Protocol
1. Utarbeidelse av Agar Injection Plates (Tid: 45 min)
- Kok 2% til 3% agarose i E3 media og la oppløsningen avkjøles litt på benken. Merk: antall injeksjons plater blir utarbeidet tilsier mengden agarose nødvendig. Hver injeksjon plate trenger ca 35 ml av agarose løsningen.
- Etter koking, la agarose avkjøles til ønsket temperatur er nådd (f.eks., 45 ° C) som per injeksjon mold produsentens instruksjoner.
- Hell ca 35 ml av den avkjølte agarose i en 100 mm fatet.
- Plasser den ene enden av foretrukne injeksjon mold inn i løsningen, deretter legge resten av mugg på agarose løsning (dette vil bidra til å redusere forekomsten av luftbobler).
- Tillat oppløsningen å størkne agarose, enten ved romtemperatur eller 4 ° C i ca. 30 min.
- Bruke en spatel for å skille den ene ende av formen fra den faste agarose. Sakte fjerne resten av m gammel.
2. Utarbeidelse av Evans blå Dye (EBD) Injection Mix (Tid: 30 min)
- Lag en 1% lager av EBD i 1X Ringer løsning (155 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 2 mM Na 2 HPO 4; 10 mm HEPES, 10 mM glukose, pH til 7,2), som kan lagres ved romtemperatur.
- Lag en stamløsning av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran MW 10 000 kDa ved 25 mg / ml i 1X Ringers løsning og oppbevares ved -20 ° C.
- Forbered injeksjon blanding ved å fortynne EBD til 0,1% direkte i stamløsning av FITC- dekstran lager (dvs. for en endelig arbeidsvolum på 100 pl. Bland 10 mL av 1% EBD i 90 mL av FITC dekstran lager).
- Grundig vortex injeksjon mix (det skal bli grønn) og holde ut av direkte lys ved å pakke injeksjon blandingsrøret i aluminiumsfolie.
3. EBD Injection Forberedelse (Tid: Ca 30 min)
ent "> Merk: Protokoll fungerer best med larver fra 3-7 dager etter befruktning (DPF).- Pre-varm injeksjon plate til RT.
- Sett opp injeksjonsapparatet ved å arrangere mikromanipulator på metallplaten og står ved siden av mikroskopet som brukes for injeksjon. Slå på luftdrevet mikroinjeksjon kontrolleren. Merk: Den foretrukne innsprøytingssystemet vil variere fra lab og bør ikke endre utfallet av analysen.
- Tilbake fylle kanyle med ca 2-4 ul EBD mix.
- Kalibrere injeksjonsvolum på ca 5 nl av EBD mix. Merk: Injeksjonsvolum kalibrering vil være avhengig av kalibreringsmetode. Et stempel drevet injeksjon kan direkte settes til en gitt injeksjonsvolum, mens gasstrykket injektorer må injeksjonsvolum kalibrerte via volum bolus med bruk av et mikrometer.
- Våt injeksjon plate med 1X Ringers løsning og fjerne overflødig fra brønner.
- Pre-treat larver med 0,04% etyl-3-aminobenzoat methanesulfonate salt (Tricaine) fortynnet i 1 x Ringers løsning for å immobilisere larver før start av injeksjonen. Merk: Sikre larvene er helt immotile er viktig som riktig injeksjons er vanskelig med noen rest bevegelse.
- Plasser bedøvet larver i brønner på agar-plater ved hjelp av et injeksjonsglass pipette. Sørg for at larvene er helt innenfor det godt og ligge på deres side. Merk: Antallet larver per brønn er opp til eksperimentator.
- Etter larvene er satt i brønnene, fjerne overflødig Ringers løsning for å minimere larver bevegelse i brønnen. Legg igjen en restmengde løsning slik at larvene ikke dehydrerer.
4. Perikard Injeksjon av Sebrafisk Larver med EBD (Time: Avhengig av antall larver sprøyte, anslått 1-3 timer)
- Plasser injeksjon plate inneholdende larvene på en dissekere omfang hvor injeksjonene vil bli utført.
- Plasser injeksjon pipette nål inneholderEBD blande over en sebrafisk larver.
- Re-posisjon injeksjons plate ved å vri det slik at kanylen er i nærheten av larver hjerte og ca 45 ° ventralt fra anterior-posterior aksen.
- Sett injeksjonsnålen inn i den felles kardinalvene (CCV) i området av venen ved fremre del av eggeplomme, hvor venen innledningsvis å dreie i ryggretningen (figur 1). Merk: En forstørrelse på opptil 40x kan være nyttig å tydelig se CCV.
