fusão.

2. SLNs Interação com fibroblastos e células dendríticas

Cultura de fibroblastos humanos primários
1. Cultura primária fi humanafibroblastos de acordo com as instruções do fabricante em meio líquido para a cultura de fibroblastos dérmicos humanos (média 106), suplementado com o kit de suplemento de crescimento de soro baixo (LSGS). Manter as células numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO ₂ e subcultura, ao atingir 80% de confluência.
2. Para tanto MTT e análise de imagem, as células de semente em uma placa de 96 poços, a uma densidade de 2 x 10 ⁴ culas por po, e deixar equilibrar a 37 ° CO / N antes da exposição SLN.
3. No tempo zero, diluir SLNs em meio completo, conforme indicado (Figura 4), com respeito à concentração de lípido, e adicionar 10 uL por poço para cada replicado poço na placa de 96 poços.
4. Manter as células a 37 ° C, 5% de CO _2, durante o período de incubação.
MTT Toxicidade Assay
1. Após 24 h de incubação com o NLS, determinar a viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT, de acordo com o protocolo do fabricante. </ li>
2. Lave as células uma vez e adicionar meio fresco a cada poço (100 ul / poço). Matar poços de controlo por incubação numa solução de metanol a 70% durante 10 min antes de substituir com meio fresco.
3. Adiciona-se reagente de MTT (10 ul por poço) a cada poço da microplaca e incube O / N a 37 ° C.
4. Depois de O / N de incubação, os cristais de formazina solubilizar intracelulares com a solução detergente fornecida (100 ul por poço) de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Após 3 h de incubação à TA, obter valores de absorvância a um comprimento de onda de medição de 570 nm utilizando um leitor de microplacas.
  O MTT utilizado deve ser menor do que 1% (w / v) de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2, brometo de 5-difenil-tetrazólio: Nota.
Microscopia de Fluorescência
1. Em pontos de tempo após a dosagem específicos de fibroblastos com SLN, lavar os fibroblastos duas vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e fixar durante 10 min com metanol a 70% frio.
2. Após 10 min, Substituir o metanol com PBS e capturar imagens usando um microscópio invertido, usando uma passagem de banda (PA) 690/50 nm conjunto de filtros.
Cultura de Medula Óssea de rato As células dendríticas
1. Induzem as células dendríticas derivadas de medula óssea de ratinho (BMDC) como previamente descrito ^23,24. Resumidamente, suspensões de placa única de células de ratinhos C57BL / 10 de medula óssea em 100 mm de placas de Petri a 2 x 10 ⁶ / placa com factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos de murino recombinante (GM-CSF, 300 U / ml) e murino IL-4 recombinante (factor de células B, 200 U / ml de estimulante). Mudança de mídia a cada 3 dias.
2. No dia 7, adicionar SLNs NiR-carregadas com os pratos a uma concentração final de 0,5 e 5,0 ug / ml de lípido e manter as células em uma temperatura de 37 ° C, _5% de CO2 para o comprimento desejado de exposição.
3. Coletar as células dos pratos por aspiração de toda a mídia na placa, cobra-lo em um tubo de 50 ml, seguido de lavagem completa da placa (para desalojar anúncio vagamenteHerent células) com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 4 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Recolha a suspensão celular obtida no mesmo tubo de 50 ml.
Avaliação da SLNs Incorporação via Citometria de Fluxo
1. Determinar a concentração da suspensão de células obtida no ponto 2.4.3 e distribuir 3x10 ⁵ células em um de 12 mm x 75 mm de fundo redondo tubo FACS.
2. Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS e em seguida os tubos de centrifugação durante 5 minutos a 400 xg, à temperatura de 4 ° C.
3. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 100 ul de PBS / EDTA 2 mM / 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) (tampão de coloração) contendo anticorpo monoclonal anti-CD11c-FITC (0,25 ug / mL de concentração final). Incubar durante 30 min em gelo no escuro.
4. Lavam-se as células com 1 ml de PBS e, em seguida, centrifugar os tubos durante 5 min a 400 xg, à temperatura de 4 ° C.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender cadasedimentar com 400 ul de tampão de coloração. As células estão agora prontos para a aquisição das amostras com um citômetro de fluxo (possivelmente equipado com lasers azuis e vermelhas).
6. Utilizando um software de análise de citometria de fluxo, avaliar o nível de incorporação de NLS por DC por gating na população de células FITC CD11c + (positivo) e comparando a intensidade de fluorescência NLS-associados (medido nos canais PerCP-Cy5.5 ou APC).

