Introduction
Las opciones de tratamiento para las enfermedades infecciosas se han complicado por el rápido aumento de bacterias resistentes a múltiples fármacos que son inmunes a una amplia gama de fármacos antibióticos 1. Con altas tasas de morbilidad y mortalidad por infecciones con bacterias resistentes mediadas, existe la necesidad de intensificar los procesos de desarrollo de fármacos y / o explorar mejores alternativas antibacterianos para mejorar las opciones terapéuticas. Últimamente, el enfoque anti-virulencia está ganando interés dado su potencial en la prevención de la virulencia través de métodos no bactericidas, por lo tanto, la mitigación de los riesgos de los mecanismos de resistencia 2.
Quórum de detección es un "interruptor maestro" en la virulencia bacteriana y la interrupción de este fenómeno de señalización es un método anti-virulencia prometedora contra patogénesis 3. El inicio de la virulencia requiere la acumulación de moléculas de quórum en el medio extracelular después de que se alcanza una densidad crítica población bacteriana. Como quomoléculas de ron difunden de nuevo en la matriz intracelular, la unión con sus receptores afines conduce a la activación de factores de virulencia, así como genes asociados con la resistencia a los antibióticos y la formación de biopelículas 4. En, la interrupción del quórum de detección general, implica la inhibición de molécula de quórum y la interacción del receptor sin afectar las rutas metabólicas primarias. Por lo tanto, no tiene ninguna implicación directo sobre el crecimiento celular. Desde la aptitud no se vea comprometida, no hay presión de selección mínimos para las bacterias para evolucionar y ganar resistencia contra tales tratamientos 5. Además, la interrupción de detección de quórum puede interferir con los mecanismos de protección bacterianas inherentes, como en el caso de la formación de biopelículas, que proporciona protección de los agentes anti-bacterianas y respuestas inmunes del huésped.
Se estima que el 99% de los microbios en la Tierra existe en matrices de biofilm como complejas, que confiere ventajas de supervivencia cruciales a los microorganismos que viven dentro de THestructuras ESE 6. Más importante aún, la formación de estos dominios sésiles es la causa de las infecciones nosocomiales más persistentes y crónicas 7. Acinetobacter baumannii es uno de los principales patógenos humanos que se asocia con infecciones globales adquiridas en el hospital y su virulencia se atribuye en gran parte al quórum de detección la formación de biopelículas mediada 8. Enzimas-quorum quenching han utilizado con éxito en la interrupción de la transducción de señales mediada por-quórum dirigidas a un grupo de compuestos conocido como N-acil homoserina lactonas (AHL) que son producidas por bacterias Gram-negativas 9. Varios estudios también han expandido en el uso de estas enzimas para bloquear la patogénesis bacteriana a través de la reducción de la expresión del factor de virulencia y el número de células en los biofilms 10,11. Desafortunadamente, sigue existiendo una falta de demostración palpable de la utilización eficaz de las enzimas de quórum de extinción contra la formación de biofilm por patógenos bacterianos. losre ha habido intentos de utilizar inhibidores de quórum (análogos de AHL), en lugar de las enzimas de quórum de enfriamiento, para interrumpir A. la formación de biopelículas baumannii 12. Aunque este método de uso de inhibidores de moléculas pequeñas es un enfoque válido, el mantenimiento de su biodisponibilidad en usos de traslación puede ser un desafío. Por el contrario, el uso de enzimas de quórum para saciar catalíticos podría eludir el problema biodisponibilidad como enzimas son más susceptibles a la inmovilización sobre superficies de dispositivos biomédicos para efectos terapéuticos.
Aquí se describe una evaluación de los efectos de lactonasas de quórum para saciar la ingeniería de Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 en la formación de biopelículas bacterianas, mediante la tinción de cristal violeta y microscopía láser confocal de barrido (CLSM). Este estudio es la primera demostración con éxito de la interrupción del biofilm en un A. clínicamente relevante cepa baumannii S1 utilizando enzimas de quórum temple. Los métodos descritosen este estudio son útiles para evaluar la eficacia de otras enzimas de quórum para saciar en posteriores esfuerzos de desarrollo terapéuticas contra bacterias Gram-negativas patógenas.
