Abstract
العديد من أنواع البكتيريا سالبة الجرام المسببة للأمراض بما في ذلك اليرسنية. توظف النوع الثالث أنظمة إفراز لنقل من البروتينات المستجيب إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. داخل الخلية المضيفة البروتينات المستجيب التلاعب الوظائف الخلوية لصالح البكتيريا. لفهم أفضل للسيطرة على نوع إفراز III خلال تفاعل الخلية المضيفة وحساسة وفحوصات دقيقة لقياس النبات مطلوبة. نحن هنا وصف تطبيق مقايسة على أساس الاندماج من يرسينيا القولون البروتين المستجيب جزء (يرسينيا البروتين الخارجي؛ YopE). مع TEM-1 بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من النبات ويعتمد الفحص على الانقسام خلية نفيذ الحنق صبغ (CCF4 / AM) بواسطة translocated الانصهار بيتا لاكتاماز. بعد الانقسام من السيفالوسبورين جوهر CCF4 من قبل بيتا لاكتاماز، الحنق من الكومارين إلى تعطل فلوريسئين والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق.وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، في نموذج الفأر. الكشف عن إشارات مضان يمكن القيام بها باستخدام لوحة القراء، تحليل FACS أو مضان المجهر. في الإعداد الموصوفة هنا، في النبات المختبر من اندماج المستجيب إلى خلايا هيلا من قبل المسوخ اليرسنية مختلفة يتم مراقبتها عن طريق المسح الضوئي ليزر المجهري. تسجيل تحويل الخلايا لمراسل الحنق من قبل المستجيب الانصهار بيتا لاكتاماز في الوقت الحقيقي يوفر النتائج الكمية قوية. نحن هنا تظهر البيانات النموذجية، مما يدل على زيادة النبات من قبل Y. متحولة القولون YopE مقارنة نوع السلالة البرية.
Introduction
النوع الثالث أنظمة إفراز بروتين هي آلات التصدير المتخصصة التي تستخدمها أجناس مختلفة من البكتيريا سالبة الجرام لتسليم مباشرة البروتينات المستجيب المشفرة البكتريا إلى الخلايا المستهدفة حقيقية النواة. بينما آلية إفراز نفسها الحفظ جدا، وقد تطورت مجموعات متخصصة من البروتينات المستجيب بين الأنواع البكتيرية المختلفة لمعالجة مسارات الإشارات الخلوية وتسهيل استراتيجيات الفوعة البكتيرية محددة 1. في حالة اليرسنية، تصل إلى سبعة البروتينات المستجيب، ما يسمى Yops (يرسينيا البروتينات الخارجي)، وtranslocated على اتصال الخلية المضيفة والعمل معا لتخريب استجابات الخلايا المناعية مثل البلعمة وخلوى الإنتاج، أي، للسماح بقاء خارج الخلية من البكتيريا 2-4. يتم التحكم في عملية النبات بإحكام في مراحل مختلفة 5. ثبت أن تفعيل الرئيسي للT3SS يتم تشغيل عن طريق الاتصال به لم المستهدفةليرة لبنانية 6. ومع ذلك، فإن الآلية الدقيقة لهذه المبادرة هي حتى الآن إلى توضيح. في اليرسنية يتم التوصل إلى المستوى الثاني من ما يسمى صقل النبات عن طريق حتى- أو نشاط البروتينات الخلوية رو GTP ملزم RAC1 أو RhoA التنظيم إلى أسفل. تفعيل RAC1 مثلا الإنفازين أو السامة للخلايا عامل الناخر Y (كنف-Y) يؤدي إلى زيادة النبات 7-9، في حين أن GAP (GTPase تفعيل بروتين) وظيفة من translocated YopE ينظم أسفل النشاط RAC1 وبالتالي يقلل النبات من نوع ردود الفعل السلبية آلية 10،11.
