Summary
Kanaler for transport av vannmolekyler i enzymer påvirker aktive sete solvatering og katalyse. Heri presenterer vi en protokoll for prosjektering av disse ekstra katalytiske motivene basert på in silico datamodellering og eksperimenter. Dette vil øke vår forståelse av påvirkning av løsemiddel dynamikk på enzymkatalyse.
Introduction
Vann utgjør en hjørnestein for kjemien i livet en. Vann mønstre og solvatering av enzym aktive seter påvirke både entalpi og entropi av ligandbinding 1,2 og katalyse 3 i en svært komplisert måte strekker seg utover den hydrofobe effekten 2,3. NMR 4, har kalorimetri 2 og molekylær modellering av solvaterte proteiner blitt brukt til å kaste lys over den rollen eksplisitte vannmolekyler i å gi en drivkraft for ligand forening 5-8, spesifisitet og aktivitet 2,9,10. Heri presenterer vi en unik metode for den eksperimentelle vurdering av termodynamiske virkningen av løsningsmiddel forskyvning av enzymkatalyse (figur 1). Vår samlede strategi er basert på bruk av datasimulering i konsert med enzym engineering og termodynamisk analyse (figur 1). Dette åpner for å kaste ytterligere lys over virkningen av løsemiddel dynamikk på catalysis, som for tiden er dårlig forstått.
Stabiliserende entalpiske interaksjoner, levert av vann-mediert hydrogenbindinger i solvatisert enzym aktive nettsteder, kan bli motvirket av entropiske straffer 1. Disse entropiske kostnadene er knyttet til reduksjon i antall frihetsgrader som vises av vannmolekyler innestengte hulrom innenfor protein, sammenlignet med vann i bulk 5. Utgivelsen av bestilte vannmolekyler kan dermed gi en entropic pådriver for ligand foreningen en og katalyse tre. Et viktig aspekt av løsemiddel dynamikk er forskyvningen av vannmolekyler mellom det indre av proteiner og utvendig løsningsmidlet 4. De etterfølgende endringer i aktiveringsenergien, entalpi og entropi 11 ikke er fullstendig forstått på det molekylære nivå. Ved å hindre enkelte tunneler med ansvar for transporten av vann i enzymer, viktigheten av løsemiddel dynamikk og dens bidrag til aktiveringsenergi kan evalueres (figur 1). Dessuten, ved å utføre en-pottekinetiske eksperimenter ved forskjellige temperaturer, de relative termodynamiske aktiveringsparametrene til flere substrater kan ekstraheres fra et redusert antall eksperimenter (figur 1, til høyre). Vårt tverrfaglige metoden er validert for komplekse membranbundne triterpene syklase enzymer som genererer polysykliske terpener av høy viktighet for livet 12. Protokollen muliggjør utvinning av store mengder membranprotein (10-20 mg / l) ved hjelp av en standard sentrifuge.
Selv om enzymer utviklet seg i vann, er rollen som løsningsmiddel for å fremme katalyse vanligvis neglisjert. I tillegg til protein dynamikk 13,14 at formen pre-organiserte aktive områder med elektro komplementaritet til overgangen staten 15, kan vann dynamikk være av stor betydning for effektiv enzymkatalyse. Ved å smi en rekke tverrfaglige teknikker, vårMålet er å legge til rette for svært komplekse undersøkelse av vanndynamikk og termodynamikk. Å gjøre disse verktøyene mer tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet vil føre til utvikling av nye strategier i enzym engineering og protein design for endrede aktiviteter og særegenheter.
Protocol
1. I Silico datamodellering
- Last ned en PDB struktur av proteinet av interesse fra protein data bank (PDB). Forbered strukturen ved å fjerne overflødig underenheter og deretter legge til manglende hydrogenatomer og eksplisitt løsemiddel ved hjelp av "Cell Nøytralisering og p K en prognose" eksperiment i YASARA 16. For membranbundne triterpene cyclases, egnede dimensjoner av vannet boksen er 91x67x77 Å. Juster protonering tilstand av de katalytisk aktive aminosyrer manuelt.
