Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

Published: November 30, 2015 doi: 10.3791/53183
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 1,2, 1,2,4
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Protocol

Agar Enjeksiyon Tabaklar hazırlanması 1. (Saat: 45 dk)

  1. E3 ortam içinde% 2 ila% 3 agaroz kaynatılır ve çözelti tezgah üzerinde hafifçe soğumaya bırakın. Not: hazırlanmakta olan enjeksiyon plakaların sayısı Gerekli agaroz miktarını belirler. Her bir enjeksiyon plakası agaroz solüsyonun yaklaşık 35 ml gerekmektedir.
  2. Kaynatıldıktan sonra istenen sıcaklık enjeksiyon kalıp, üreticinin talimatlarına uygun olarak (örn., 45 ° C) elde edilene kadar agaroz soğumaya bırakın.
  3. 100 mm'lik bir çanak içine agaroz soğutuldu yaklaşık 35 ml dökün.
  4. Çözeltisi içine Tercih enjeksiyon kalıp bir ucunu yerleştirin, ardından (bu hava kabarcıklarının oluşumunu azaltmaya yardımcı olacaktır) agaroz çözeltisi üzerine kalıp geri kalanı yatıyordu.
  5. Agaroz çözelti, yaklaşık 30 dakika boyunca, ya oda sıcaklığında ya da 4 ° C katılaşmaya izin verin.
  6. Katı agaroz kalıbın bir ucunu ayırmak için bir spatula kullanın. Yavaşça m kalanını kaldırmak eski.

Evans Blue Dye (EBD) Enjeksiyon Mix 2. Hazırlama (Zaman: 30 dk)

  1. 1X Ringer çözeltisi EBV bir% 1 stok olun (5 mM KCI, 155 mM NaCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 2 mM Na 2 HPO 4, 10 mM HEPES, 10 mM glikoz, pH 7.2), bu, oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. 25 mg MW 10.000 kDa -dextran floresein izotiosiyanat bir stok çözeltisi (FITC) Marka / mL C ° -20 ° C'de 1X Ringer çözeltisi ve mağaza
  3. (. Örneğin, 100 ul'lik bir son çalışma hacmi için: FITC dekstran stokunun 90 ul% 1 EMB'nin 10 ul karıştırın) FITC-dekstran stokunun stok çözeltisi doğrudan% 0.1 EBD seyreltilerek püskürtme karışımı hazırlayın.
  4. İyice vorteks enjeksiyon karışımı (yeşil açmalısınız) ve alüminyum folyo ile enjeksiyon karışımı tüp sararak doğrudan ışık tutmak.

3. EBD Enjeksiyon Hazırlama (Saat: Yaklaşık 30 dk)

ent "> Not: Protokol 3-7 gün sonrası fertilizasyon (dpf) dan larvaları ile iyi çalışır.

  1. RT Ön sıcak enjeksiyon plakası.
  2. Metal levha üzerine mikromanipülatör düzenleyerek enjeksiyon cihazı kurmak ve mikroskop sonraki enjeksiyon için kullanılan duruyor. Hava tahrikli mikroenjeksiyon kontrolörü açın. Not: Tercih edilen enjeksiyon sistemi laboratuvarı tarafından değişecektir ve analiz sonucunu değiştirmek gerekir.
  3. Geri EBD karışımı yaklaşık 2-4 ul enjeksiyon iğnesi doldurun.
  4. EBD karışımı yaklaşık 5 nl enjeksiyon hacmi kalibre. Not: Enjeksiyon hacmi kalibrasyonu kalibrasyon yöntemine bağlı olacaktır. Gaz basıncı enjektörler bir mikrometre kullanılarak hacimli yükleme dozu ile kalibre enjeksiyon hacmi gerekir, ancak bir pistonu tahrik enjeksiyonu ile doğrudan belirli bir enjeksiyon hacmi için ayarlanabilir.
  5. 1X Ringer solüsyonu ile ıslak enjeksiyon plakası ve kuyulardan aşırı kaldırın.
  6. % 0.04 etil 3-aminobenzoat metansülfonat sal ile önceden muamele larvalarıenjeksiyon başlamadan önce larva hareketsiz 1X Ringer çözeltisi içinde seyreltilmiş t (tricaine). Not: Uygun enjeksiyon herhangi bir kalıntı hareketi ile zor olduğu gibi larva sağlanması tamamen hareketsiz olan önemlidir.
  7. Cam bir pipet kullanılarak agar enjeksiyon plakalarının oyuklarına anestezi larva yerleştirin. Larvalar tamamen kuyunun içinde ve onların yan yatarken olduğundan emin olun. Not: kuyu başına larva sayısı deneyci kadardır.
  8. Larvalar kuyularda konur sonra, iyi olan larva hareketini en aza indirmek için aşırı Ringer çözüm kaldırmak. Bu larvalar dihidrat kalmamak çözelti bir artık miktarda bırakın.