طرق صحيحة ودقيقة هي شرط أساسي لمعرفة كيف يتم تنظيم النبات خلال اليرسنية تفاعل الخلية المضيفة. وقد استخدمت العديد من أنظمة مختلفة لهذا الغرض، ولكل منها مزايا وعيوب محددة. بعض المناهج تعتمد على تحلل الخلايا المصابة ولكن ليس البكتيريا عن طريق المنظفات المختلفة التي تتبعها تحليل لطخة غربية. عشرالبريد العيب المشترك بين هذه الأساليب هو أن تحلل بكتيرية طفيفة ولكن لا مفر منه يحتمل أن يلوث المحللة الخلية مع البكتيريا المرتبطة البروتينات المستجيب. ومع ذلك، تم اقتراح علاج الخلايا مع بروتين K أن تتحلل البروتينات المستجيب خارج الخلية واستخدامها لاحقا من ديجيتونين للتحلل الانتقائي للخلايا حقيقية النواة للحد من هذه المشكلة 12. الأهم من ذلك، هذه المقايسات تعتمد بشكل حاسم على جودة عالية أضداد المستجيب، التي هي في معظمها غير متوفرة تجاريا. محاولات لاستخدام اندماج متعدية من البروتينات المستجيب والبروتينات الفلورية مثل GFP لرصد النبات لم تكن ناجحة ربما يرجع ذلك إلى هيكل كروي العالي من البروتينات الفلورية وعدم قدرة الجهاز إفراز تتكشف لهم قبل إفراز 13. ومع ذلك، العديد من علامات مراسل مختلفة مثل CYA (التي تعتمد على كالمودولين محلقة الأدينيلات) المجال من السعال الديكي البورديتيلة السم cyclolysin 14 أو فلاشاستخدمت العلامة بنجاح لتحليل النبات. في مقايسة السابق يتم استخدام النشاط الأنزيمي من CYA لتضخيم إشارة من البروتين الانصهار داخل الخلايا، في حين أن العلامة فلاش، لtetracysteine قصيرة جدا (4Cys) العلامة عزر، يسمح لوضع العلامات مع فلاش صبغ biarsenical دون إزعاج عملية إفراز 15.
وذكرت النهج المطبق هنا لأول مرة من قبل شاربنتييه وآخرون. ويستند على تحويل الخلايا من فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) صبغ CCF4 التي كتبها translocated المستجيب TEM-1 بيتا لاكتاماز اندماج 16 (الشكل 1A). CCF4 / AM هو مركب خلايا نفيذ التي ترتبط في المتفرعة الكومارين (المانحة) وشاردة فلوريسئين (متقبل) من خلال نواة السيفالوسبورين. عند الدخول السلبي في الخلية حقيقية النواة، ومعالجة عدم الفلورسنت أسترته CCF4 / AM بواسطة مركب esterases الخلوية إلى CCF4 اتهم والفلورسنت، وبالتالي المحاصرينداخل الخلية. الإثارة شاردة الكومارين في 405 نانومتر النتائج في الحنق إلى شاردة فلوريسئين، التي تنبعث إشارة مضان أخضر في 530 نانومتر. بعد الانقسام من السيفالوسبورين الأساسية من الحنق بيتا لاكتاماز تعطل والإثارة من شاردة الكومارين يؤدي إلى انبعاث مضان الأزرق at460 نانومتر. وقد وصفت التطبيقات المختلفة لهذه الطريقة في الأدب تسليط الضوء على تنوعها. يسمح طريقة لتحليل النبات في المختبر، وأيضا في في الجسم الحي، على سبيل المثال، تم استخدام هذه التقنية في نموذج عدوى الماوس لتحديد السكان الكريات البيض التي تستهدف النبات في الجسم الحي 17-19. ويمكن إجراء قراءات الإشارات باستخدام قارئ لوحة، وتحليل FACS أو مضان المجهر. من المذكرة، وطريقة يوفر أيضا إمكانية لمراقبة النبات في الوقت الحقيقي من خلال المجهر الخلية الحية أثناء 20،21 عملية العدوى. هنا تم تطبيق المسح بالليزر مضان المجهر لreadouطن من إشارات مضان كما يوفر أعلى حساسية ودقة. على وجه الخصوص، والقدرة على ضبط نافذة الانبعاثات بدقة نانومتر في تركيبة مع كشف حساسة عالية يسهل الأمثل كشف مضان وتقليل عبر الحديث. وبالإضافة إلى ذلك يمكن تكييف هذا الإعداد المجهر لرصد الوقت الحقيقي من النبات ويحتمل أن يسمح للتحليل المتزامن للتفاعل المضيف الممرض على المستوى الخلوي.
