Abstract
Muchas bacterias gram-negativas, incluyendo patógenos Yersinia spp. Emplean tipo III sistemas de secreción de trasladar proteínas efectoras en células diana eucariotas. Dentro de la célula huésped proteínas efectoras manipular las funciones celulares en beneficio de las bacterias. Para comprender mejor el control de la secreción de tipo III durante la interacción célula huésped, sensible y ensayos precisos para medir la translocación son obligatorios. Se describen la aplicación de un ensayo basado en la fusión de un fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína externa Yersinia; YopE). Con TEM-1 beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación El ensayo se basa en la escisión de una célula permeante FRET de colorante (CCF4 / AM) translocado por fusión beta-lactamasa. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina de CCF4 por la beta-lactamasa, FRET de cumarina a la fluoresceína se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul.Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, en un modelo de ratón. La detección de las señales de fluorescencia se puede realizar utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. En la configuración descrita aquí, en la translocación vitro de fusiones efectoras en células HeLa por diferentes mutantes Yersinia es supervisado por microscopía de barrido láser. Grabación de la conversión intracelular de la reportero FRET por el efector de fusión beta-lactamasa en tiempo real proporciona resultados cuantitativos robustos. Aquí mostramos los datos de ejemplares, lo que demuestra una mayor translocación por una Y. enterocolitica YopE mutante en comparación con la cepa de tipo salvaje.
Introduction
Tipo III sistemas de secreción son máquinas especializadas proteína de exportación utilizados por diferentes géneros de bacterias gram-negativas para entregar directamente proteínas efectoras bacterias codificados en las células diana eucariotas. Mientras que la maquinaria de secreción en sí está altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras han evolucionado entre las diferentes especies bacterianas para manipular vías de señalización celular y facilitar estrategias de virulencia bacterianas específicas 1. En caso de Yersinia, hasta siete proteínas efectoras, llamados (proteínas externas de Yersinia) Yops, se translocan al entrar en contacto la célula huésped y actuar conjuntamente para subvertir las respuestas de células inmunes tales como la fagocitosis y producción de citoquinas, es decir, para permitir la supervivencia extracelular de las bacterias 2-4. El proceso de translocación está estrechamente controlada en las diferentes etapas 5. Se establece que la activación primaria de la T3SS se desencadena por su contacto con el ce objetivoll 6. Sin embargo, el mecanismo exacto de esta iniciación aún no se ha dilucidado. En Yersinia un segundo nivel de la llamada puesta a punto de la translocación se consigue altura o baja regulación de la actividad de las proteínas celulares Rho GTP vinculante Rac1 o RhoA. La activación de Rac1 por ejemplo invasina o citotóxico del factor necrosante Y (CNF-Y) conduce a una mayor translocación 7-9, mientras que el GAP (proteína activadora de GTPasa) Función de translocado YopE abajo-regula la actividad de Rac1 y en consecuencia disminuye la translocación por un tipo de retroalimentación negativa de mecanismo de 10,11.
Métodos válidos y precisos son el requisito previo para investigar cómo se regula la translocación durante la interacción célula huésped Yersinia. Muchos sistemas diferentes se han utilizado para este propósito, cada uno con ventajas y desventajas específicas. Algunos enfoques se basan en la lisis de las células infectadas pero no bacterias por diferentes detergentes seguido por análisis de transferencia Western. The inconveniente común de estos métodos es que la lisis bacteriana menor pero inevitable potencialmente contamina el lisado celular con proteínas efectoras bacterias asociadas. Sin embargo, se propusieron tratamiento de células con proteinasa K para degradar las proteínas efectoras extracelulares y uso posterior de digitonina para la lisis selectiva de las células eucariotas para minimizar este problema 12. Es importante destacar que estos ensayos dependen crucialmente anticuerpos anti-efectoras de alta calidad, que en su mayoría no están disponibles comercialmente. Los intentos de utilizar fusiones traduccionales de las proteínas efectoras y las proteínas fluorescentes como GFP para controlar la translocación no tuvieron éxito debido probablemente a la estructura terciaria globular de las proteínas fluorescentes y la incapacidad del aparato de secreción a desplegarse antes de la secreción de 13. Sin embargo, varias etiquetas diferentes reportero como el cya (calmodulina dependiente adenilato ciclasa) dominio de la toxina Bordetella pertussis cyclolysin 14 o Flashetiqueta se utiliza con éxito para analizar la translocación. En el primer ensayo se usa la actividad enzimática de cya para amplificar la señal de la proteína de fusión intracelular, mientras que la etiqueta Flash, un tiempo muy corto de tetracisteína (4Cys) tag motivo, permite el etiquetado con el flash colorante biarsénico sin perturbar el proceso de la secreción 15.