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Protocol
1. Crystal Violet La cuantificación de Biofilm Formation en A. baumannii S1
- Cultivar una cultura 5 ml de A. baumannii S1 en caldo Lisogenia (LB) (triptona 10 g / L, extracto de levadura 5 g / l) a 30 ° C en una incubadora con agitación (220 rpm) durante 16 hr.
- Ajuste el cultivo de A. baumannii S1 a un OD 600 de 0,8 deseado. Usando una placa de 96 pocillos, inocular el cultivo de bacterias (1: 100 dilución) en fresco LB que contiene 10 l de enzima purificada GKL (40 mg / ml); volumen final de la nueva cultura es de 100 l.
- Preparar una cultura de control, así; esto no contendrá ninguna enzima. Repita condiciones similares para obtener el número deseado de repeticiones.
- Cubra el plato con una tapa y colóquelo en un recipiente de plástico de 10 L sellada. Incubar la placa a 30 ° C durante 3 horas antes de retirar suavemente los medios de comunicación.
- Añadir otros 100 l de medio LB fresco al pozo e incubar la placa durante 21 horas a 30 ° C. Después de que el segundo período de incubación, retire con cuidado todos los medios de comunicación. Lavar la célula bacterias planctónicas con 200 l de agua estéril. Asegúrese de que sólo hay una perturbación mínima a las células durante el lavado.
- Añadir 100 l de solución de cristal violeta al 1% a cada pocillo e incubar durante 15 min a TA. Eliminar la solución de cristal violeta lavando el bien con 200 l de agua estéril. Repita el lavado dos veces más.
- Añadir 100 l de ácido acético 33% a cada pocillo e incubar durante 15 min con agitación suave; esto va a disolver el colorante.
- Cuantificar la cantidad de biofilm formado por la medición de la absorbancia del violeta cristal a los 600 nm. La cantidad de cristal violeta es proporcional a la cantidad de formación de biopelículas.
2. confocal de barrido láser microscopía de A. baumannii S1 Biofilm
- Cultivar una cultura 5 ml de A. baumannii S1 en LB a 30 ° C en una incubadora con agitación (220 rpm) durante 16 hr.
- Anunciosólo el cultivo de A. baumannii S1 a un OD 600 de 0,8 deseado. El uso de un 35 mm μ-plato con fondo de cristal, inocular el cultivo de bacterias (dilución 1: 100) en fresco LB que contiene 30 l de enzima purificada GKL (40 mg / ml); volumen final de la nueva cultura es de 1 ml.
- Cubra la μ-plato con una tapa y colóquelo en un recipiente de plástico de 10 L sellada. Incubar la μ-Dish a 30 ° C durante 3 horas antes de retirar suavemente los medios de comunicación. Añadir 30 l de enzima purificada y GKL medio fresco, llevándola a un volumen total de 1 ml. Incubar durante otras 21 horas a 30 ° C.
- Repita el paso 2.3 e incubar la μ-Dish durante otras 24 horas a 30 ° C. Luego, retire los medios de comunicación con suavidad.
- Añadir 500 l de 5 mg / ml Alex Fluo 488 conjugado con aglutinina de germen de trigo (WGA) disuelto en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a la μ-Dish y se incuba a 37 ° C durante 30 min; esto va a manchar la biopelícula formada. Retire la solución de tinción y lavar tque Mu Plato con 2 ml de HBSS. Repita el paso de lavado una vez más.
- Añadir 500 l de 3,7% de formaldehído disuelto en HBSS y se incuba a 37 ° C durante 30 min; Esto solucionará el biofilm sobre la μ-Dish. Lave la μ-Dish una vez con 2 ml de HBSS y luego retire la solución completamente. El μ-Dish fijo con biofilm se puede almacenar en la oscuridad a 4 ° C antes de la formación de imágenes CLSM.
- Para imágenes CLSM y el análisis, utilizar 63 veces de aumento para generar 97 pilas por imagen con un intervalo de 0,21 micras por pila.