في هذه الدراسة معدلات النبات من Y. وقد تم تحليل القولون نوع السلالة البرية والحذف متحولة YopE اظهار النمط الظاهري hypertranslocator 10،11 exemplarily.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الذروة الانبعاثات وتحديد الصليب الحديث (انظر أيضا الشكل 2)
- من أجل تحديد القمم الانبعاثات وكمية من عبر الحديث بين الجهات المانحة (الكومارين مشابه V450) ومتقبل (فلوريسئين) الأصباغ، والقيام بمسح الطيفية من الخلايا المسمى مع كل من fluorophores الفردية في 405 نانومتر الإثارة.
- تحديد عرض النطاق الترددي 10 نانومتر في ذروة كل الصبغة التي سيتم استخدامها لقنوات المانحة ومتقبل (455-465 نانومتر، وهنا 525-535 نانومتر). مؤامرة كثافة تطبيع على الطول الموجي وحساب متوسط نسبة عبر الحديث للصبغ المانحة في القناة متقبل والعكس بالعكس (الشكل 2).
2. إعداد Y. القولون سلالات لخلية الثقافة العدوى
- استخدام السلالات التالية: WA-314 PMK-البويضات (WA-314 تحولت مع البلازميدات PMK-بلوخ 17 و PMK-البويضات 17، على التوالي) وWA-314ΔYopE PMK-بلوخ (WA-314ΔYopE تحولت مع البلازميد PMK-بلوخ 17)
- يومين على الأقل قبل الإصابة خط Y. القولون سلالات WA-314 PMK-البويضات، WA-314 PMK-بلوخ وWA-314ΔE PMK بلوخ-من البرد الأسهم على لوحات LB-أجار التي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة (كانامايسين لWA-314 PMK-بلوخ وWA-314 PMK-البويضات ؛ كانامايسين والتتراسيكلين لWA-314ΔE PMK-بلوخ) وتنمو O / N في 27 ° C. بعد ذلك الحفاظ على لوحات لمدة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية.
- قبل يوم واحد العدوى تطعيم 3 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة مع مستعمرة واحدة من السلالات منها واحتضان O / N في 27 ° C في شاكر في 180 دورة في الدقيقة.
- في يوم من العدوى تطعيم 2 مل من O / N الثقافة في 40 مل من جديد LB متوسطة بدون المضادات الحيوية واحتضان لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر في 180 دورة في الدقيقة للحث على التعبير عن نوع نظام III إفراز.
- نقل الثقافات في أنبوب مناسبة والحفاظ على الثقافات على الجليد أو على 4 درجات مئويةمن الآن فصاعدا. أجهزة الطرد المركزي الثقافات لمدة 10 دقيقة في 5000 x ج و 4 درجات مئوية.
- resuspend الكرية الجرثومي في 2-3 مل من الجليد PBS الباردة. تمييع تعليق البكتيرية إلى تركيز 8 × 10 8 كفو / مل باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحديد الكثافة الضوئية المقابلة بشكل فردي. الحفاظ على هذا التعليق على الجليد حتى يصيب خلايا هيلا.
3. خلايا التصفيحات هيلا
- قبل يوم واحد البذور العدوى 1.5 × 10 4 الخلايا خلايا هيلا في 200 ميكرولتر DMEM تحتوي على 10٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين (FCS) في الآبار من 96 لوحة جيدا وزراعة في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. البذور ثلاثة آبار لكل سلالة (ثلاث مرات حضانة مختلفة).