- Injisere 5 nl av EBD mix og holde kanylen på plass for 5-8 sek for å minimere umiddelbar lekkasje av EBD mix. Merk: En god injeksjon vil ha fargestoff farge sett i hjertekamrene (figur 1). Hvis EBV blanding ikke er observert i hjerte, deretter injisere ytterligere 5 nl av EBV blandingen kan være tilstrekkelig til å indusere fargestoffopptak. Alternativt, kan embryoet kastes.
Merk: I noen situasjoner kan hjertet stoppe juling. Hvis dette occurs, fortsette å overvåke larvene for 20-40 sek. Vanligvis fortsetter hjertet slår som fargestoff beveger seg gjennom sirkulasjonssystemet. - Gå til neste larver og gjenta.
- Identifisere hell injiserte embryoer ved å observere nærværet av FITC-dekstran i vaskulaturen umiddelbart etter injeksjonen (figur 2).
5. Inkubasjon og EBD Opptak (Tid: 4-6 timer)
- Etter det ønskede antall larver injiseres, retur injisert larver til 1X Ringers løsning uten Tricaine i 100 mm retter.
- Hold retter innpakket i aluminiumsfolie. Merk: Holde injisert larver i mørket øker betydelig overlevelse og sikrer størst konsekvens i signalstyrke. Innpakning i aluminiumsfolie er spesielt viktig for den tidsperioden som larvene er utenfor inkubatoren.
- Tillat larver inkubert ved 28,5 ° C i 4-6 timer for å sikre tilstrekkelig EBV-opptak. 6. Visualisering av EBD i Muscle (Time: Avhengig av antall larver injisering og type mikroskopi, estimert 0,5-3 time)
- Før bildebehandling, bedøve larvene med 0,04% Tricaine å hindre bevegelse.
- Vis larver i henhold til rød fluorescens for å bestemme om EBV opptaket skjer i skjelettmuskulaturen (fig 3).
Representative Results
Den EBV-injeksjon blandingen ble injisert i CCV av sapje homozygote mutanter og villtype-søsken på 3 dpf. Injeksjoner som fylte hjertekamrene (figur 1B) ble deretter analysert for vellykket injeksjon ved å visualisere FITC-dekstran i vaskulaturen i henhold til grønn fluorescens (figur 2).
Etter en 4 timers inkubasjonstid, ble EBD opptak undersøkt ved somitt nivå ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Villtype-søsken viste ingen fluorescens EBV innenfor noen synlige muskelfibre (figur 3A), mens de sapje homozygote EBV mutanter viste opptak, noe som indikerer skade på muskelmembranen 15 (figur 3B).
Figur 1. Injisering EBD injeksjon blandes inn i vanlig kardinal vene (CCV) av en sebrafisk Embryo. (A) ikke-injiserte embryo. Arrow betegner ideell beliggenhet for CCV injeksjon. (B) Vellykket injeksjon i CCV. Fargestoffet kommer inn i hjertekamrene (pil) og begynner å bli pumpet gjennom vaskulaturen. (C) En mislykket CCV injeksjon vil resultere i noen eller alle av fargestoff inn i plommesekken av embryo (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Embryoet kan sorteres etter vellykket injeksjon ved å observere FITC- dekstran distribusjon henhold grønn fluorescens hele blodkar umiddelbart etter injeksjon og før EBD opptak.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: EBV vil bli tatt opp av fibre med skadede membraner (A) viser villtype-søsken ingen EBV fluorescens i muskelfibrene.. (B) Sapje homozygot mutant med EBD fluorescens innen flere muskelfibre (piler). All larver ble injisert med EBD injeksjon mix og analysert etter en 4 timers inkubasjonstid på 3 dpf. Søsken og mutanter ble sortert etter muskelfiber avløsning før CCV injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Sebrafisk er fremstår som et kraftig verktøy for studier av nevromuskulær sykdom 2,29. Til dags dato har sebrafisk systemet blitt brukt til å validere ny muskelsykdomsfremkallende mutasjoner 16,17,30, belyse nye pathomechanisms 18, og identifisere potensielle nye terapeutiske legemidler 12,24. Disse kollektive innsatsen har etablert nytten av sebrafisk for å modellere menneskelige nevromuskulære sykdommer. Men til tross for fremskritt gjort med sebrafisk og pattedyr modeller, det er begrenset behandlingstilbud for pasienter innenfor det brede spekteret av nevromuskulære forhold. Derfor foreligger det et stort behov for terapi utvikling for denne gruppen av ødeleggende sykdommer. Paralleling denne etterspørselen for therapeutics er tilsvarende behov for løpende eksperimentelle innovasjon, samt grundige analyser for å verifisere nye dyremodeller og mulige terapeutiske strategier.
