Abstract
Недавно иПСК привлекли внимание в качестве нового источника клеток для регенеративной терапии. Хотя первоначальный способ генерации ИПСК полагались на дермальных фибробластов, полученных инвазивной биопсии и ретровирусного генома вставки трансгенов, было много усилий по избежать этих недостатков. Человека периферийных Т-клетки являются уникальным источником клеток для создания ИПСК. иПСК, полученные из Т-клеток содержит перестановки Т-клеточный рецептор (TCR) генов и являются источником антиген-специфических Т-клеток. Кроме того, рецептор клеточной перегруппировки Т в геноме имеет потенциал маркировать отдельные клеточные линии и различать трансплантированных клеток и доноров. Для безопасной клинического применения ИПСК, важно свести к минимуму риск раскрытия вновь созданные ИПСК вредных агентов. Хотя фетальной бычьей сыворотки и фидерные клетки были необходимы для плюрипотентных стволовых клеток культуры, предпочтительно, чтобы удалить их из культуральной системе, чтобы уменьшить рискнепредсказуемого патогенности. Для решения этой проблемы, мы создали протокол для создания ИПСК из человека периферических Т-клеток с использованием вируса Сендай, чтобы уменьшить риск разоблачения ИПСК неопределенных патогенов. Хотя обработки вирус Сендай требует оборудования с соответствующим уровнем биобезопасности, Сендай вирус заражает активированные Т-клетки, без введения генома, но с высокой эффективностью. В этом протоколе, мы продемонстрировать генерацию ИПСК из человеческих периферических Т-клеток в фидерных свободных условиях, используя комбинацию активированного культуры Т-клеток и вируса Sendai.
Introduction
иПСК привлекли значительное внимание как новаторский источник клеток для регенеративной медицины 1-3. На сегодняшний день различные способы получения ИПСК были зарегистрированы 4,5. Среди них, иПСК генерируется из Т-клеток человека были особый интерес из-за менее инвазивным методом отбора проб клеток 6-8. Кроме того, иПСК получены из Т-клеток содержит перестановки Т-клеточный рецептор (TCR) гена и, таким образом источником антиген-специфических Т-клеток 9,10. Поэтому, создавая Т-клеток происходит ИПСК безопасно полезно для регенеративной медицины прогрессирует.
Этот метод основан на концепции снижения риска непредсказуемого патогенности. Для безопасной клинического применения ИПСК важно снизить риск воздействия патогенов 11. Ранее во многих культурных систем плюрипотентных стволовых клеток, фетальной бычьей сыворотки и фидерные клетки были использованы в качестве существенного реагентаS 12. Тем не менее, удаление обоих этих реагентов из культуральной системе предпочтительно, чтобы поколение Ipsc снизить риск непредсказуемого патогенности.
Кроме того, этот метод имеет то преимущество, избежать инвазивных проб от больных клеток и кропотливой подготовки фидерных клеток. Поскольку T клеток, полученных иПСК уже успешно используется в исследованиях болезни 13,14, этот метод также применим и полезен для создания конкретных заболеваний ИПСК пациентов.
Среди методов перепрограммирования клеток Т, используя вирус Сендай (SeV) вектор как гена транспортного средства является метод, который может генерировать ИПСК с высокой эффективностью 7,16. Кроме того, поскольку SeV вирус одноцепочечной РНК и не требует фазы ДНК репликации, его использование в производстве Ipsc избежать разрыва геном хозяина 17-19. Таким образом, мы установили, протоколы для генерации ИПСК из человека периферических Т-клеток в сыворотке-FREE и фидерных без условия, используя комбинацию матригеле, mTeSR среды и Сев векторы.
Protocol
1. Подготовка активированными человеческими Т-клетками
- Соберите 10 мл гепаринизированной цельной крови от донора из вены.
- Получить информированное согласие доноров заранее вены. Венепункцией должно быть сделано квалифицированным персоналом.
- Ручка полученные образцы крови стерильной оборудования и следующих надлежащих принципов биобезопасности.
- Развести 10 мл гепаринизированной цельной крови с 10 мл D-PBS (-).
- Поместите 15 мл раствора Ficoll (Ficoll-Paque Premium) в новую 50-мл коническую пробирку.
- Слой 20-мл раствора крови, полученного на стадии 1.2 на Ficoll раствора на стадии 1.3. Используя электрический пипетку, пусть решение в крови, полученного на стадии 1.2 работать медленно вдоль внутренней стенки трубы. Будьте осторожны, чтобы не перемешать раствор в крови и решение Ficoll.
- Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Установите центробежный скорость торможения для "замедлить".
Примечание: После центрифугирования, белый тонкийслой возникает между верхней молочного слоя плазмы и нижней четкой фиколла слоя. Этот белый тонкий слой содержит одноядерные клетки. - Передача мононуклеарных клеток слой на новую 50-мл коническую пробирку с 1-мл пипетки. Будьте осторожны, чтобы не включать в себя решение Ficoll.
- Добавить D-PBS (-), чтобы мононуклеарных клеток до общего объема 10 мл и центрифуге при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите супернатант. Добавьте 10 мл D-PBS (-) в мононуклеарных клетках, и центрифугируют при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите супернатант, добавить 1 мл KBM502 среды собранных мононуклеарных клеток, и считать клеток с использованием гемоцитометра. Более 5 × 10 6 мононуклеарных клеток могут быть получены из 10 мл гепаринизированной цельной крови с использованием надлежащего разделения Ficoll.
- Подготовка раствора антител анти-CD3 человека в концентрации 10 мкг / мл в D-PBS (-). Добавить раствор анти-CD3 человека антитела к 6-луночного планшета, впитать прибойтуз каждую лунку, и инкубировать блюдо при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора в течение не менее 30 мин.
- Извлеките против человеческого антитела решение CD3 из каждой лунки и промыть один раз D-PBS (-) непосредственно перед посевом клеток.
- Семенной мононуклеарных клеток, которые были получены на этапе 1.9 при плотности 2,5 × 10 5 клеток / см 2 на анти-CD3 человека покрытых антителами 6-луночные планшеты в среде. KBM502 Инкубируют при 37 ° С в 5% -СО 2 инкубаторе в течение 3-7 дней без смены среды до тех пор, пока Т-клетки достигают слияния. Т-клетки в этот период являются подвесные и придерживаясь клетки.
2. Инфекция Т-клеток человека с Сев векторы
- После 3-7 дней культуры, собирать активированных Т-клеток с существующими среду с помощью пипетки. Передавать их на 15-мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавить 1 мл свежего KBM502 среду. Граф клеток и пластины 1.5 × 10 6 клеток (в 2 мл свежей среды) KBM502 в каждую лунку антитела покрытием 6-луночного планшета против CD3.
- Оттепель решения Сев на Oct3 / 4-SEV / TSΔF, Sox2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF и с-Мус (HNL) -SeV / TS15ΔF на льду.
- Добавить решения Сев содержащие Oct3 / 4-SEV / TSΔF, Sox2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF и с-Мус (HNL) -SeV / TS15ΔF индивидуально в лунки, каждая при множественности инфекции (МВД) 10. инкубировать при 37 ° С в 5% -СО 2 инкубаторе в течение еще 24 ч.
3. Удалить Сев векторов из Т-клеток человека
- 24 ч после заражения, собирать инфицированные клетки с пипетки. Если есть придерживаясь клетки, они легко могут быть отделены пипетки их повторно вверх и вниз. Передавать их на 15-мл коническую пробирку и центрифуги при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант, содержащий векторы SEV, и добавить 2 мл свежей среды KBM502. Replate клетки в EACч из скважины. Инкубируют при 37 ° С в 5% -СО 2 инкубаторе в течение еще 24 часов.
4. Повторное заполнение ячеек на Matrigel Layer
- Подготовка базальной мембраны матрицу решение оттаиванием матрицы геля (см списка материалов для конкретной марки, используемой в данном исследовании) при 4 ° С и растворения 0,2 мл в 10 мл DMEM / F12 среде.
Примечание: Матрица геля (см списка материалов для конкретной марки, используемой в данном исследовании) должен таять O / N при 4 ° С, чтобы быть полностью оттаять. Держите его на льду, пока непосредственно перед использованием. - Пластина 5 мл базальной мембраны матричное решение на чашку в 100-мм чашках и оставить при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин перед посевом клеток. По крайней мере, два 100-мм чашки необходимы для одного эксперимента.