4. إصابة خلايا هيلا وتحميل مع CCF4
- تصيب خلايا هيلا بإضافة 3.5 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى المتوسط ومزيج من قبل pipetting بلطف المتوسطة مرتين. سماح للبكتيريا على الرسوبيات علىإلى الخلايا في وزارة الداخلية (شاردة من العدوى) من حوالي 100 بكتيريا في كل خلية. لدوام تبدأ العدوى في -90 دقيقة، -60 دقيقة -30 دقيقة و، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة حتى 0 دقيقة لتحقيق نقطة نهاية المشتركة.
- عند اكتمال الحضانة، ونضح بعناية المتوسط دون إزالة خلايا هيلا وإضافة 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول لوقف التعبير عن المؤثرات و 2.5 ملي البروبينسيد للحد من تصدير CCF4.
- في هذه المرحلة نقل لوحة 96-جيدا في مرحلة المجهر وتحديد المواقع المناسبة لتحليلها لاحقا في كل بئر. الانتهاء من هذه الخطوة في غضون 10 دقيقة (للاطلاع على تفاصيل الاستحواذ انظر القسم 5.1).
- لكل بئر، إضافة 70 ميكرولتر من محلول CCF4 / AM تحميل (0.24 ميكرولتر حل A، 1.2 ميكرولتر حل B، 18.56 ميكرولتر حل C (حل A، B، و C المقدمة ضمن CCF4 مجموعة / AM التحميل) و 50 ميكرولتر PBS (التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 2.5 ملي البروبينسيد) باستخدام متعددة صipette واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. من الآن فصاعدا العمل دون انقطاع.
- نضح الحل التحميل وإضافة 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 2.5 ملي البروبينسيد باستخدام ماصة متعددة. ثم نقل بسرعة لوحة 96 بشكل جيد في المرحلة المجهر وبدء الحيازة في غضون 10 دقيقة من تطلع الحل التحميل.
5. الليزر الضوئي المجهري وتحليل البيانات
- الحصول على الصور
- تهيئة الظروف التصوير في وسيلة لتحقيق أقصى قدر من العدد الكلي الفوتون والحد من الضيائية، photobleaching من وعبر الإثارة.
- في متحد البؤر الليزر مجهر المسح الحديثة، واستخدام عالية العددية الهدف فتحة الغمر 20X، فتح الثقب كاشف 2.5 وحدات إيري (أي باجتزاء البصرية واسعة)، واختيار حساسية عالية GaAsP للكشف مع القنوات النشطة في نفس الوقت المانحة ومتقبل، وعمق 8 بت ، ~ 750 نانومتر حجم بكسل، 3 أضعاف إطار المتوسط وكسكيته مع 10٪ من 405 نانومتر ليزر ديود.
- لضمان الكمي الصحيح تعيين مكسب للكشف عن كل من القنوات لنفس القيمة وتجنب أي بكسل المشبعة.
ملاحظة: وهنا، تم تعيين المكاسب إلى 150٪.
- ضمان الغمر المستمر من خلال نشر غمر متوسطة إلى الجزء السفلي من الآبار، على سبيل المثال مع حقنة 1 مل، وتجنب محاصرة أي فقاعات الهواء.
- تفعيل الضوء المرسل وايجاد مجال التمثيل نظر في كل جيدا. استخدام مرحلة التلقائية معايرة بشكل صحيح ووضع علامة على موقف في البرنامج.
- بعد إزالة لوحة لتلطيخ (انظر القسم 4.3)، أعد لوحة وإضافة الوزن على رأس لتجنب الانجراف البؤري. مراجعة المواقف حفظها مع وضع المسح الضوئي ليزر وضبط التركيز والموقف الجانبي بشكل صحيح.
- تعيين الفاصل الزمني لمدة 2 دقيقة، ومدة إلى 2 ساعة وتبدأ الاستحواذ.