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Representative Results

O método PIT foi utilizado para sintetizar os NLS e a temperatura de inversão de fase foi determinada utilizando um banho de água. As amostras foram aquecidas lentamente e agitado suavemente até que a solução apareceu clara. A temperatura de inversão de fase para as SLNs feitas usando heneicosano lipídica é de 45 ° C. A Tabela 1 sumariza o tamanho de partícula, polidispersão, ponto de fusão e do calor latente de fusão para os NLS. Os NLS sintetizados utilizando as condições de processamento acima descritas resultou na SLNs controlo e SLNs NiR-carregados com um diâmetro médio de partícula de 18,59 e 16,87 nm e com uma polidispersidade de 5,83 e 4,47, respectivamente (Figura 3). A estabilidade da dispersão de NLS foi monitorizada pela medição do tamanho das partículas ao longo de 6 dias a duas diferentes temperaturas de armazenamento (4 e 23 ° C). O tamanho de partícula não se alterou ao longo de 6 dias (dados não mostrados).

O comportamento térmico dos SLNs foi Investigado usando calorimetria diferencial de varrimento. Os NLS sintetizados têm um ponto de fusão de 38,0 (± 0,4) e 36,8 (± 0,2) ° C para os SLNs controlo e SLNs NiR-carregadas, respectivamente. Em contraste, o ponto de fusão para a maior parte lipídica é de 40,0 ° C, indicando a supressão do ponto de o NLS em relação ao lípido de fusão grandes quantidades. Como esperado, o confinamento de pequenas dimensões e de elevada relação de área de superfície para volume deprimir o ponto de fusão de nanopartículas ^1. Além disso, o calor latente de fusão para os SLNs controlo e SLNs NiR-carregados é de 5,1 (± 0,2), e 4,0 (± 0,1) J / g, respectivamente. Estes resultados indicam que o nível de cristalinidade dos NLS é afectado pela carga útil, onde os SLNs NiR-carregados mostrou uma cristalinidade inferior em comparação com os NLS controlo.

Figura 3. Partícula de distribuição de tamanhonanoemulsões típicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra	Tamanho de Partículas (nm)	Polidispersidade	Ponto de fusão (° C)	Calor Latente de Fusão (J / g)
SLNs (Control)	18,59	5.83	38,0 ± 0,4	5,1 ± 0,2
NIR SLNs	16,87	4.47	36,8 ± 0,2	4,0 ± 0,1

Tabela 1. Resumo das propriedades físicas e comportamento térmico dos SLNs controlo e SLNs NiR-carregados, incluindo o tamanho das partículas, a polidispersabilidade, ponto de fusão e do calor latente fusão.

A fim de explorar as interações de partículas e modelos celulares, as limitações de dose da SLN como aplicada diretamente às células primárias em cultura, foram estabelecidas pela primeira vez. Utilizando um ensaio de MTT, o efeito de resposta à dose sobre o metabolismo celular foi medida, em que o aumento da concentração das partículas resultou numa diminuição da viabilidade celular (em relação às células de controlo não tratadas). Não foi observada nenhuma diferença na toxicidade entre as células expostas a SLN sozinho contra SLN NiR-carregado com estas doses pré-determinadas. Em paralelo, as células foram examinados visualmente quanto ao cumprimento da cultura de tecidos de poliestireno e as imagens foram tomadas para demonstrar tanto a morfologia celular representante e a absorção de partículas fluorescentes ao longo do tempo (Figura 5). Utilizando uma dose igual a 5 ug / ml de lípido (cerca de 80% da viabilidade celular) a captação de partículas foi observada por exposição de pós 2 horas.