El enfoque aplicado aquí se informó por primera vez por Charpentier et al., Y se basa en la conversión intracelular de la transferencia de energía de resonancia Förster (FRET) colorante CCF4 por translocados efector TEM-1 beta-lactamasa fusiones 16 (Figura 1A). CCF4 / AM es un compuesto de células permeante en el que un derivado de cumarina (donante) y un resto de fluoresceína (aceptor) están unidas por un núcleo de cefalosporina. A la entrada pasiva en la célula eucariota, la no fluorescente esterificado compuesto CCF4 / AM es procesada por esterasas celulares a la CCF4 cargado y fluorescente y por lo tanto atrapadodentro de la célula. La excitación de la fracción de cumarina a 405 nm en los resultados de FRET a la fracción de fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 530 nm. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina por la FRET beta-lactamasa se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul at460 nm. Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, se utilizó la técnica en un modelo de infección de ratón para identificar las poblaciones de leucocitos específicos para la translocación in vivo 17-19 de. Lectura de las señales puede llevarse a cabo utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. Es de destacar que el método también ofrece la posibilidad de controlar la translocación en tiempo real mediante microscopía de células vivas durante el proceso de infección 20,21. Aquí microscopía de fluorescencia de escaneo láser se aplicó durante readout de señales de fluorescencia, ya que proporciona mayor sensibilidad y precisión. En particular, la capacidad para ajustar la ventana de emisión con una precisión nanométrica en combinación con detectores de alta sensibilidad optimizada facilita la detección de fluorescencia y minimizar la diafonía. Además esta configuración microscopía puede ser adaptado para la monitorización en tiempo real de translocación y potencialmente permite para el análisis simultáneo de interacción huésped-patógeno a nivel celular.
En este estudio, las tasas de translocación de una Y. Se analizaron ejemplarmente enterocolitica cepa de tipo salvaje y un mutante de deleción YopE exhibiendo un fenotipo hypertranslocator 10,11.
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Protocol
1. pico de emisión y Cross-talk Determinación (véase también la Figura 2)
- Con el fin de determinar los picos de emisión y la cantidad de cross-talk entre el donante (cumarina derivado V450) y el aceptor (fluoresceína) colorantes, realizar análisis espectrales de células marcadas con ambos fluoróforos individuales en 405 nm de excitación.
- Determinar un ancho de banda 10 nm dentro del pico de cada colorante que se utilizará para los canales de donante y aceptor (desde 455 hasta 465 nm y aquí 525-535 nm). Trazar la intensidad normalizada sobre la longitud de onda y calcular el porcentaje medio de diafonía del colorante donante en el canal aceptor y viceversa (Figura 2).
2. Preparación de Y. enterocolitica cepas de células Infección Cultura
- Utilice las siguientes cepas: WA-314-PMK óvulos (WA-314 transformada con los plásmidos PMK-bla 17 y PMK-ova 17, respectivamente) y WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE transformadas con el plásmido PMK-bla 17)
- Al menos dos días antes de la infección por Y. racha enterocolitica cepas WA-314 PMK-óvulos, WA-314 PMK-bla y WA-314ΔE PMK Bla-de crio existencias en placas de agar LB que contenían los antibióticos necesarios (kanamicina para WA-314 PMK-bla y WA-314 PMK-ova ; kanamicina y tetraciclina para WA-314ΔE PMK-bla) y crecer O / N a 27 ° C. Posteriormente mantener las placas durante hasta una semana a 4 ° C.
- Un día antes de la infección inocular 3 ml de medio LB que contienen los antibióticos necesarios con una colonia de las cepas respectivas e incubar O / N a 27 ° C en un agitador a 180 rpm.
- En el día de la infección inocular 2 ml del cultivo O / N en 40 ml de medio LB fresco sin antibióticos y se incuba durante 90 min a 37 ° C en un agitador a 180 rpm para inducir la expresión del sistema de secreción de tipo III.