- تهيئة الظروف التصوير في وسيلة لتحقيق أقصى قدر من العدد الكلي الفوتون والحد من الضيائية، photobleaching من وعبر الإثارة.
- صورة الكمي (سوف تعطى أمثلة لBitplane تحديثات برامج المزودهي مثل Imaris)
- استيراد بيانات إلى البرمجيات التي تسمح العمليات الحسابية المصفوفات بكسل. القيام بذلك عن طريق سحب وإسقاط الملف المصدر تحتوي على كل من المتبرع وقناة متقبل على أيقونة البرنامج.
- طرح الخلفية في كل القنوات باستخدام معادلة نفسه. للقيام بذلك، انقر فوق القائمة ثم انقر فوق صورة> تجهيز> الأساس الطرح. حدد كل قناة وأدخل القيمة الأساسية.
- تصحيح تنزف من خلال القناة المانحة (CH1) في القناة متقبل (CH2) مع تصحيح عامل و محددة مسبقا (انظر 1.1)، وخلق قنوات جديدة:
CH2 '= CH2 - CH1 * و
وكان من تنزف من خلال لمتقبل في قناة المانحة لا يمكن اكتشافها على مستوى الضوضاء: ملاحظة.- انقر فوق قائمة> معالجة الصور> قناة علم الحساب وأدخل القيمة المطلقة (ch2- (CH1 * 0.33)). بعد ذلك حذف القناة 2 بالنقر فوق قائمة تحرير> حذف> القنوات. ضمانتنزف من خلال تصحيح قناة متقبل يبقى كما القناة الجديدة 2. اختياري: تغيير لون القناة من اللون الرمادي إلى اللون الأصلي عن طريق الذهاب إلى القائمة> تحرير خصائص> صورة. حدد القناة 4> المعينة اللون> قاعدة اللون وتغييره إلى مثل الأخضر.
- إنشاء قناة جديدة مع العملية التالية لتحديد معامل الحنق النسبي:
CH3 CH2 = '/ (CH1 CH2 +')- اذهب إلى القائمة> معالجة الصور> قناة علم الحساب وأدخل CH2 ./ (CH1 CH2 +)
- التصور الصحيح للقناة الحنق في صورة 8 بت، إنشاء قناة الرابعة:
CH4 = 255 * CH3- اذهب إلى القائمة> معالجة الصور> قناة علم الحساب وإدخال 255 * CH3. تغيير لون قناة بالذهاب إلى القائمة> تحرير خصائص> صورة. حدد القناة 4> المعينة ملف جدول اللون> اللون> جيت.
- تطبيق عامل تصفية المتوسط 3X3 إلى قنوات CH3 CH4 وثار سوف يقلل من الضوضاء في الصور. للقيام بذلك، انقر فوق إلى القائمة> معالجة الصور> تنعيم> تصفية متوسط. تحديد كل القنوات وتطبيق حجم مرشح "3x3x1".
- لتقدير الإشارات الخلوية، والكشف عن الخلايا في CH4 عن طريق وضع بشكل صحيح إزاحة وتصفية الهياكل حسب الحجم لاستبعاد هياكل صغيرة جدا.
- حدد تفوق عرض وانقر على أيقونة "إضافة السطوح جديدة". تعريف المعلمات خوارزمية الكشف في إطار السطحية. لمعالجة أسرع، وتفعيل اثنين خانات "الجزء فقط منطقة الفائدة" و "العملية برمتها صورة في نهاية المطاف". تحديد المنطقة ذات الاهتمام بتحرير أبعادها.
- حدد القناة 4 كقناة المصدر وتعيين العتبة مستوى العتبة> خلفية الطرح (التباين المحلي) وتعيين قطرها إلى 10 ميكرون. تعيين الحد الأدنى لعتبة كثافة يدويا إلى 0 والحد الأقصى للعتبة إلى أقصى intensiتاي. تصفية الهياكل حسب المنطقة وتحديد الحد الأدنى لقيمة لمثل 187 μm². الانتهاء من الكشف عن السطح.