- Сбор SeV-инфицированные клетки с помощью пипетки, передавать их на 15-мл коническую пробирку и центрифуги при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавить 1 мл свежего KBM502 среду. Подсчитайте количество CEзаполняет с помощью гемоцитометра, удалить базальной мембраны матричного раствора, из 100-мм блюд, приготовленных на шаге 4.2 и пластины 1 × 10 5 и 1 × 10 6 клеток (в 10 мл свежей mTeSR средних) на 100-мм базальной мембраны матрица покрытием блюда. Наконец, используйте пластину, в которой колонии легко определена.
- Выдержите блюдо на 37 ° C в 5% -СО 2 инкубатора O / N.
- Изменение среды до 10 мл плоть mTeSR среду каждый день.
Примечание: Примерно 20-30 дней после заражения, колоний, которые тесно напоминают эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) появится.
5. Разверните Т-клеток, полученных ИПСК
- Подготовка базальной мембраны матрицу решение оттаиванием матрицы геля (см списка материалов для конкретной марки, используемой в данном исследовании) при 4 ° С и растворения 0,2 мл в 10 мл DMEM / F12 среде.
- Пластина 1 мл базальной мембраны матричным раствором на лунку в 6-луночный планшет и оставить при комнатной температуре в течение по крайнейне менее 30 мин, прежде чем выбрать колонии.
- Заполните 96-луночный планшет с 20 мкл среды mTeSR на лунку.
- Выберите колонии, напоминающие эмбриональные под стереомикроскопа с использованием 20 мкл пипетки.
Примечание: колонии ЭСК и ИПСК круглые и плоские, как показано на рисунке 1В. - Передача отобранные колонии в 96-луночный планшет, наполненной mTeSR среда на стадии 5.3.
- Добавить 200 мкл среды mTeSR в каждую лунку и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы разорвать на мелкие колонии комков под стереомикроскопа с использованием 200 мкл пипетки. Снимите базальной мембраны матричного раствора, из хорошо подготовлены в 5,2 и положить каждый колонию в одну лунку базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночного планшета с 2 мл среды mTeSR на лунку.
- Изменение среды до 2 мл плоть mTeSR среду каждый день.
6. Поддержание Т-клеток, полученных ИПСК
Клеточные полученных иПСК Т может поддерживатьсяи хранятся с использованием тех же методов, как для человека ИПСК и ЭСК человека. После того, как IPSC колонии растут, расширить их в более крупные блюда, повторяя ту же процедуру.
- Изменение среды mTeSR каждые 1-2 дня.
- Когда колонии сливаются каждые 5-7 дней, прохождение клетки, используя решение для диссоциации человека ИПСК и ЭСК человека в соответствии с инструкциями изготовителя.
Representative Results
Используя этот протокол, пользователи могут генерировать ИПСК из человека периферических Т-клеток, стабильно. поколение Ipsc от Т-клеток с SeV и Матригель показали примерно 0,002% -. 0,005% эффективности перепрограммирования клеток между ними некоторых случаях доноров и SeV не были обнаружены после нескольких пассажей 16 1А показывает схематическое протокола для генерации Т-клеток, полученных иПСК в фидерных без условий с использованием Матригель и mTeSR среду. Около 20-30 дней после заражения SeV, IPSC колонии признаны их ESC колонии морфологией (Рис 1В). Окрашивание Иммунофлуоресценции показал выражение типичных маркеров плюрипотентных клеток (NANOG, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-и 1-81) в Т-клеток, полученных ИПСК генерируется при фидерных без условий (рис 1в).
"Ширина =" 700 "/>
Рисунок 1. (A): схема протокола для перепрограммирования клеток под Т-фидерных бесплатно условиях в данном исследовании. (В): Типичный ESC, как IPSC колонии на 27 день после забора крови под фидерных без условий. (С): ALP окрашивание и иммунофлюоресценции окрашивания плюрипотентности и поверхностных маркеров (NANOG, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, TRA-и 1-81) в Т-клеток, полученных ИПСК генерируется при фидерных без условий. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих или противоречивых интересов раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Yoshiko Miyake, Саяка Kanaami, Chihana Фуджита, Михо Ямагучи, Natsuko Henmi, и Рей Оно из Кейо школы медицины университета для оказания технической помощи. Эта работа была частично финансируется за счет программы поддержки R & D Systems, чтобы ускорить практическое использование результатов исследований в области здравоохранения, и программы шоссе для реализации регенеративной медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