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Figura 4. Viabilidade de fibroblastos dérmicos humanos primários após incubação de 24 h com nanopartículas. A viabilidade foi medida utilizando um ensaio de MTT, e os dados representam a percentagem de células viáveis em relação aos controlos não tratados. Concentrações representam peso / volume lipídico. Os dados refletem, pelo menos, três experimentos independentes, realizados em triplicado. As barras de erro indicam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. fibroblastos dérmicos humanos primários após (a) 2 e (B) 24 horas de incubação com nanopartículas NiR-carregados. Concentração de nanopartículas é igual a 5 ug / ml de lípido.As imagens são representativos de pelo menos três experiências independentes, realizadas em duplicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Com base nos resultados dos estudos de limitação de dose, a correlação entre a dose de NLS e o nível de incorporação no murino BMDC foi investigada. Estas células são amplamente considerado o melhor modelo in vitro de vários subconjuntos de DC existentes in vivo e permitir investigações básicas nível de investigação de ambos os efeitos celulares e moleculares de manipulações destinadas. BMDC foram deixados sem tratamento ou expostos O / N para 0,5 ou 5,0 ug / lípido ml das SLNs NiR-carregados (de forma semelhante a fibroblastos humanos, a utilização de 50 ug / ml de lípidos resultou em menos de 10% de células viáveis) e o nível de nanopartícula incorporação determinada medindo a intensidade de fluorescência da NIR em BMDCs através de citometria de fluxo. Um corre diretomento entre a concentração de NLS utilizadas e a quantidade de fluorescência avaliada em BMDCs foi observado (Figura 6A). Uma análise da cinética de NiR-carregado SLNs incorporação revelou uma muito rápida aceitação por BMDC. O sinal fluorescente SLN já foi evidente após 1 h de exposição, enquanto plateauing em cerca de 5 h de exposição (Figura 6B).

Figura 6. SLN incorporação por células dendríticas se correlaciona com a concentração de exposição. (A) óssea de murinos derivados da medula células dendríticas (BMDC) foram expostos O / N para NiR-NLS, a concentração do lípido indicado, e o nível de incorporação avaliada por meio de citometria de fluxo. Sobreposições de histograma são todos fechado no CD11c + população. (B) Kinetic da incorporação SLN por BMDC. As células foram expostas a NiR-NLS (5ug / ml) durante o tempo indicado eo nível de fluorescência (em CD11c fechado + células) foi avaliada por citometria de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste estudo, a síntese de NLS e a sua aplicabilidade para aplicações destinadas intracelulares foram exploradas. Estas nanopartículas biocompatíveis têm mostrado promissores como veículos de entrega para várias aplicações, incluindo a entrega de drogas, o silenciamento do gene, e tecnologias de vacina ^25-30. Ultra-pequenas SLNs foram sintetizados usando um processo fácil, e as suas interacções com células epiteliais primárias e células imunitárias primárias foram exploradas. SLNs foram concebidos para incluir a encapsulação de um corante fluorescente (NIR), que serviu como um modelo de carga terapêutico.

O método PIT foi empregue para sintetizar SLN e as propriedades das partículas resultantes (dimensão de partícula, polidispersão, ponto de fusão, e de calor latente de fusão), avaliadas por meio de dispersão dinâmica de luz e calorimetria de varrimento diferencial. O tamanho das partículas e análise polidispersabilidade revelou a síntese de ultra-pequenas SLNs com polidispersibilidade apertada, ideal para alvo intracelularing aplicações. Como relatado anteriormente, o tamanho de partícula pode desempenhar um papel importante nas interacções celulares ^12. O tamanho das nanopartículas tem sido mostrado ter um efeito dramático, influenciando a eficiência de absorção, selecção via de internalização, localização intracelular, e ¹² citotoxicidade. Algumas das tendências gerais no que diz respeito às interações célula-nanopartículas documentadas na literatura incluem: tamanho crítico pode variar com o tipo e da superfície da célula propriedades das nanopartículas, e pequenas nanopartículas têm maior probabilidade de ser internalizada pelos passiva da aceitação do que as grandes ¹² . A análise térmica das partículas em este estudo revelou um nível diferente de cristalinidade (ou seja, o calor latente de fusão) entre as SLNs de controle e aqueles carregado com corante NiR. A cristalinidade das SLNs diminuiu, devido à adição do corante fluorescente, que actua como uma impureza. A cristalinidade do sistema de libertação terapêutico foi demonstrado abum e um fator importante que afeta a entrega e dose ^31. Uma diminuição da cristalinidade do veículo SLN pode influenciar os parâmetros tais como a capacidade de carregamento terapêutico e a cinética de libertação de fármaco ^31. O método é uma técnica de PIT síntese mais suave em comparação com outros métodos, com a limitação de que somente fármacos lipofílicos podem ser incorporados nas partículas. Apesar desta limitação, SLNs sintetizados usando esse método são altamente biocompatível, fazendo plataforma de entrega, em seguida, apropriado para muitas aplicações na pesquisa biomédica.