- Transfiera las culturas en un tubo adecuado y mantener las culturas en hielo oa 4 ° Cde ahora en adelante. Centrifugar los cultivos durante 10 minutos a 5000 xg y 4 ° C.
- Resuspender el sedimento bacteriano en 2-3 ml de PBS helado. Diluir la suspensión bacteriana a una concentración de 8 x 10 8 ufc / ml mediante el uso de un espectrofotómetro. Determinar la densidad óptica correspondiente individualmente. Mantenga esta suspensión en hielo hasta que la infección de las células HeLa.
3. Las células HeLa Chapado
- Un día antes de semilla de infección de 1,5 x 10 4 células HeLa en 200 l DMEM que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal de ternera (FCS) en pocillos de una placa de 96 pocillos y cultivar en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C. Semillas tres pozos para cada cepa (tres tiempos de incubación diferentes).
4. Infección de células HeLa y cargar con CCF4
- Infectar las células HeLa mediante la adición de 3,5 l de la suspensión bacteriana a medio y mezclar pipeteando suavemente el medio dos veces. Permitir que las bacterias se sedimentan ena las células a una MOI (fracción de infección) de alrededor de 100 bacterias por célula. Para un curso de tiempo de inicio infecciones a -90 min, -60 min y -30 min y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% hasta 0 min para lograr un punto final común.
- Cuando se ha completado la incubación, aspirar cuidadosamente el medio sin la eliminación de las células HeLa y añadir 50 l de PBS que contenía 20 mg / ml de cloranfenicol para detener la expresión de efectores y probenecid 2,5 mM para reducir la exportación de CCF4.
- En este punto, la transferencia de la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio y definir los lugares adecuados para su posterior análisis en cada pocillo. Termine este paso dentro de 10 minutos (para los detalles de la adquisición de ver sección 5.1).
- Por pocillo, añadir 70 l de solución de CCF4 / AM de carga (solución de 0,24 l A, 1,2 l solución B, 18,56 l solución C (solución A, B, y C, siempre dentro de kit / AM carga CCF4) y 50 l de PBS (que contienen 20 g / ml de cloranfenicol y probenecid 2,5 mM) usando un multi pipette e incubar durante 5 min a TA. A partir de ahora el trabajo sin interrupciones.
- Aspirar la solución de carga y añadir 100 l de PBS que contenía 20 mg / ml de cloranfenicol y probenecid 2,5 mM usando un multi pipeta. A continuación, traslado rápido de la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio y comenzar la adquisición dentro de los 10 min de la aspiración de la solución de carga.
5. barrido láser microscopía y análisis de datos
- Adquisición de imágen
- Establecer las condiciones de formación de imágenes de una manera de maximizar el número total de fotones y minimizar fototoxicidad, photobleaching y cross-excitación.
- En un moderno microscopio láser confocal de barrido, utilice un alto objetivo de inmersión apertura numérica 20X, abrir el agujero de alfiler del detector de 2,5 unidades Airy (es decir, seccionamiento óptico gran angular), elija de alta sensibilidad GaAsP Detectores con donante y aceptor canales simultáneamente activas, profundidad de 8 bits , ~ 750 nm tamaño de píxel, 3 veces promediado marco y ExcitE con 10% de un láser de diodo de 405 nm.
- Para garantizar la correcta cuantificación establecer la ganancia del detector de ambos canales en el mismo valor y evitar los píxeles saturados.
Nota: En este caso, las ganancias se establecen en 150%.
- Asegúrese de inmersión continua por medio de difusión de la inmersión hasta el fondo de los pozos, por ejemplo, con una jeringa de 1 ml, y evitar la captura de burbujas de aire.
- Activar la luz transmitida y encontrar un campo representante de vista en todos los pozos. Utilice una etapa automática calibrada correctamente y marcar la posición en el software.
- Después de la eliminación de la placa para la tinción (ver sección 4.3), vuelva a insertar la placa y añadir un peso en la parte superior para evitar la deriva focal. Revise las posiciones guardadas con el modo de escaneo láser y ajustar el enfoque y la posición lateral correctamente.
- Ajuste el lapso de tiempo de 2 minutos, la duración de 2 horas y comenzar la adquisición.
- Establecer las condiciones de formación de imágenes de una manera de maximizar el número total de fotones y minimizar fototoxicidad, photobleaching y cross-excitación.