EBD ile Zebra balığı Larva 4. perikardiyal Enjeksiyon (Time: larvaları enjekte sayısına bağlı olarak, tahmin edilen 1-3 saat)

  1. Enjeksiyonlar yapılacak bir diseksiyon kapsamı larvaları içeren enjeksiyon plaka koyun.
  2. Içeren enjeksiyon pipet iğne yerleştirinEBD bir Zebra balığı larvaları üzerinde karıştırın.
  3. Yeniden pozisyonunda çevirerek enjeksiyon plakası yüzden enjeksiyon iğne larvaları kalbine yakın ve yaklaşık 45 ° ventral ön-arka eksen.
  4. Damar başlangıçta dorsal yönde dönüyor sarısı (Şekil 1) ön kısmında ven bölgesinde ortak kardinal ven (CCV) içine enjeksiyon iğne takın. Not: en 40x arasında bir büyütme açık CCV görmek yararlı olabilir.
  5. EBD karışımı 5 nl enjekte edilir ve EBD karışımı hemen sızıntısını en aza indirmek için 5-8 saniye pozisyonda iğne tutun. Not: İyi bir enjeksiyon kalp boşluklarına görülen boya renginin (Şekil 1) sahip olacaktır. EBV karışımı kalp gözlenmiştir değilse, o zaman EBV karışımı ilave bir 5 nl boya çekmesi uyarılması için yeterli olabilir enjekte. Alternatif olarak, embriyo atılabilir.
    Not: Bazı durumlarda, kalp dayak vermeyebilir. Bu o takdirdeccurs, 20-40 saniye larva izlemeye devam eder. Boya dolaşım sistemi içinde hareket Tipik olarak, kalp yenerek devam eder.
  6. Bir sonraki larva ve tekrarı üzerine taşıyın.
  7. Enjeksiyondan hemen (Şekil 2) sonra vaskülatürde FITC-dekstran varlığını gözlemleyerek başarıyla enjekte embriyolar belirleyin.

5. Kuluçka ve EBD Alımı (Saat: 4-6 saat)

  1. Larva istenilen sayıda enjekte edildikten sonra, geri 100 mm'lik tabaklar içerisinde tricaine olmayan 1X Ringer çözeltisine larva enjekte edilmiştir.
  2. Alüminyum folyo sarılı yemekler tutun. Not: Karanlıkta enjekte larvaların tutulması önemli ölçüde sağkalım oranlarını artırır ve sinyal gücü en büyük tutarlılık sağlar. Alüminyum folyo Sarma larva inkübatör dışındaki zaman süresi için özellikle önemlidir.
  3. Yeterli EBD alımını sağlamak için larva 4-6 saat 28.5 ° C'de inkübe izin verin.
    4. Kas içinde EBD 6. Görselleştirme (Saat: larvaları enjekte ve mikroskopi Çeşidi sayısına bağlı olarak, tahmini 0,5-3 saat)

    1. Önce görüntüleme, hareket etmesini önlemek için% 0.04 tricaine ile larva uyutmak.
    2. EBD alımı iskelet kası (Şekil 3) oluşup oluşmadığını kırmızı floresan altında Görünüm larvaları belirlemek için.

Representative Results

EBV püskürtme karışımı 3 dpf sapje homozigoz mutantları ve vahşi tip kardeş CCV enjekte edilmiştir. Kalp odacıkları (Şekil 1B) doldurulmuş Enjeksiyonlar sonra FITC-dekstran yeşil floresan altında damarsal (Şekil 2) görselleştirmek başarılı enjeksiyon için analiz edildi.