Merk: Hvis det er nødvendig, kan en substratanalog i PDB filen endres til en reell underlaget ved å bruke "Edit | Swap | Atom" kommandoen. - Minimer strukturen av "Energy Minimering" kommandoen bruker ORANSJE kraftfelt suite 17. Bruk partikkel mesh Ewald tilnærming (PME) 18 å gjøre rede for langtrekkende elektrostatiske interaksjoner. Sett cut-off for van der Waals interaksjoner henholdtil standardinnstillinger.
Merk: "Energy Minimering" kommandoen fjerner conformational stress ved en kort bratteste nedstigningen minimering, deretter en simulert annealing (timestep 2 fsec, atom hastigheter skalert ned med 0,9 hvert 10. trinn) utføres inntil konvergens er nådd (dvs. forbedring av energi med mindre enn 0,012 kcal / mol per atom i 200 trinn).
2. Modell av Active nettstedet samle og vanntilgang
- Etter simulert annealing, kjøre en 20 EFFs molekyldynamikk (MD) bane og generere minst 10 snapshots av "Fil | Lagre som | Simulering Snapshot" kommando etterfulgt av "Simulering On". Kjør simuleringer på en standard datamaskin med periodiske grensebetingelser under kanonisk ensemble. Holde temperaturen ved 298 K ved hjelp av en Berendsen termostat.
- Forbered øyeblikksbilder hentet fra 2,1 ved å slette alle vannmolekyler og eventuelle ligander / underlag ved hjelp av4; Rediger | Slett | Residue "-kommandoen superposé hvert stillbilde individuelt på den opprinnelige PDB-strukturen av." Superposé | Object "-kommandoen for å sikre at alle strukturer har samme romlige posisjon Lagre hvert snapshot forberedt på denne måten som en ny PDB. -fil (ved hjelp av "File | Save as | PDB" kommandoen).
Merk: For erfarne modellbyggere: Skriv et skript for å automatisere denne prosessen i henhold til malen gitt i tilleggskode File 1. - Bruk de forberedte snapshots (PDB) fra 2.2 som har blitt justert i 3D-plass som innganger til programvaren Caver 3,0 19. For analyse av et begrenset antall bilder, kjøre Caver på en standard datamaskin. Bruke en probe radius på 0,7 Å 19 for å sikre påvisning av tunneler som er spesifikke for transport av vannmolekyler.
- Visual tunnelene generert av Caver 3.0 i en molekylær grafikk programvare. For enkel visualisering av tunneler, bruke makroen vist i tilleggskode File to.
3. I Silico Enzyme Engineering å Endre Vann Mønstre og Vann Dynamics
- Identifisere de høyest rangerte tunneler i henhold til header "ID" oppført i output file "summary.txt" generert fra Caver 3.0-programvaren.
- Identifisere aminosyrer lining høyest rangert tunneler (3.1) og at skjermen en liten sidekjede peker mot kanalen interiør ved visuell inspeksjon (ved hjelp av modell hentet fra 2.4). Identifisere enkelt aminosyresubstitusjoner som vil blokkere tunnelen ved økt sterisk hindring bruke "Swap Rester" kommandoen. Kontroller at tunnelen er hindret ved visuell inspeksjon, og deretter ved å gjenta trinn 01.02 til 03.01 i protokollen.
4. Uttrykk av muterte gener
- Innføre mutasjoner i villtype-genet ved hjelp av PCR-mutagenese ikke-overlappende 20 primere.
- Legg plasmid-DNA inneholdende genet av interesse for rørs med kompetente celler av en passende klonings belastning og inkuber på is i 30 min. Utføre en varmesjokk transformasjon i 45 sekunder i et vannbad med temperatur innstilt på 42 ° C. Legg 500 pl av en fersk rikt medium (2YT, 16 g / l trypton, 10 g / l gjærekstrakt, 5 g / l NaCl) og inkuber ved 37 ° C, 200 rpm i 45 min. Foreta et valg av plating de transformerte celler på agar plater supplert med passende antibiotika.
- Etter verifisering av DNA-sekvensen til det muterte genet, omdanne plasmid-DNA i en ekspresjonsvektor belastning ved hjelp av varmesjokk som beskrevet ovenfor. For uttrykket av membranbundne triterpene cyclases, bruker BL21 (DE3).