- Cuantificación de imagen (ejemplos se dan para Bitplane Softwson tales como Imaris)
- Importe el conjunto de datos en un software que permite a los cálculos aritméticos de matrices de píxeles. Para ello, arrastrar y soltar el archivo de origen que contiene tanto el donante como el canal aceptor en el icono del software.
- Reste el fondo en ambos canales usando el mismo desplazamiento. Para ello, haga clic en Menú y luego haga clic en Imagen> Tratamiento> Base Resta. Seleccione cada canal e introduzca el valor basal.
- Corregir el sangrado a través del canal de donante (Ch1) en el canal aceptor (CH2) con el factor de corrección f pre-determinado (véase 1.1), la creación de un nuevo canal:
Ch2 '= CH2 - Ch1 * f
NOTA: Una purga a través del aceptor en el canal de donante no fue detectable por encima del nivel de ruido.- Haga clic en Menú> Procesamiento de Imágenes> Canal Aritmética y entrar abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Posteriormente eliminar Canal 2 haciendo clic en Menú> Editar> Borrar Canales. Asegúrese de que elpurga a través del canal aceptor corregida queda como nuevo canal 2. Opcional: Cambie el canal de color del gris al color original, vaya a Menú> Propiedades Editar> Imagen. Seleccione el canal 4> asignada color> Color Base y cambiarlo a, por ejemplo, verde.
- Crear un nuevo canal con la siguiente operación para determinar el coeficiente relativo FRET:
Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')- Vaya a Menú> Procesamiento de Imágenes> Canal Aritmética y entrar ch2 ./ (CH1 + CH2)
- Para la visualización correcta del canal de FRET en una imagen de 8 bits, crear un cuarto canal:
Ch4 = 255 * Ch3- Vaya a Menú> Procesamiento de Imágenes> Canal Aritmética y escriba 255 * ch3. Cambie el color de canal por ir a Menú> Propiedades Editar> Imagen. Seleccione el canal 4> asignada color> Color Cuadro Archivo> Jet.
- Aplicar un filtro de mediana de 3x3 a los canales CH3 y CH4 that reducirá el ruido en las imágenes. Para ello, haga clic a Menú> Procesamiento de Imágenes> Suavizar> La mediana de filtro. Seleccione ambos canales y aplicar un tamaño de filtro "3x3x1".
- Para la cuantificación de señales celulares, detectar las células de CH4 configurando adecuadamente el desplazamiento y filtrar las estructuras por tamaño para excluir estructuras demasiado pequeñas.
- Seleccione el Surpass Ver y haga clic en el icono de "Añadir nuevas superficies". Definir los parámetros del algoritmo de detección en la ventana de la superficie. Para un procesamiento más rápido, activar el dos casillas de verificación "Segmento solamente una zona de interés" y "toda imagen del proceso, finalmente". Definir la región de interés mediante la edición de sus dimensiones.
- Seleccione el canal 4 como canal de origen y establecer el umbral Umbral> Sustracción de fondo (Contraste Local) y ajuste de diámetro a 10 micras. Ajuste el umbral de intensidad mínima manualmente a 0 y el umbral máximo a la intensificación máximadad. Filtre las estructuras por área y establecer el valor mínimo a, por ejemplo, 187 μm². Termine la detección superficie.
- Extraer los valores medios de intensidad de la fluorescencia del donante (Ch1) y el coeficiente de FRET relativa (CH3) y sus desviaciones estándar en la entidad celular. Para ello, vaya a las propiedades de la superficie. Cambiar el aspecto de las estructuras mediante la selección de superficies Estilo / Calidad> Superficie. Seleccione todas las estructuras haciendo clic en la ficha filtros. Unificar las estructuras detectadas por ir al proceso de selección> Unify. Exportar las estadísticas de superficie a MS Excel haciendo clic en la pestaña de estadísticas> Exportar Estadísticas de archivo.
- Trazar estos valores a través del tiempo. Identificar el intervalo de 10 min de máxima pendiente del incremento de fluorescencia del canal de donantes para cada condición como un parámetro razonable para representar la cantidad de efector translocado. Calcular la pendiente m = Δ como la intensidad de fluorescencia del donante / tiempo Δ (min).