EBD analyse er vanligvis brukes i musemodeller tilStudien vev og celleskader i hjernen, hjerte og skjelettmuskel 27,31. Mest spesielt er EBD mye brukt i musemodeller av ulike muskeldystrofi subtyper å vise hvor alvorlig muskelmembranen ustabilitet og skade åtte. Bruken av EBD å avsløre muskel membranskade er en støttende parameter etablere likheter av dyremodell for det menneskelige sykdomstilstand 9. Kraften i EBD i mus har ledet flere laboratorier, inkludert vår egen, for å utvikle og anvende EBD til sebrafisk modeller av nevromuskulær sykdom. På grunn av anvendeligheten av EBD analyse, er denne teknikken aktivt blir iverksatt for å underbygge sebrafisk modeller for det menneskelige sykdomstilstand 11,15,22,24,32. Larver med skadde muskel membraner vil ha EBD opptak og derfor rød fluorescens i muskelfibrene. Fluorescens observert i inter-fiber plass, men ikke innenfor enkelte muskelfibre kan også være lærerikt av fibre løsne fra kjelleren membran i than fravær av membranskade, og gir nyttig diagnostisk detalj. EBD analyse har potensial søknad utover dyremodell validering. Innsats fra vårt laboratorium har nylig vist at EBD analyse er gunstig i validere potensielt nye terapeutiske legemidler 24. Avgjøre om potensielle terapeutiske behandlinger redusere eller avskaffe EBD opptak i nevromuskulær sykdom modellene kan betegne relevant terapeutisk virkning 8. Denne type analyse kan bidra til å etablere mekanisme (r) av terapeutiske midler og utvider anvendelsen av EBV-analyse.
Som med mange teknikker, betyr EBD analyse har flere begrensninger som skal følges under eksperimentell design og praksis. For eksempel kan det være utfordrende å identifisere CCV på grunn av fortykkelse av vevet med alderen. I tillegg er det lett å skade larver i forberedelse før og under pericardial injeksjonen, redusere eksperimentelle punkter og øker behovet for å prep stort antall larver.Videre kan fysisk skade gjort til larver under håndtering og injeksjon føre til falske positiver som skadet muskel kan ta opp EBD. For å overvinne noen av disse hindringer har vi beskrevet en ko-injeksjon strategi i denne video artikkelen som gir enkel og pålitelig identifikasjon av larver med vellykket fargestoff infusjon umiddelbart etter injeksjon og før etterfølgende analyse. FITC-dekstran ko-injeksjon kontroller for vellykket injeksjon ved å tillate bekreftelse av EBV i vaskulaturen før dens opptak av muskelfibrene. Dette kan være spesielt nyttig som EBD fluorescens blir svært diffus i larver etter flere timer hvis ikke samlet inn i muskelfibrene; som sådan kan det være vanskelig å oppdage. I tillegg mangler CCV og injisere EBV inn i eggeplomme eller kroppshulrommet kan, etter inkubering resulterer i diffust rødt fluorescens lignende for å styre embryoer, men med den reduserte sannsynlighet for opptak av skadede muskelfibre. Kollektivt, disse huleats foreslå EBD injeksjon krever tålmodighet og praksis for å oppnå konsistente og pålitelige resultater.
I alle, beskriver vi en praktisk og grei metode for å utføre EBD analyser på sebrafisk larver. Hittil har bruken av sebrafisk som et modellsystem, særlig som et menneske sykdomsmodell, er blitt raskt voksende. Denne utvidelsen er delvis på grunn av fortsatt utvikling og endring av eksperimentelle teknikker som forbedrer på dagens fordelene av sebrafisk system. EBD injeksjonsteknikk gir en ekstra og kraftig verktøy til en forsker arsenal for validering og studiet av sebrafisk muskelsykdomsmodeller. Den pågående implementering og modifikasjon av denne teknikk har mulighet for å bidra til å avdekke nye terapeutiske strategier samt sykdomsfremkall mekanismer.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Trent Waugh for hans teknisk assistanse. Vi erkjenner også Department of Pediatrics ved Hospital for Sick Children og Cure Medfødt muskeldystrofi (CMD) for deres generøse støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
References
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P.
- Yoshida, M., Ozawa, E.
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