- استخراج القيم المتوسطة لكثافة مضان المانحة (CH1) ومعامل الحنق النسبي (CH3) وانحرافاتها المعيارية في الكيان الخلوية. للقيام بذلك، انتقل إلى خصائص السطح. تغيير مظهر الهياكل عن طريق تحديد السطوح النمط / الجودة> السطحية. تحديد كافة الهياكل عن طريق النقر على علامة التبويب المرشحات. توحيد الهياكل الكشف من خلال الذهاب الى عملية الإختيار> توحيد. تصدير إحصاءات السطح لMS Excel عن طريق النقر في علامة التبويب إحصائيات> تصدير جميع الاحصائيات إلى ملف.
- رسم هذه القيم مع مرور الوقت. تحديد الفاصل الزمني 10 دقيقة من منحدر الحد الأقصى لقناة المانحة زيادة مضان لكل حالة كمعلمة معقولة لتمثيل كمية المستجيب translocated. حساب المنحدر كما م = Δ كثافة مضان المانحة الوقت / Δ (دقيقة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات القدرة على الطريقة الموصوفة لتحليل كمي المستجيب النبات إلى الخلايا المستهدفة، تم دراسة سلالتين اليرسنية مع حركية النبات مختلفة: Y. القولون نوع السلالة البرية WA-314 (المصلية O8 أو إيواء البلازميد الفوعة pYVO8 22) ومشتقاته WA-314ΔYopE (WA-314 بإيواء pYVO8ΔYopE 23). وأظهر العمل في وقت سابق أن Y. المسوخ القولون تفتقر الوظيفي المعرض YopE أعلى بشكل ملحوظ معدل النبات يوب 10. تم تحويل كل من سلالات مع ترميز ناقلات للاندماج للن محطة إشارة إفراز YopE وTEM-1 بيتا لاكتاماز (PMK-بلوخ) 17. وWA-314 بالإضافة إلى ذلك تحولت مع ترميز ناقلات لYopE ألبومين البيض الانصهار منها (PMK-البويضات 17) لتكون بمثابة سيطرة سلبية. طبقت مرات حضانة 30 و 60 و 90 دقيقة من أجل مواصلة تقييم method`s الفعال لمجموعةالثاني صلاحيتها للالكمي. واستخدمت اثنين من قراءات مختلفة لتحليل البيانات: مضان المانحة (CH1) ومعاملات الحنق النسبية (CH3 CH2 = '/ (CH1 CH2 +')) (الشكل 1B و 1C).
للسيطرة على سلالة سلبي WA-314-PMK-البويضات التآمر من شدة قناة المانحة (CH1) مع مرور الوقت يظهر أي ارتفاع الانبعاثات مضان بغض النظر عن فترة حضانة (الشكل 1B). في المقابل، في خلايا WA-314-PMK-بلوخ المصابين تم الكشف عن زيادة كثافة مضان بمرور الوقت تشير إلى وجود YopE بيتا لاكتاماز الانصهار في السيتوبلازم الخلية المستهدفة. كما هو متوقع يرتبط المنحدر الحد الأقصى لكثافة مضان بإيجابية مع طول العدوى (30 دقيقة الإصابة: 0.10 / دقيقة، والعدوى 60 دقيقة: 0.33 / دقيقة، والعدوى 90 دقيقة: 0.76 / دقيقة) تشير إلى أن تركيزات مختلفة من بيتا translocated اكتاماز يمكن تمييزها. وفقا للدراسات السابقة WA-314ΔYopE-PMK-بلوخ الخلايا المصابة تبدي زيادة أسرع من كثافة مضان مقارنة نوع السلالة البرية (30 دقيقة الإصابة: 1.28 / دقيقة، 60 دقيقة العدوى: 1.53 / دقيقة، 90 دقيقة العدوى: 1.41 / دقيقة). ومن المثير للاهتمام، وتوسيع العدوى إلى 90 دقيقة لم يقدم مزيدا من تسريع صعود مضان المانحة مقارنة ب 60 دقيقة الإصابة (الشكل 1B). يمكن أن يفترض أن هذا الاكتشاف يمكن تفسيره من خلال تأثير السامة للخلايا التدريجي التي كتبها WA-314ΔYopE-PMK-بلوخ، الذي إما أن تمنع النبات كفاءة وراء 60 دقيقة الإصابة أو تؤدي إلى