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Representative Results
Para demostrar la capacidad del método descrito para analizar cuantitativamente efector translocación en las células diana, se estudiaron dos cepas de Yersinia con diferentes cinéticas de translocación: Y. enterocolitica cepa de tipo salvaje WA-314 (serogrupo O8, que alberga el plásmido de virulencia pYVO8 22) y su derivado WA-314ΔYopE (WA-314 albergar pYVO8ΔYopE 23). Trabajos anteriores mostraron que Y. mutantes que carecen enterocolitica exhibición YopE funcional una significativamente mayor tasa Yop translocación 10. Ambas cepas fueron transformadas con vectores que codifican para las fusiones de la señal de secreción N-terminal de YopE y TEM-1 beta-lactamasa (PMK-bla) 17. WA-314 se transformó adicionalmente con un vector que codifica para una respectiva fusión ovoalbúmina YopE (PMK-ova 17) para servir como un control negativo. Tiempos de incubación de 30, 60 y 90 min se aplicaron a fin de evaluar aún más la gama efectiva method`s unand idoneidad para la cuantificación. Dos lecturas diferentes se utilizaron para el análisis de datos: la fluorescencia de los donantes (CH1) y los coeficientes de FRET relativos (Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')) (Figura 1B y 1C).
Para la cepa control negativo WA-314-PMK-óvulos trazado de las intensidades de los canales de los donantes (Ch1) con el tiempo no muestra aumento de la emisión de fluorescencia con independencia del tiempo de incubación (Figura 1B). Por el contrario, en las células WA-314-PMK-bla infectados se detectó un aumento de la intensidad de fluorescencia con el tiempo indica la presencia de beta-lactamasa YopE de fusión en el citoplasma de la célula diana. Como era de esperar la pendiente máxima de la intensidad de fluorescencia se correlaciona positivamente con la longitud de la infección (30 min de la infección: 0.10 / min, 60 min infección: 0.33 / min, 90 min infección: 0.76 / min) lo que indica que diferentes concentraciones de beta-translocado lactamasa puede ser distinguido. De acuerdo con estudios previos WA-31Células infectadas 4ΔYopE-PMK-Bla exhiben más rápido aumento de la intensidad de fluorescencia en comparación con la cepa de tipo salvaje (30 min de la infección: 1.28 / min, 60 min infección: 1.53 / min, 90 min infección: 1.41 / min). Curiosamente, la expansión de la infección a 90 min no acelerar aún más el aumento de la fluorescencia del donante en comparación con 60 min de la infección (Figura 1B). Este hallazgo, presumiblemente, puede explicarse por el efecto citotóxico progresiva ejercida por WA-314ΔYopE-PMK-bla, lo que podría inhibir la translocación eficiente ya sea más allá de 60 min de infección o conducir a la pérdida de los tintes de fluorescencia debido a la interrupción de la integridad de la membrana plasmática. Los resultados proporcionados por FRET usando el coeficiente relativo (CH3) para el análisis están en buen acuerdo con los resultados obtenidos por el canal de donantes solo. Sin embargo, en algunas condiciones (WA-314ΔYopE-PMK-Bla, 60 y 90 min infección) que representan cantidades muy grandes de translocado fusión beta-lactamasa, obviamente, el sustrato estaba en CCF4constantemente procesado antes se pudo iniciar de imágenes. Estas condiciones no permitirían que para el cálculo de una pendiente negativa máximo razonable debido a que la parte pertinente de la curva se perdió en esta representación de datos (Figura 1C). Imágenes de la relación canal coeficiente FRET ofrecen la posibilidad de comparar las diferencias entre las células individuales (Figura 1D).
Figura 1. Análisis cuantitativo de la translocación efector por fusiones TEM-1 YopE en Y. enterocolitica. (A) La hidrólisis del sustrato por CCF4 translocado TEM-1 beta-lactamasa se controló por microscopía de barrido láser. La excitación a 405 nm dio lugar a la emisión de fluorescencia verde (530 nm) del sustrato intacto y en la emisión de fluorescencia azul (460 nm) de la pr hidrólisis escindidooducto (cumarina). (B, C) se analizaron los datos Microscopía cuantitativamente mediante el trazado de la intensidad canal de donante (Ch1) o el cálculo y el trazado de los coeficientes relativos de FRET (CH3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (D) micrografías Representado (FRET canal) se tomaron de películas representativas en los puntos de tiempo indicados. WA-314ΔE-PMK-bla células infectadas muestran disminución más rápida de los coeficientes de FRET relativos en comparación con el tipo salvaje WA-314-PMK-bla (60 min infección). Barra de escala, 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Determinación de la Cruz-charla de la V450 fluoróforos y FITC.Los espectros de ambos fluoróforos individuales se midieron con el microscopio confocal. Bleed-a través del V450 de donantes en el canal aceptor dentro del rango de 525 a 535 nm detector se calculó a partir de una regresión lineal (inserto). El porcentaje medio de diafonía calculado a partir de dos mediciones es igual a 0,33. Purgar a través del FITC aceptor en el canal de donantes (455-465 nm) no era detectable por encima del nivel de ruido. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Estamos aquí, aplicado con éxito un ensayo basado TEM-1 reportero beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación efector por Y. enterocolitica. Muchas variaciones diferentes de esta técnica sensible, específico y relativamente sencillo han sido descritos en la literatura. En este estudio de microscopía de barrido láser se llevó a cabo para la detección más sensible y precisa de las señales de fluorescencia. Específicamente, la corrección para la diafonía entre el donante y aceptor de tintes y los anchos de banda de detección ajustables individualmente permiten una precisión superior de la medición en comparación con otras variaciones del método. Los resultados muestran claramente que el método es capaz de analizar cuantitativamente la translocación. Diferentes tiempos de incubación que representan diferentes concentraciones de beta-lactamasa intracelular se correlacionó positivamente con la pendiente de la intensidad de fluorescencia del donante. También una tasa de translocación significativamente mayor de la WA-314ΔYopE comparacióna la cepa de tipo salvaje WA-314 se pudo demostrar.
Se aplicaron dos opciones alternativas para el análisis de datos: intensidades de los canales de Donantes y coeficientes relativos FRET. La ventaja de utilizar el canal de donantes es que representa directamente la acumulación de un producto de hidrólisis CCF-4 (cumarina). Este enfoque es posible en una configuración microscópica, porque aparte de en un lector de placas de corrección para las diferencias en densidades de células mediante el uso de una relación de donador / aceptor no es necesario. Sin embargo, la exportación del colorante CCF4 o sus productos de hidrólisis es todavía un posible factor de confusión en este enfoque. Esta desventaja se puede superar mediante el cálculo del coeficiente de FRET relativa.
En los experimentos de configuración descritas se realizaron en placas de 96 pocillos. Este formato permite para las pruebas de varias condiciones en un solo experimento y ayuda a ahorrar productos químicos caros (específicamente kit cargando CCF4 / AM). En el flujo de trabajo descrito es fundamental para iniciar imadquisición de edad en un punto de tiempo definido, poco después de la adición de la solución de carga CCF4 / AM porque hidrólisis de CCF4 por la beta-lactamasa trasladadas inicia inmediatamente. En caso de tratamiento de muchas condiciones a la vez, el ajuste de enfoque y posiciones laterales (paso 5.1.4) puede tomar mucho tiempo y obstaculizar un comienzo puntual de adquisición de imágenes. Por lo tanto, el número máximo de muestras paralelas necesita ser determinado individualmente.
Uno de los principales problemas encontrados usando este método fue la considerable exportación de sustrato CCF4 por las células HeLa a 37 ° C. Este fenómeno no podía ser suficientemente contrarrestada por el tratamiento de las células con probenecid. Por lo tanto, decidimos, en lugar de monitoreo translocación durante la infección en curso como se describe anteriormente, a primera infección completa y después cargar las células con el colorante CCF4 / AM. Con este enfoque fue posible supervisar el tratamiento del sustrato CCF4 a TA. Bajo estas condiciones reduSe observó la exportación ced de CCF4. La cantidad de exportación de sustrato CCF4 parece ser la línea celular específica; la configuración descrita aquí permite el análisis fiable de translocación también en líneas celulares, que exportan fuertemente CCF4 a 37 ° C.
Exportación de CCF4 no es un problema en algunas otras líneas celulares que permiten a adoptar la configuración de microscopía para el seguimiento de los procesos de infección y translocación simultáneamente en tiempo real. Esto proporciona la posibilidad de analizar la translocación en células individuales y podría ser utilizado para correlacionar la translocación con eventos específicos de interacción célula huésped como la adhesión bacteriana o la formación de micro-colonias 20. Por lo tanto, este ensayo es una herramienta valiosa para aclarar aún más los mecanismos de cómo se regula la translocación durante la interacción de las bacterias y células huésped.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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