- Start en 5 ml O / N kultur ved 37 ° C i uttrykket belastningen i 2YT-medium supplert med de egnede antibiotika.
- Inokulere en 2 liters forvirret rystekolbe, som inneholder 300 ml 2YT-medium supplert med egnede antibiotika, til en slutt-OD på 0,05 til 0,09 (målt ved 600 nm). Etter induksjon ved en OD på 0,6 til 0.8 og protein uttrykk, fryse cellepellet og oppbevar ved -80 ° C.
- For membranbundne triterpene cyclases i en pD861 vektor, fremkall med 0,5 til 2 mM rhamnose og 4 timer for ekspresjon ved 37 ° C for å oppnå høye utbytter av protein 21.
5. Membrane Extraction med en vanlig Sentrifuger og Protein Purification
- Fremstille de følgende buffere: Resuspensjon buffer (100 mM kaliumfosfat, pH 7,5 supplert med protease inhibitor tabletter), vaskemiddel-buffer (1% (v / v) Triton X-100, 50 mM kaliumfosfat, pH 7,5) og reaksjonsbuffer (0,2 % Triton X-100, 50 mM kaliumfosfat, pH 7,5).
- For squalene-hopene cyclases eller andre membranbundne enzymer med en lavere pH optimal, erstatte kalium fosfat i resuspensjon buffer med citrate. For slike enzymer bruke følgende buffere: Detergent-buffer (1% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0) og reaksjonsbuffer (0,2% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0).
Merk: Hvis en His-tag brukes til rensing, supplere resuspensjon buffer med 20 mM imidazol (endelig konsentrasjon).
- For squalene-hopene cyclases eller andre membranbundne enzymer med en lavere pH optimal, erstatte kalium fosfat i resuspensjon buffer med citrate. For slike enzymer bruke følgende buffere: Detergent-buffer (1% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0) og reaksjonsbuffer (0,2% Triton X-100, 60 mM citrat, pH 6,0).
- Veie et frosset cellepellet i et glassbeger. Suspender cellene i resuspensjon buffer ved hjelp av en homogenisator til en sluttkonsentrasjon på 0,3 g celler / ml. Lyse de resuspenderte cellene ved ultralydbehandling med en amplitude på 80% og en puls med en sec på og 1 sek off. Bruk tre gjentatte sykluser med 50 sek hver.
- Tilsett vaskemiddel buffer til en sluttkonsentrasjon på 0,2% (v / v) vaskemiddel. Ekvilibrer ved ende-over-end blanding ved 4 ° C i 1 time. Gjenvinne membranproteinfraksjonen ved å lagre supernatanten etter et enkelt sentrifugeringstrinn ved 39 000 xg i 50 min ved 4 ° C.
Merk: Hvis His-tag rensing brukes, tilsett ca 1,5 ml Ni-NTA agarose / g celler og inkuberes i 1 time. - Utfør en første rensingtrinn ved enten ionebytte eller His-tag rensing 21. Supplere balansen og elueringsbuffere med 0,2% Triton X-100. Konsentrer renset protein fem ganger med sentrifugalfilter Enheter med en cut-off på 10 kDa.
Merk: Størrelsen på Triton X-100 miceller resulterer i en konsentrasjon av vaskemiddel til en endelig konsentrasjon på omtrent 1%. - Sluttføre en rensing ved gelfiltrering poleringstrinnet ved hjelp av den konsentrerte protein og en matrise er kompatibel med et fraksjoneringsområde for globulære proteiner med 2 x 10 4 x 10 -8 6. Bruk reaksjonsbuffer som løpende buffer. Måle mengden av rensede protein ved hjelp av Bradford Ultra kit ifølge produsentens protokoll.
6. Kinetics
- Foreta en ny 5 mM stamløsning av substratet i reaksjonsbuffer. Oppnå en homogen emulsjon av ultralyd på 30% amplitude for 2-5 min.
- Stabilisere en Thermomixerved den ønskede reaksjonstemperatur. Kontroller temperaturen inne i en glassflaske som inneholder vann av et eksternt termometer.
- For enkelt-substrat-kinetikk, fortynne emulgert substratet til minst fem små glassflasker til den samme endelige substratkonsentrasjonen.