4 saat enkübasyon süresinden sonra, EBV alım floresan mikroskopi kullanılarak hücre gruplarının düzeyde incelenmiştir. Sapje ​​homozigoz mutantlar, kas zar 15 (Şekil 3B) zarar gösteren, EBV alımı gösterdi, oysa, vahşi tipli kardeşlerine, görünür bir kas lifleri (Şekil 3A) içinde herhangi bir EBV floresans sergilenmektedir.

figür 1
Bir Zebra balığı Embry ortak kardinal ven (CCV) içine Şekil 1. Damariçi EBD enjeksiyon karışımıo. (A) uninjected embriyo. Ok CCV enjeksiyon için ideal bir konuma işaret eder. (B) CCV içine Başarılı enjeksiyon. Boya kalp boşlukları (ok) girer ve damar pompalanması başlar. (C) Bir başarısız CCV enjeksiyonu bazı veya embriyo (ok) sarısı kesesi giren boya tüm sonuçlanacaktır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Embriyolar enjeksiyondan hemen öncesinde EBD alımı için aşağıdaki damarsal boyunca yeşil floresan altında FITC-dekstran dağıtım gözlemleyerek başarılı enjeksiyon için düzenlenmiş olabilir.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: REF hasarlı membran ile elyaflar tarafından ele alınacaktır kas liflerinin herhangi bir EBV floresan gösteren (A) Vahşi tipli kardeşlerine.. (B) Birden fazla kas lifleri (oklar) içinde EBD floresan ile Sapje ​​homozigot mutant. Bütün larvalar REF püskürtme karışımı ile enjekte edilmiş ve 3 dpf bir 4 saatlik bir bekletme sürecinden sonra analiz edilmiştir. Kardeşleri ve mutantlar CCV enjeksiyondan önce kas lifi dekolmanı göre sınıflandırılmaktadır bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Zebra balığı nöromüsküler hastalık 2,29 çalışma için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bugüne kadar, zebra balığı sistemi, yeni kas hastalığa neden olan mutasyonlar 16,17,30 doğrulamak yeni patolojik mekanizmalar 18 aydınlatmak ve potansiyel yeni tedavi edici ilaçlar 12,24 tanımlamak için kullanılmıştır. Bu kolektif çabalar, insan nöromüsküler hastalıkları modellemek için Zebra balığı yararını kurduk. Ancak, zebra balığı ve memeli modelleri ile yapılan ilerlemelere rağmen, nöromüsküler koşulları geniş spektrumu içinde hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Bu nedenle, yüksek bir talep yıkıcı hastalıkların bu grup için tedavi geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Tedavi için bu talebi paralel yeni hayvan modelleri ve varsayılan tedavi stratejileri doğrulamak için sürekli deneysel yenilik yanı sıra titiz analiz için gelen bir ihtiyaçtır.

EBD analizi yaygın fare modellerinde kullanılanÇalışma dokusu ve beyin, kalp hücresel hasar ve iskelet kası 27,31. En önemlisi, EBD kas zarı istikrarsızlık şiddetini göstermek ve 8 zarar çeşitli kas distrofi alt tiplerinin fare modellerinde yaygın olarak kullanılır. Kas zarı hasarı ortaya çıkarmak için EBD kullanımı, insan hastalık durumuna 9 hayvan modelinin benzerlik kuran destekleyici bir parametredir. Fare EBD güç geliştirmek ve nöromüsküler hastalık zebrabalıkları modellere EBD uygulamak, kendi dahil olmak üzere birçok laboratuarları, yol açmıştır. Nedeniyle EBD analizinin uygulanabilirliği, bu tekniğin etkin insan hastalık durumuna 11,15,22,24,32 için Zebra balığı modellerini doğrulayacak uygulanmaktadır. Hasarlı kas zarlarla Larva kas lifleri içinde EBD alımı ve dolayısıyla kırmızı floresan sahip olacaktır. Tek kas lifleri içindeki ara-lif alan gözlenen floresans değil, aynı zamanda, t bazal membran ayırma liflerin bilgi verici olabiliryararlı tanı detay sağlayan membran hasar o yokluğu. EBD analizi hayvan modeli doğrulama ötesinde potansiyel uygulama vardır. Bizim laboratuarından çabalar son zamanlarda EBD analizi potansiyel yeni tedavi ilaçları 24 doğrulayarak yararlı olduğunu göstermiştir. Potansiyel tedavi tedaviler azaltmak veya ilgili terapötik eylem 8 delalet edebilir nöromusküler hastalık modellerinde EBD alımını kaldırılması durumunda belirleme. Bu tip analiz terapötik mekanizması (ler) kurmaya yardımcı ve EBD analizi uygulaması genişletir olabilir.