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Representative Results
En la cuantificación experimento cristal violeta, se utilizaron dos enzimas de quórum de enfriamiento para demostrar la viabilidad en la interrupción de la formación de biopelículas: de tipo salvaje GKL y un doble mutante GKL mejorado (E101G / R230C). Ambas enzimas se han demostrado para demostrar la actividad lactonasa contra 3-hidroxi-decanoil-L-homoserina lactona (3-OH-C 10 -HSL), la molécula de quórum importante utilizado por A. baumannii S1 14. Para la evaluación válida de interrupción del biofilm, sus respectivas enzimas catalíticamente inactivos (mostrados anteriormente no secuestrar ligandos AHL) también fueron incluidos como controles inmediatos (GKL D266N mutante y GKL E101G / R230C / D266N mutante). Además de utilizar de tipo salvaje A. baumannii S1, la capacidad de formación de biofilm de una cepa mutante Δ Abai (AHL sintasa-deficiente) también fue probado. Ambas enzimas quórum templado, de tipo salvaje GKL y GKL E101G / R230C mutantes fueron capaces de reducir significativamente la formación de biopelículas en el preA. tratada culturas baumannii S1 (n = 10; valor de p ≤ 0,0001) (Figura 1). Sin embargo, el grado de interrupción biofilm para ambas enzimas no es proporcional a su eficacia contra 3-OH-C 10 -HSL. La tasa de rotación (k gato) del / R230C mutante GKL E101G es seis veces más rápido que los de tipo salvaje GKL contra 3-OH-C 10 -HSL 14. Sin embargo, la diferencia en el grado de perturbación biofilm entre las enzimas es sólo dos veces.
Figura 1. A. formación baumannii ensayo de interrupción biofilm. Biofilm se midió mediante tinción con violeta cristal. Columnas rojas representan la cantidad de biofilm formado por tipo salvaje A. baumannii y Δ ABAI mutante, sin la adición de lactonasas-quórum de temple. Columnas azules representan el amount de biofilm formado por tipo salvaje A. baumannii en presencia de cuatro diferentes enzimas GKL: inactivo GKL mutante D266N, de tipo salvaje GKL, inactiva GKL E101G / R230C / D266N mutantes y GKL E101G / R230C mutantes. ****, P-valor de ≤ 0,0001. Reproducido con permiso de Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia 58, 1802 a 1805 (2.014). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Imagen confocal de A. la formación de biopelículas baumannii S1 se utilizó para proporcionar una medida cualitativa y cuantitativa de los efectos de quórum de enfriamiento sobre la morfología estructural de estos dominios sésiles. La mejora de la mutante / R230C GKL E101G y su enzima catalíticamente inactiva se utilizaron para la comparación. El contraste de la imagen diferencial (DIC) Imagen mostró que el tratamiento con el / R230C mejorada mutante E101G GKL resultó en una disminución en el tamaño biofilm (Figure 2). Análisis de las imágenes de fluorescencia también reveló que hubo una reducción en el área superficial, la biomasa y el espesor promedio de biofilm cuando son tratados con el / mutante R230C mejorado GKL E101G (Tabla 1).
Imágenes Figura 2. Representante de escaneo láser confocal de microscopía de A. biofilms baumannii. A. biofilms baumannii fueron tratados con inactivo GKL E101G / R230C / mutante D266N (A) y GKL E101G / mutante R230C (B) y se tiñeron con Alexa Fluor 488 conjugado WGA. DIC imágenes de los biofilms (izquierda) e imágenes de fluorescencia de las biopelículas (derecha) se muestran para xy representante (en el centro), yz (derecha), y xz secciones (abajo). Reproducido con permiso de Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia <strong> de 58 años, desde 1802 hasta 1.805 (2.014). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Valor ± SD | |||
| Característica | Ningún tratamiento | El tratamiento con mutante inactivo | El tratamiento con E101G / R230C mutante |
| Biomasa (m 3 / m 2) | 2,57 ± 1,65 | 3,39 ± 1,33 | 1,37 ** ± 0,20 |
| Espesor medio (m) | 3,68 ± 2,51 | 3,41 ± 1,31 | 1,21 ** 0,21 ± |
| Superficie (m) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 115,094.7 ± | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| a n = 10 pilas de imágenes. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, en comparación con el tratamiento con inactiva E101G / R230C / D266N mutante. | |||
Tabla 1. A. baumannii biofilm cuantificación estructural.