فقدان الأصباغ مضان بسبب تعطل سلامة غشاء البلازما المبذولة. النتائج المقدمة باستخدام معامل الحنق النسبي (CH3) للتحليل هي وفقا جيدة مع النتائج التي حصلت عليها قناة المانحة وحدها. ومع ذلك، في بعض الظروف (WA-314ΔYopE-PMK-بلوخ و 60 و 90 الإصابة دقيقة) تمثل كميات كبيرة جدا من translocated الانصهار بيتا لاكتاماز، وكان من الواضح أن الركيزة CCF4 فيمعالجة البرنامج التشغيلى قبل أن يتم بدء التصوير. ومن شأن هذه الظروف لن تسمح لحساب أقصى ميل سلبي معقول لأنه غاب عن الجزء ذي الصلة من منحنى في هذا تمثيل البيانات (الشكل 1C). صور النسبية الحنق قناة معامل توفر إمكانية مقارنة الاختلافات بين الخلايا الفردية (1D الشكل).
الشكل 1. التحليل الكمي للالمستجيب النبات عن طريق اندماج TEM-1 YopE في Y. القولون. تم رصد (A) التحلل من CCF4 الركيزة التي translocated TEM-1 بيتا لاكتاماز عن طريق المسح الضوئي ليزر المجهري. الإثارة في 405 نانومتر أدى إلى انبعاث مضان أخضر (530 نانومتر) الركيزة سليمة والانبعاثات مضان الأزرق (460 نانومتر) من التحلل العلاقات العامة المشقوقالعامة oduct (الكومارين). (B، C) بيانات المجهر حللت كميا بواسطة المتهم بالتآمر في كثافة قناة المانحة (CH1) أو حساب والتآمر للمعاملات الحنق النسبية (CH3 CH2 = '/ (CH1 CH2 +')). البيانات هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة. (D) الميكروسكوب صورت (الحنق قناة) اتخذت من الأفلام التمثيلية في النقاط الزمنية المشار إليها. WA-314ΔE-PMK-بلوخ تظهر الخلايا المصابة الانخفاض السريع لمعاملات الحنق النسبية بالمقارنة مع النوع البري WA-314-PMK-بلوخ (60 الإصابة دقيقة). شريط النطاق، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تقرير عبر الحديث عن V450 fluorophores وFITC.تم قياس أطياف كلا fluorophores الفردية مع المجهر متحد البؤر. تم احتساب ينزف من خلال لV450 المانحة في القناة متقبل في نطاق 525-535 نانومتر للكشف عن من الانحدار الخطي (إدراج). نسبة متوسط من الحديث المتبادل تحسب من اثنين من القياسات يساوي 0.33. كان ينزف من خلال لFITC متقبل في قناة المانحة (455-465 نانومتر) لا يمكن كشفها على مستوى الضوضاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا طبقت بنجاح مقايسة على أساس TEM-1 مراسل بيتا لاكتاماز للتحليل الكمي من المستجيب النبات عن طريق Y. القولون. وقد وصفت العديد من الأشكال المختلفة لهذه التقنية حساسة ومحددة واضحة نسبيا في الأدب. في هذه الدراسة تم إجراء المسح الضوئي ليزر المجهري للكشف الأكثر حساسية ودقة من إشارات مضان. على وجه التحديد تصحيح عبر الحديث بين الأصباغ المانحة ومتقبل وعرض النطاق الترددي الكشف قابل للتعديل بشكل فردي تسمح دقة فائقة القياس بالمقارنة مع الأشكال الأخرى من هذه الطريقة. النتائج تظهر بوضوح أن هذه الطريقة قادرة على تحليل كمي النبات. كانت مرتبطة مرات حضانة مختلفة تمثل تركيزات مختلفة من الخلايا بيتا لاكتاماز بإيجابية مع المنحدر من كثافة مضان المانحة. أيضا معدل النبات أعلى بكثير من WA-314ΔYopE مقارنةلنوع السلالة البرية يمكن أن يثبت WA-314.
