Abstract
Recentemente, iPSCs hanno attirato l'attenzione come una nuova fonte di cellule per terapie rigenerative. Sebbene il metodo iniziale per iPSCs generano invocata fibroblasti dermici ottenuti mediante biopsia invasiva e retrovirali inserimento genomica di transgeni, ci sono stati molti sforzi per evitare questi inconvenienti. Le cellule T periferiche umani sono una fonte di cellule unico per la generazione di iPSCs. iPSCs derivati da cellule T contengono riarrangiamenti del recettore delle cellule T (TCR) geni e sono una fonte di cellule T antigene-specifiche. Inoltre, T cell receptor riarrangiamento nel genoma ha il potenziale di etichettare linee di cellule individuali e di distinguere tra le cellule trapiantate e donatori. Per applicazione clinica sicura di iPSCs, è importante ridurre al minimo il rischio di esporre iPSCs appena generato ad agenti nocivi. Anche se le cellule di siero fetale bovino e di alimentazione sono stati fondamentali per la coltura di cellule staminali pluripotenti, è preferibile rimuoverli dal sistema di coltura per ridurre il rischiodi patogenicità imprevedibile. Per far fronte a questo, abbiamo stabilito un protocollo per la generazione di iPSCs dalle cellule T periferico umano mediante virus di Sendai per ridurre il rischio di esposizione agli agenti patogeni iPSCs indefiniti. Anche se la gestione Sendai virus richiede attrezzature con il livello di biosicurezza adeguato, virus infetta Sendai cellule T attivate, senza inserimento del genoma, ma con alta efficienza. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di iPSCs dalle cellule T periferici umani in condizioni di assenza di alimentazione utilizzando una combinazione di attivo coltura delle cellule T e virus di Sendai.
Introduction
iPSCs hanno suscitato notevole attenzione come fonte innovativa di cellule per la medicina rigenerativa 1-3. Ad oggi, diversi metodi per la generazione di iPSCs sono stati segnalati 4,5. Tra questi, iPSCs generato da cellule T umane sono stati di particolare interesse a causa del metodo meno invasivo del campionamento delle cellule 6-8. Inoltre, iPSCs derivati da cellule T contiene riarrangiamenti del gene del recettore delle cellule T (TCR) e sono quindi una fonte di cellule T antigene-specifiche 9,10. Pertanto, generando cellule derivate iPSCs T è sicuro utile per progredire la medicina rigenerativa.
Questo metodo si basa sul concetto di ridurre il rischio di patogenicità imprevedibile. Per applicazione clinica sicura di iPSCs è importante ridurre il rischio di esposizione ad agenti patogeni 11. Precedentemente in molti sistemi di coltura di cellule staminali pluripotenti, cellule di siero fetale bovino e alimentatore sono stati utilizzati come reagente essenziales 12. Tuttavia, la rimozione di entrambi questi reagenti del sistema di coltura è preferibile per la generazione COPSI per ridurre il rischio di patogenicità imprevedibile.
Inoltre, questo metodo ha il vantaggio di evitare il campionamento delle cellule invasive da pazienti e laboriosa preparazione di cellule feeder. Perché cellule T iPSCs derivati sono già stati utilizzati con successo nella ricerca sulle malattie 13,14, questo metodo è applicabile e utile per generare iPSCs malattie specifiche da pazienti anche.
Tra i metodi di riprogrammazione delle cellule T, utilizzando il virus Sendai (SeV) vettore come veicolo gene è un metodo che può generare iPSCs con alta efficienza 7,16. Inoltre, poiché SeV è un singolo filamento RNA virus e non necessita di una fase di DNA per la replicazione, il suo uso nella generazione COPSI evita la rottura del genoma ospite 17-19. Pertanto, abbiamo stabilito protocolli per la generazione di iPSCs da cellule T periferico umano nel siero-frEE e condizioni senza alimentazione utilizzando una combinazione di matrigel, mTeSR media, e Sev vettori.
Protocol
1. Preparare cellule T attivate umana
- Raccogliere 10 ml di sangue intero eparinizzati da un donatore mediante prelievo venoso.
- Ottenere il consenso informato dei donatori in anticipo di prelievo venoso. Venipuntura deve essere effettuata da personale qualificato ed addestrato.