Os efeitos da interacção de SLN em fibroblastos da derme humana viabilidade foram analisadas utilizando um ensaio MTT. Uma diminuição dependente da dose na viabilidade foi observada com concentrações crescentes de SLN. Durante a síntese de SLN, as partículas lipídicas são estabilizadas com uma camada de surfactante. À medida que o tamanho das partículas diminui, a área de superfície aumenta, assim como o potencial para as interacções da superfície celular e a exposição celular TO a camada de surfactante, que podem danificar as membranas celulares. Estas experiências permitiram a determinação da concentração de dosagem em que a captação celular de partículas pode ser observada, evitando uma diminuição significativa da viabilidade celular devido à ruptura da membrana. Análise MTT é uma técnica quantitativa que pode ser amplamente aplicada para entender a saúde celular. Em paralelo, as células foram examinadas utilizando microscopia de fluorescência, a fim de visualizar a fluorescência do corante fluorescente de carga, a NIR. Usando esta técnica, a captação das partículas foi observada após apenas 2 horas de incubação com fibroblastos humanos. A microscopia de fluorescência fornece informações qualitativas relacionadas com a morfologia celular e características. Cuidados devem ser tomados para evitar a coloração de fundo excessiva e imagem de artefatos. Além disso, como modelos de ratinho são geralmente a primeira escolha para em profundidade celular e molecular investigações, foi analisada a interacção entre o NLS e células de murídeo. Em particular, um grandeinteresse reside na utilização de nanopartículas para a libertação selectiva e controlada de fármacos que modificam o comportamento do sistema imunitário. Consequentemente, citometria de fluxo foi utilizada para medir a absorção de partículas pelas células dendríticas do mouse. Estes dados confirmam que as células fagocíticas, como as células dendríticas podem tolerar uma gama de concentração semelhante NLS (com reduzida viabilidade observada a 50 ug / ml de lípido como com fibroblastos dérmicos humanos) e o nível de incorporação correlaciona-se directamente com a concentração de exposição SLN. Além disso, DC revelou uma muito rápida incorporação de NLS, sugerindo que esta população pode representar um alvo valioso através da entrega de drogas NLS-mediada.

Este estudo inclui a descrição de um método para a síntese de ultra-pequenas populações de nanopartículas biocompatíveis, assim como vários métodos in vitro que permitam avaliar as suas interacções celulares. Em estudos futuros, ensaios adicionaispodem ser empregues para caracterizar adicionalmente as interacções célula-partículas e, finalmente, guiar o desenvolvimento bem sucedido de nanocarriers terapêuticos. Estes poderiam incluir estudos de cinética de libertação da droga, a análise de tropismo celular, a medição dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, e análise de alterações transcriptomic celulares ao longo do tempo.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	----	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Calderon-Colon, X., et al. Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications. J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).
Patwekar, S., et al. Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).
Martins, S., et al. Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway. International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).
Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. Solid Lipid Nanoparticles - A Review. International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).
Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art. Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).
Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs. International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).
Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).
Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations. International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).
Oussoren, C., Storm, G. Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration. Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).
Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters. J Nanobiotechnology. 12, 5 (2014).
Joshi, M. D., Muller, R. H. Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).
Torchilin, V. P. Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).
Ashley, C. E., et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers. Nature materials. 10, 389-397 (2011).
Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. Nanobandage for controlled release of topical therapeutics. 3, 255-258 (2013).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. Progress in Colloid and Polymer Science. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).
Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).
Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. Progress in Colloid and Polymer Science. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).
Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature. Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).
Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design. Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).
Raimondi, G., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients. J Immunol. 184, 624-636 (2010).
Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles. J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).
Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells. Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).
Musacchio, T., Torchilin, V. P. Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).
Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs). Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).
Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles. Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).
Almeida, A. J., Souto, E. Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).
Pardeshi, C., et al. Solid lipid based nanocarriers: an overview. Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).
Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).