- For one-pot relative kinetikk med flere underlag, forberede minst fem identiske glassflasker ved å blande alle underlag i hvert hetteglass. For hydrofobe triterpener, bruker endelige substratkonsentrasjoner i området fra 10 til 200 pM.
- Forinkubere glassampullene i termomikser i 10 min. Start reaksjonen ved tilsetning av enzymet. En totalt reaksjonsvolum på 1 ml er egnet. Bruk en risting hastighet på minst 1200 rpm.
- Stopp reaksjoner på ulike tidspunkt ved å legge 500 mL etylacetat tilsatt 100 mikrometer decanol som en integrasjon standard.
7. Utvinning og Termodynamisk analyse
- Ekstraher reaksjonsblandingen ettervirvling og manuell risting glassampullene kraftig i 1 min. Sentrifuger glassampullene ved 9600 xg i en bordsentrifuge i 10 minutter ved RT. Overfør det øverste laget (organisk fase) til en tom tube. Legge til ytterligere 500 ul av ekstraksjonsmiddel til reaksjonsrørene og gjenta ekstraksjonsfremgangsmåten.
- Tørk de utpakkede reaksjons blandinger med Na 2 SO 4. Vortex i 5 sek og la rørene hvile i 10 min. Utfør et siste sentrifugeringstrinn ved 9600 xg i 1 min ved RT ved hjelp av en bordsentrifuge. Overfør de ekstraherte prøvene som gasskromatografi (GC) hetteglass.
- Gjenta trinnene under 6.1 til 7.2 for hvert enzym variant av interesse, ved hjelp av i det minste fire forskjellige opprinnelige konsentrasjon av substratet (for enkelt substrat kinetikk), og fire forskjellige temperaturer (for både enkelt substrat og konkurransekinetikk).
- Utfør GC-analyse som tidligere beskrevet tre. Bruke en ikke-polar kolonnen for analyse av hydrophobic pentacyclic produkter. Sette start ovnstemperaturen til 120 ° C og bruke en temperaturgradient på 5 ° C / min, avhengig av produktene og kolonnen.
- Integrere topparealene for produktet (e) og transformere produkt topparealene til de tilsvarende produktkonsentrasjonene ved å utnytte det området av integrasjons standard (tilsvarende 100 uM). Plotte konsentrasjonen av hvert produkt ([P]) som funksjon av reaksjonstiden (t). Gjennomfør lineær regresjon av de datapunkter som svarer til mindre enn 10% omdannelse. Den initiale reaksjonshastighet (V 0) er gitt ved hellingen av den tilpassede linjen i henhold til:
Merk: For en-potte relative kinetikk med flere substrater, V 0 er den første frekvensen av et bestemt substrat under påvirkning av andre substrater. - For enkelt substrat kinetikk, tomt V 0 k cat / K M verdi er gitt ved hellingen av den lineære delen av grafen i henhold til:
[S] er konsentrasjonen av substratet og [E] er konsentrasjonen av enzym anvendt i transformasjonen. K cat / K M tilsvarer den katalytiske konstant over Michaelis konstant. Gjenta analysen for hver temperatur og hver enzym variant. - For enkelt substrat kinetikk, utføre en termodynamisk analyse i henhold til overgangstilstand teori 22
b k er Boltzmanns konstant, h Plancks konstant, T er temperaturen i Kelvin, og R er gasskonstanten. Utfør en lineær regresjonsanalyse av tomten av ln ((k
Merk: På samme måte kan en analyse i henhold til metting av substratkonsentrasjon utføres ved hjelp av k katt som hastighet konstant i ligning 3. - For one-pot relative kinetikk med flere underlag, få den relative åpen
k cat / K M verdier fra 23:
(K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4)
hvor V 0, A refererer til den opprinnelige hastighet for substrat A i konkurranse med substrat B. - For one-pot relative kinetics med flere substrater, oppnå de relative termodynamiske parametre for aktivering av B i forhold til A som referanse, ved ikke-lineær regresjon:
- Beregne absolutte aktiverings parametere for underlaget B fra aktiverings entalpi og entropi referanseforbindelse A:
Representative Results
Betydningen av vann dynamikk i enzymatisk polycyclization katalyse er implisert av i silico analyse og påfølgende visualisering av oppdagede tunneler (ved hjelp av script i Tilleggskode fil 2). Etter § 3 i protokollen, er p 168 funnet å være en "hot spot" aminosyreresidie fôr en av tunnelene i triterpene cyclase enzym fra Alicyclobacillus acidocaldarius (figur 1, middel venstre). Ved å introdusere mutasjon S168F in silico, er tunnelen hindret som vist ved visuell inspeksjon (figur 1, nederst til venstre).