- Maneggiare i campioni di sangue ottenuti con materiale sterile e seguenti linee guida di biosicurezza adeguate.
- Diluire 10 ml di sangue intero eparinizzati con 10 ml D-PBS (-).
- Mettere 15 ml di soluzione di Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) in un nuovo tubo conico da 50 ml.
- Strato la soluzione di sangue da 20 ml preparata al punto 1.2 sulla soluzione di Ficoll al punto 1.3. L'utilizzo di un pipetta elettrico, della soluzione di sangue preparata al punto 1.2 correre lentamente lungo la parete interna del tubo. Fare attenzione a non mescolare la soluzione di sangue e la soluzione Ficoll.
- Centrifugare a 400 xg per 30 minuti a RT. Impostare la velocità di decelerazione centrifuga per "lento".
Nota: Dopo la centrifugazione, un bianco sottilestrato emerge tra uno strato di plasma lattiginoso superiore e uno strato di Ficoll bassa chiara. Questo strato sottile bianca contiene cellule mononucleate. - Trasferire lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta conica da 50 ml con una pipetta 1 ml. Fare attenzione a non includere la soluzione di Ficoll.
- Aggiungere D-PBS (-) per le cellule mononucleate ad un volume totale di 10 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante. Aggiungere 10 ml di D-PBS (-) alle cellule mononucleari, e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di KBM502 medio per le cellule mononucleate raccolti, e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Oltre 5 × 10 6 cellule mononucleari possono essere ottenuti da 10 ml di sangue intero eparinizzati con separazione appropriato utilizzando Ficoll.
- Preparare una soluzione di anticorpo CD3 anti-umano ad una concentrazione di 10 ug / ml in PBS-D (-). Aggiungere la soluzione di anticorpi anti-CD3 umana a una 6-pozzetti, immergere il surfasso di ogni pozzetto e incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per almeno 30 min.
- Rimuovere la soluzione di anticorpi CD3 anti-umano da ciascun pozzetto e lavare una volta con PBS-D (-) appena prima semina delle cellule.
- Cellule mononucleate Seed che sono stati preparati nel passo 1.9 ad una densità di 2,5 x 10 5 cellule / cm 2 sui CD3 antiumano 6 pozzetti rivestiti con anticorpo in KBM502 media. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per 3-7 giorni senza mezzo di cambiamento fino a quando le cellule T raggiungono confluenza. Le cellule T in questo periodo sono sia le cellule in sospensione e aderenti.
2. Infettare T umano Celle con SEV Vettori
- Dopo 3-7 giorni la cultura, raccogliere le cellule T attivate con medio esistente pipettando. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare le cellule e la piastra 1.5 × 10 6 celle (in 2 ml di media KBM502 fresco) in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti anti-CD3 anticorpo-rivestito.
- Scongelare le soluzioni SEV di Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF sul ghiaccio.
- Aggiungere le soluzioni SEV contenenti Oct3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, Klf4-SEV / TSΔF, e c-Myc (HNL) -sev / TS15ΔF individualmente ai pozzi, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) 10. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore.
3. Rimuovere Sev Vettori da T cellule umane
- 24 ore dopo l'infezione, raccogliere le cellule infettate con una pipetta. Se ci sono cellule aderenti, possono facilmente essere staccati li pipettando ripetutamente su e giù. Trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare il surnatante contenente i vettori Sev, e aggiungere 2 ml di mezzo KBM502 fresco. Cellule replate a each dei pozzetti. Incubare a 37 ° C in un incubatore -CO 2 5% per altre 24 ore.
4. Cellule reseed su uno strato Matrigel
- Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12.
Nota: Gel Matrix (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) deve scongelare O / N a 4 ° C per essere completamente scongelati. Tenerlo in ghiaccio fino al momento dell'uso. - Piatto soluzione matrice membrana basale 5 ml per piastra in piastre da 100 mm e lasciare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti prima della semina cellule. Almeno due piatti da 100 mm sono necessari per un esperimento.
- Raccogliere le cellule SEV-infettate pipettando, trasferirli su un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo KBM502 fresco. Contare il numero di cells con un emocitometro, rimuovere la soluzione di matrice membrana basale da piatti da 100 mm preparati nel passaggio 4.2 e piastra 1 × 10 5 e 1 × 10 6 celle (in 10 ml di media mTeSR fresco) su un 100 mm membrana basale matrice rivestita piatti. Infine, utilizzare la piastra in cui le colonie sono facilmente raccolti.