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Discussion
En ambos conjuntos de experimentos, A. baumannii S1 se cultivó en medio LB sin NaCl como una alta concentración de sal puede reducir la cantidad de formación de biopelículas por las bacterias 15. La presencia de tales artefacto podría subestimar la cantidad de formación de biopelículas, así como los efectos de las enzimas de quórum de extinción a través de diferentes condiciones de tratamiento. El uso de una enzima catalíticamente inactiva es importante como un control negativo para eliminar los posibles efectos de la retención de la enzima. Figura 1 muestra que incluso si las enzimas inactivas secuestran moléculas de quórum, la formación de biopelículas no se interrumpe.
A. baumannii S1 forma una delicada estructura del biofilm de anillo entre el aire y la interfaz de líquido en el pocillo de la placa de 96 pocillos. Por lo tanto, es crucial para evitar la agitación excesiva durante las etapas de eliminación de los medios de comunicación y lavado para evitar la eliminación accidental de biopelículas bacterianas. Medios LB se retiró después de cada incubación aeliminar las células planctónicas. Además, la placa de 96 pocillos se colocó en un recipiente de plástico 10 L para minimizar las perturbaciones en el flujo de aire y para crear un entorno de micro anaeróbica que favorece la formación de biopelículas. La cuantificación de biopelículas en una placa de 96 pocillos también depende de la cantidad de violeta cristal a cada pocillo. En el caso de que el exceso de violeta cristal se añade a un pozo, el número de pasos de lavado se puede aumentar. El experimento de tinción de cristal violeta ofrece una comparación relativa de las eficiencias de quórum de extinción en la interrupción del biofilm. Aunque tinción con violeta cristal es cuantitativo para la medición de la formación de biopelículas, es sólo semi-cuantitativa, en términos de la eficiencia catalítica de las enzimas de quórum de temple. Para la comparación estadística precisa, suficientes tamaños de las muestras son importantes para los diferentes grupos de tratamiento. Outliers también deben eliminarse para evitar la tergiversación de los resultados.
Imágenes y el análisis de la biopelícula bacteriana confocal es un USEFherramienta ul para evaluar los efectos cualitativos de las enzimas de quórum de extinción. Sin embargo, el proceso de selección de biofilm para el análisis puede ser un canal potencial de sesgo si el usuario es consciente de la enzima tipo de quórum-temple administrada (activo o inactivo). Para evitar la posibilidad de sesgo, el experimento puede ser diseñado para excluir la información enzima del usuario o utilizar un enfoque aleatorio para la selección. Una estrategia de selección imparcial también permite una mejor comparación cuantitativa de morfologías biofilm por CLSM. Sin embargo, este es el primer estudio que describe un método para evaluar el resultado de las enzimas de quórum de extinción en las biopelículas bacterianas. Tinción violeta Crystal ha demostrado la utilidad de las enzimas de quórum de extinción en la interrupción biofilm y reveló que modi operandorum enzimas no se limitan a reducir el número de células y la expresión de factor de virulencia. Mientras tanto, los cambios morfológicos determinados por análisis de CLSM también pueden proporcionar ideas sobre posibles molecular objetivos de estas enzimas. Aunque el experimento actual fue diseñado para investigar los efectos de pretratamiento enzimas en las biopelículas bacterianas, el protocolo puede ser modificado para evaluar el efecto de la enzima sobre biofilm preformada mediante la adición de la enzima después del crecimiento bacteriano o para examinar su competencia en condiciones fisiológicas mediante el uso de suero condiciones -como para la cultura. El protocolo utilizado para estudiar las enzimas GKL puede extenderse a otras enzimas y agentes patógenos quórum temple para investigar su relación en la interrupción del biofilm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
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