Reaksjonshastigheten for dannelse av polycykliske produkter som vises av triterpene cyclase enzymet er meget følsom for temperatur (figur 2A). Følge protokollen (avsnitt 4-7), er det funnet at den tilsynelatende k cat / K
Fra den eksperimentelt bestemte kinetiske parametre, er lineære termodynamiske tomter generert av ligning 3 og ved å følge § 6-7 i protokollen for enkelt substrat kinetikk (figur 2B). Den svært store endringer i aktivering entropi og entalpi observert for varianter husing blokkerte tunneler innebærer en nøkkelrolle for vann dynamikk i å fremme polycyclization kaskade (figur 2C, beregninger basert på figur 2B). Dess, Varianter med endrede vanntunneler vise en endret Gibbs fri energi for aktivering (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡, figur 2B-C). For eksempel, ved 303 K i S168F tunnel variant viser en Gibbs fri energi for aktivering av 14 kcal / mol i forhold til 16 kcal / mol for villtype-enzymet.
Ved å følge protokollen i avsnitt 7, ligning 4 gjør det mulig for beregning av tilsynelatende k cat / K M-verdier for flere substrater fra one-pot kinetiske eksperimenter (figur 3A). Videre kan en lineær termodynamisk tomten (figur 3B) konstrueres ved å kjøre konkurransen essay ved forskjellige temperaturer (ligning 5). Analogt med enkelt substrat kinetikk, den relative aktivering entalpi og entropi for ytterligere substrater sammenlignet med en referanseforbindelse er readily tilgjengelig fra skjærings og helningen av det lineære passer til de eksperimentelle data. Absolutte verdier av termodynamiske parametere for aktivering kan vurderes fra aritmetiske tillegg ved hjelp av termodynamiske data som er knyttet til referanseforbindelsen (ligning 6). Ved anvendelse av protokollen i dette dokumentet, ble generert Resultatene viser klart at membranenzymvarianter med blokkerte vanntunneler viser prinsipielt forskjellige termodynamiske parametre for aktivisering til substrater av forskjellige størrelser (figur 3C).
Figur 1. Protokoll oppsummering:. I silico datamodellering i konsert med eksperimentell protein design og termodynamisk analyse åpner for en utvidet forståelse av påvirkning av løsemiddel dynamikk på enzymkatalyse Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Termodynamiske parametre for aktivering av villtype og tunnel varianter fra enkelt substrat kinetikk. (A) Tilsynelatende k cat / K M-verdier erholdt fra eksperimentelle data og ved hjelp av ligningene 1 og 2. (B) termodynamisk analyse ved hjelp av overgangstilstand teori og lineær tilpasning av de eksperimentelle data til ligning 3. (C) termodynamiske parametre for aktivering beregnet fra plottene i (B). Den ut doble squalene underlaget er vist med obligasjoner dannet / ødelagt som stiplede linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Termodynamiske parametre for aktivering av villtype og tunnel varianter for forskjellige substrater. (A) Relativ k cat / K M-verdier erholdt fra one-pot kinetikken ved hjelp av ligning 4. (B) Termodynamiske plott av de kinetiske data ved forskjellig temperaturer ved bruk av ligning 5. (C) Absolutte termodynamiske parametre for aktivering beregnet ved ligning 6, og ved hjelp av substratet squalen i figur 2 som referanse. Obligasjoner dannet / brutt i substrater er vist som stiplede linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
De mest kritiske trinn i å oppnå høy kvalitet på eksperimentelle termodynamiske data for villtype-enzym, og membranen tunnel varianter er: 1) generering av datamodellen; 2) homogent rensede proteiner; 3) emulgert substrat aksjer; 4) kontroll av temperaturen under kinetikk; 5) ekstraksjon av reaksjonsblandinger ved hjelp av intern standard.