- Incubare il piatto a 37 ° C in 5% -CO 2 incubatore O / N.
- Cambiare il medio 10 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni.
Nota: Circa 20-30 giorni dopo l'infezione, colonie che ricordano da vicino le cellule staminali embrionali (ESC) apparirà.
5. Espandere T iPSCs derivati dalle cellule
- Preparare la soluzione di matrice membrana basale da gel matrice scongelamento (si veda l'elenco dei materiali per il marchio specifico utilizzato in questo studio) a 4 ° C e sciogliendo 0,2 ml in 10 ml di terreno DMEM / F12.
- Piastra 1 ml di soluzione di matrice membrana basale per bene in un 6-pozzetti e lasciare a temperatura ambiente per un periodoalmeno 30 minuti prima di prendere colonie.
- Riempire una piastra a 96 pozzetti con 20 ml di mTeSR media per pozzetto.
- Selezionare colonie che assomigliano CES allo stereomicroscopio con una pipetta 20 ml.
Nota: Le colonie di CES e iPSCs sono rotondi e piatta come mostrato in Figura 1B. - Trasferire colonie selezionate nella piastra a 96 pozzetti pieni di mTeSR medie punto 5.3.
- Aggiungere 200 ml di mTeSR media ad ogni bene e con attenzione pipetta su e giù per rompere la colonia in piccoli ciuffi con lo stereomicroscopio con una pipetta 200 l. Rimuovere la soluzione di matrice membrana basale dalla ben preparato in 5.2 e mettere ogni colonia in un pozzetto della membrana basale matrice rivestite 6 pozzetti con 2 ml di mTeSR media per pozzetto.
- Cambiare il medio-2 ml di incarnarsi mTeSR medio a giorni alterni.
6. Mantenere T iPSCs derivati dalle cellule
Le iPSCs derivati dalle cellule T possono essere mantenutie memorizzati utilizzando le stesse tecniche per iPSCs umane e CES umani. Una volta che le colonie IPSC crescono, li espandersi in piatti più grandi ripetendo la stessa procedura.
- Cambia il mezzo mTeSR ogni 1-2 giorni.
- Quando le colonie diventano confluenti ogni 5-7 giorni, di passaggio le cellule utilizzando soluzione dissociazione per iPSCs umani e CES umani in base alle istruzioni del produttore.
Representative Results
Usando questo protocollo, gli utenti sono in grado di generare iPSCs dalle cellule T periferico umano stabile. generazione IPSC dalle cellule T con SeV e matrigel ha mostrato circa il 0,002% -. 0,005% di efficienza della riprogrammazione delle cellule tra diversi casi donatori e SeV non sono stati individuati dopo vari passaggi 16 Figura 1A mostra uno schema del protocollo per la generazione di cellule T-derivato iPSCs in condizioni di assenza di alimentazione con matrigel e mTeSR media. Intorno 20-30 giorni dopo l'infezione con SeV, colonie IPSC sono riconosciuti per la loro colonia ESC-come morfologia (Figura 1B). Immunofluorescenza rivela espressione di marcatori tipici delle cellule pluripotenti (Nanog, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) in iPSCs derivati dalle cellule T ottenuti in condizioni di libero-feeder (Figura 1C).
"Width =" 700 "/>
Figura 1. (A): Uno schema del protocollo di riprogrammazione delle cellule T in condizioni senza feeder in questo studio. (B): Una tipica colonia ESC-come IPSC il giorno 27 dopo il prelievo di sangue in condizioni di libero-feeder. (C): ALP colorazione e immunofluorescenza per pluripotenza e superficiali marcatori (Nanog, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) in iPSCs derivati dalle cellule T in condizioni di libero-feeder. Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Disclosures
Gli autori non hanno alcuna competizione o in conflitto gli interessi da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, e Rei Ohno della scuola dell'università Keio di Medicina per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato da un programma di R & D Systems sostegno per accelerare l'uso pratico dei risultati della ricerca di salute, e il programma di strada per la realizzazione di Medicina Rigenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