طبقت اثنين من الخيارات البديلة لتحليل البيانات: شدة قناة المانحة ومعاملات الحنق النسبية. وميزة استخدام القناة المانحة هو أنه يمثل مباشرة تراكم منتج التحلل CCF-4 (الكومارين). هذا النهج هو ممكن في الإعداد المجهري، لأن خلاف في تصحيح قارئ لوحة للاختلافات في كثافة الخلايا باستخدام نسبة من الجهات المانحة / متقبل ليست ضرورية. ومع ذلك، تصدير الصبغة CCF4 أو منتجات التحلل من لا يزال من الممكن المحير في هذا النهج. هذا العيب يمكن التغلب عليها عن طريق حساب معامل الحنق النسبي.
في التجارب الإعداد وصف أجريت في 96 لوحات جيدة. هذا الشكل يسمح لاختبار شروط متعددة في تجربة واحدة، ويساعد على حفظ المواد الكيميائية مكلفة (على وجه التحديد CCF4 / AM تحميل عدة). في سير العمل وصفته أمر بالغ الأهمية لبدء الدردشةاكتساب العمر عند نقطة زمنية محددة بعد فترة وجيزة إضافة CCF4 / AM تحميل الحل لأن التحلل من CCF4 من قبل translocated بيتا لاكتاماز يبدأ على الفور. في حالة التجهيز لظروف كثيرة في وقت واحد، وتعديل التركيز والمواقف الجانبية (الخطوة 5.1.4) قد يستغرق وقتا طويلا وتعرقل البدء في الوقت المناسب من الحصول على الصور. وبالتالي فإن الحد الأقصى لعدد العينات موازية يحتاج إلى أن تحدد بشكل فردي.
كان واحدا من أهم المشاكل التي واجهت باستخدام هذه الطريقة تصدير كبيرا من CCF4 الركيزة من قبل خلايا هيلا في 37 ° C. هذه الظاهرة لا يمكن تصدى بما فيه الكفاية عن طريق علاج الخلايا مع البروبينسيد. لذا قررنا، بدلا من مراقبة النبات خلال العدوى مستمر كما هو موضح سابقا، لأول عدوى كاملة وبعد ذلك تحميل الخلايا مع CCF4 / AM الصبغة. مع هذا النهج كان من الممكن لمراقبة تجهيز الركيزة CCF4 في RT. في ظل هذه الظروف reduوقد لوحظ تصدير دائرة الهندسة المدنية من CCF4. يبدو أن كمية الصادرات من CCF4 الركيزة لتكون خط خلية معينة. الإعداد الموصوفة هنا يسمح للتحليل موثوق من النبات أيضا في خطوط الخلايا، التي تصدر بقوة CCF4 عند 37 درجة مئوية.
تصدير CCF4 ليست مشكلة في بعض خطوط الخلايا الأخرى والسماح لاعتماد الإعداد المجهر لرصد عمليات العدوى والنبات في وقت واحد في الوقت الحقيقي. وهذا يوفر إمكانية لتحليل النبات في الخلايا الفردية، ويمكن أن تستخدم لربط النبات مع أحداث معينة للتفاعل الخلية المضيفة مثل التصاق البكتيريا أو تشكيل-المستعمرات الدقيقة 20. لذلك، هذا الاختبار هو أداة قيمة لزيادة توضيح آليات كيف يتم تنظيم النبات خلال التفاعل بين البكتيريا والخلايا المضيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