Generering av datamodellen er sterkt lettere ved bruk av en programvare med et brukervennlig grensesnitt som støtter en rekke plattformer. Derfor er denne protokollen forut på YASARA modellering suite 16 for å gjøre vår strategi tilgjengelig selv å modellere ikke-eksperter. En datamaskinmodell for vanntunnel identifikasjon bør ideelt sett være basert på en krystallstruktur av enzymet av interesse 24. For dette formål er den mengde krystallstrukturer er tilgjengelig i proteindatabanken meget gunstig. Vår erfaring er et viktig aspekt i vellykket utarbeidelse av templater for tunnel identifikasjon er å holde krystallografiske farvann. Det er like viktig å bruke en solvatisert enzym boksen når du utfører molekylær dynamikk simuleringer, som kan kjøres på en vanlig datamaskin. Triterpene cyclase fra Alicyclobacillus acidocaldarius er stabilt i vannet under MD simuleringer 3. Men å holde krystallografiske detergenter og / eller ved hjelp av cellemembranligner vil kanskje være nødvendig for potensielt ustabile enzymer for å tillate utvidet MD simuleringer. Man kan tenke seg at den minimalisert krystallstrukturen av svært utfordrende mål kan gi viktig innsikt mekanistisk ved anvendelse av protokollen, selv om dette ikke ville fange dynamiske sider av tunnelen organisasjon.
Caver 19 i standardmodus, med en enkelt eller et begrenset antall bilder som input, kan brukes av ikke-eksperter på en standard bærbar PC. Basert på vår erfaring 3, tunneler med en flaskehals radius (dvs. radiuspå det smaleste punkt) som er mindre enn 1 Å kan være svært relevant for vann, spesielt hvis krystallografiske vannmolekyler ligge innenfor den forutsagte tunnel (figur 1, midtre venstre). På den annen side kan en større radius flaskehals innebære en tunnel for transport av substratet i og ut av det aktive sete 10. Skriptet i Tilleggskode fil 2 kan brukes av ikke-eksperter for visualisering av predikerte tunneler. Senere eksperimenter vil vise om homologi modeller vil være av tilstrekkelig høy oppløsning for å tillate atomistisk studiet av vann nettverk og dynamikk. Belyse hvordan utføre molekylære dynamikk simuleringer, med og uten en ligand er til stede i det aktive setet, påvirker prosessen med tunnelen identifikasjon vil også være av betydning.
Kinetics av membran proteiner kan utgjøre en formidabel utfordring 25. Protokollen her er basert på en enkel membran utvinning protokollenfor å få membranen enzymet uten bruk av kostbart utstyr, slik som en ultrasentrifuge. Bruken av gelfiltrering som en avsluttende polering trinnet fjerner eventuelle rester av membran-partikler og gir mulighet for å definere et passende vaskemiddel 25 miljø.
Et viktig aspekt i å oppnå reproduserbare kinetiske resultater fra protokollen er å emulgere underlaget stamløsning av ultralyd. Enkel virvling av hydrofobe substrater fortynnes i en reaksjonsbuffer gir inhomogene blandinger av substrat-detergent. Den pipettering av ikke-emulgert substrat løsninger fører til uforklarlige konsentrasjoner (bekreftet ved kvantitativ GC), noe som hindrer nøyaktig bestemmelse av innledende priser. I motsetning til dette, bør det pipettering av riktig emulgerte stamløsninger medføre lineær regresjonsanalyse av innledende priser med R2 i området fra 0,98 til 0,99. Et annet viktig aspekt av hydrofobe substrater er den tilsynelatende substratet oppløselighetog tilgjengelighet i blandingene substrat-vaskemiddel. Faktisk var det ikke mulig å mette triterpene cyclase med referanse substratet squalen. Av denne grunn tilsynelatende k cat / K M Verdiene er angitt heri som kan inneholde bidrag fra både bindende og kjemi. Imidlertid har det vist seg at kjemien er hastighetsbegrensende for k cat / K M for polycyclization kaskade utført av triterpene cyclases 3.
Det er av stor viktighet for å bekrefte den virkelige temperatur i et reaksjonshetteglass med en ekstern termometer. Likevel kan lineære fits være dårligere for varianter med essensiell konstant tydelig k cat / K M verdier ved forskjellige temperaturer. Dette understrekes av den S168F varianten heri (figur 2A) med en aktiverings entalpien nær null (figur 2B og 2C). Veldig small temperaturavhengige endringer i tilsynelatende k cat / K M, kan indusere usikkerhet i den observerte aktivering entropi Δ S ‡ (dvs. skjærings i de lineære plott i figur 2B). I prinsippet kan den observerte aktiverings entropi også påvirkes av en annen mengde av aktive enzymer til forskjellige varianter, som ikke ville bli detektert ved måling av proteinkonsentrasjonen. Det er forventet at forsøksfeil reduseres ved blanding av flere substrater i en pott. Dette skyldes at alle de forskjellige substrater samvirke med den samme mengde enzym under disse forhold (ligning 4). Anvendelsen av et ekstraksjonsløsningsmiddel tilsatt en intern standard er viktig å ta hensyn til forskjeller i løpet av ekstraksjon og / eller GC-injeksjon.
Transition state teorien har blitt brukt i Enzymology 26. Denne viktige teoretiske rammeverket ble opprinnelig DEklet for unimolecular reaksjoner i gassfasen. Imidlertid har det vist seg at enzymer i hovedsak virker ved å senke den klassiske aktiveringsenergibarrieren 26. Transmisjonskoeffisienten antas å være en heri vil kunne påvirke de målte aktiverings entalpi og / eller entropi. Bidraget av tunnel, og andre ikke-klassiske effekter som recrossing av overgangstilstanden, kan bidra med omtrent 1000 ganger for å katalyse 26 svarende til omtrent 4 kcal / mol i energi. Det kan sees at aktiveringen entropi som vises av villtype-enzymet (16 kcal / mol ved 328 K, figur 2C) er mye større enn slike ikke-klassiske effekter forårsaket av en ikke-ensartet transmisjons koeffisient. Virkningen av transmisjonskoeffisienten bør avta når man sammenligner termodynamiske parametre for aktivering av villtype og tunnel-varianter ved hjelp av protokollen.
Gibbs fri energi for aktivering (Δ G ‡) er composed av både en entalpisk (Δ H ‡) og en entropic (- T * Δ S ‡) sikt. Solvent omorganisering i enzymer under katalyse kan påvirke begge parametrene. Det forventes protokoll til rette studiet av disse fenomenene ved å samle en verktøykasse av relevante og brukervennlige i silico dataverktøy med nødvendig biofysiske eksperimentelle rammeverk. Fremgangsmåten er tenkt å være nyttig for å studere en mengde enzymatiske prosesser, inkludert katalyse av membranbundne enzymer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| YASARA | YASARA Biosciences | http://www.yasara.org/ | Molecular modeling and simulation program |
| CAVER | CaverSoft | http://caver.cz/ | Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use |
| Bradford Ultra | Expedeon | BFU1L, BFU05L | Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent |
| Potter-Elvehjem homogenizer | VWR | 432-0205, 432-0217 | Homogenization of frozen cell pellet |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC901008 | Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer for sample incubation |
References
- Ball, P. Water as an active constituent in cell biology. Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).
- Snyder, P. W., et al. Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).
- Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).
- Persson, F., Halle, B. Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR. J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).
- Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).
- Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization. J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).
- Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38α MAP kinase inhibitors. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).
- Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).
- Matsuoka, S., et al. Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein. Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).
- Pavlova, M., et al. Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate. Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).
- Breiten, B., et al. Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding. J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).
- Oldfield, E., Lin, F. Y.
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
- Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. Protein activity regulation by conformational entropy. Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).
- Warshel, A. Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).
- Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space. Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).
- Duan, Y., et al. A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations. J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).
- Essmann, U., et al. A smooth particle mesh Ewald method. J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).
- Chovancova, E., et al. CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures. PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).
- Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).
- Kürten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli. Protein Express. Purif. , (2015).
- Eyring, H., Stearn, A. E. The application of the theory of absolute reaction rates to proteins. Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).
- Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein. , W.H. Freeman. (1999).
- Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. Structure and function of a squalene cyclase. Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations. Science. 303 (5655), 186-195 (2004).