Birçok teknikleri ile olduğu gibi, EBD analizi deneysel tasarım ve uygulama sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç uyarılar var. Örneğin, nedeniyle yaş doku kalınlaşması ccv belirlemek zor olabilir. Buna ek olarak, bu deney sayısını azaltmak ve larvaların sayıda hazırlık için ihtiyaç artmaktadır önce ve perikardiyal enjeksiyon sırasında hazırlanmasında larvalarına kolaydır.Hasarlı kas EBD sürebilir Dahası, taşıma ve enjeksiyon sırasında larva yapılan fiziksel hasar yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu engellerin bazılarının üstesinden gelmek için, biz enjeksiyon ve önceki sonraki analiz için aşağıdaki derhal başarılı boya infüzyonu ile larva kolay ve güvenilir şekilde belirlenmesini sağlar, bu video makalede bir ko-enjeksiyon stratejisi nitelendirdiler. Önce kas lifleri tarafından alımına vaskülatürde EBD onayını vererek başarılı enjeksiyon için ko-enjeksiyon kontrolleri FITC-dekstran. EBV floresans kas lifleri toplanan takdirde birkaç saat sonra larva oldukça yaygın hale gelir, bu durum özellikle faydalı olabilir; gibi, bu tespit etmek zor olabilir. Buna ek olarak, CCV eksik ve yumurta sarısı veya vücut boşluğu içine enjekte EBD, inkübasyondan sonra, hasarlı kas lifleri tarafından alım olasılığının azaltılması ile, henüz kontrol embriyolarına benzer bir difüz-kırmızı flüoresans neden olabilir. Topluca, bu mağaraats EBD enjeksiyon, tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmek için sabır ve pratik gerektirir öneririz.

Toplamda, biz Zebra balığı larvaları üzerinde EBD analizi gerçekleştirmek için pratik ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bugüne kadar, bir model sistem olarak zebrabalıkları kullanımı, özellikle de bir insan hastalığı modeli olarak, hızlı bir şekilde genişlemektedir. Bu genişleme zebrabalıkları sisteminin mevcut avantajları üzerine geliştirmek deneysel tekniklerin sürekli gelişme ve değişiklik kısmen kaynaklanmaktadır. EBD enjeksiyon tekniği doğrulama ve Zebra balığı kas hastalığı modellerinin çalışma için bir araştırmacının cephanelik ek ve güçlü bir araç sağlar. Bu tekniğin devam eden uygulama ve modifikasyon yeni tedavi stratejilerinin yanı sıra hastalığa neden olan mekanizmaları açığa çıkarmalarına yardımcı potansiyeline sahiptir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını ya da diğer ilgi çatışmaları var.

Acknowledgments

Biz onun teknik yardım için Trent Waugh teşekkür etmek istiyorum. Biz de Hasta Çocuk ve bu proje için onların cömert finansmanı için Cure Konjenital Musküler Distrofi (CMD) için Hastanesi Pediatri Bölümü kabul etmiş sayılırsınız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 Sigma FD10S
Evan's Blue Dye Sigma E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040
100 mm Petri dish Fischerbrand FB0875712 Injection mold base
Thin wall glass capillaries World Precision Instruments TW100F-4 For Injection needle
Agarose Bioshop AGA001 Injection mold
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 Injection mold
Sodium chloride Bioshop SOD001 Ringer's solution
Potassium chloride Bioshop POC888 Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate Sigma M2670 Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Ringer's solution
HEPES Sigma H4034 Ringer's solution
Glucose BioBasic GB0219 Ringer's solution
Calcium chloride Sigma C1061 Ringer's solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
  2. Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
  3. Lancet, , 381-845 (2013).
  4. Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
  5. Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
  6. Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
  7. Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
  8. Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
  9. Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
  10. Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
  11. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
  12. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
  13. Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
  14. Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
  15. Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  16. Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
  17. Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
  18. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
  19. Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
  20. Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
  21. Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
  22. Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
  23. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
  24. Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
  25. Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
  26. Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
  27. Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
  28. Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
  29. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  30. Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
  31. Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
  32. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 105 konjenital müsküler distrofi Evans Blue Dye Zebra balığı sarcolemma bütünlüğü miyopati Duchenne kas distrofi dystroglycanopathies
Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, S. J., Horstick, E. J.,… More

Smith, S. J., Horstick, E. J., Davidson, A. E., Dowling, J. Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye. J. Vis. Exp. (105), e53183, doi:10.3791/53183 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter