Automatisert Modular høy gjennomstrømning Exopolysaccharide Screening Platform Sammen med Highly Sensitive Karbohydrat Fingeravtrykk Analysis

Abstract

Mange mikroorganismer er i stand til å produsere og utskille exopolysaccharides (EPS), som har viktige implikasjoner i medisinske felt, mat programmer eller i utskifting av petro-baserte kjemikalier. Vi beskriver en analytisk plattform som skal automatiseres på et væskebehandlingssystem som gjør det mulig hurtig og pålitelig analyse av typen og mengden av EPS produsert av mikroorganismer. Det gjør det mulig for brukeren å identifisere nye naturlige mikrobielle exopolysaccharide produsentene og å analysere karbohydrat fingeravtrykk av de tilsvarende polymerer i løpet av én dag i high-throughput (HT). Ved hjelp av denne plattformen, kan strekk samlinger samt biblioteker med strekk varianter som kan oppnås i ingeniør tilnærminger bli vist. Plattformen har en moduloppsett, noe som tillater en separasjon av protokollen i to hoveddeler. For det første er det et automatisert system screening, som kombinerer ulike polysakkarid-deteksjonsmoduler: en semi-kvantitativ analyse av viskositetsreduserendey formasjon via et sentrifugeringstrinn, en analyse av polymerdannelse via alkohol utfelling og bestemmelse av det totale karbohydratinnhold via et fenol-svovelsyre-transformasjon. Her er det mulig å skjerme opptil 384 stammer per løp. Den andre delen gir en detaljert monosakkarid analyse for alle de valgte EPS produsentene som er identifisert i den første del ved å kombinere to vesentlige moduler: analyse av den fullstendige monomerblanding via ultra-høy ytelse væskekromatografi kombinert med ultrafiolett og elektrospray ionisering ionefelle deteksjon ( UHPLC-UV-ESI-MS) og bestemmelse av pyruvat som en polymer substituent (tilstedeværelse av pyruvat ketal) via enzymatisk oksydasjon som er koplet til en fargedannelse. Alle de analytiske moduler av denne screening plattformen kan kombineres på forskjellige måter og tilpasses individuelle behov. I tillegg kan de alle håndteres manuelt eller utført med et væskehåndteringssystem. Dermed screening plaTForm muliggjør en stor fleksibilitet for å identifisere ulike EPS.

Introduction

Mikrobielle exopolysaccharides (EPS) er et strukturelt svært mangfoldig gruppe av polymerer som oppfyller ulike biologiske funksjoner. De vanligvis er bygget av sammensatte repeterende enheter, som utmerker seg ved forskjellige typer av monomerer (sukker, sukkerderivater, sukkersyrer), båndene mellom disse monomerene og deres erstatninger. Det strukturelle mangfoldet av mikrobielle polysakkarider overfører ganske forskjellige egenskaper til medlemmene av dette molekylet klassen, noe som gjør at deres søknad på ulike felt som mat ^en, kosmetikk ^2,3, konstruksjon kjemi ^fire eller vannbehandling ^fem. For ytterligere å utvide anvendelsesområdet for disse biobaserte og slike bærekraftige polymerer identifisering av nye naturlige mikrobielle polysakkarider samt prosjektering av strukturelle varianter representerer lovende tilnærminger. Uansett, er en rask screening metode som kreves for å raskt skanne et stort antall mikrobielle stammer for their polysakkarid formasjon, og å analysere sine produkter. Vi har derfor nylig utviklet en 96-brønns HT-screening plattform for analyse av mikrobielle polysakkarid produksjon fra naturlige isolater eller modifiserte strekk-varianter som inkluderer identifikasjon av den monomere sammensetningen ^6.

Bruk av denne plattformen for en første screeningrunde på ~ 500 naturlige isolater mulig for oss å identifisere bare 10 til 20% av de isolerte stammene som å være i stand til å produsere EPS (data ikke vist). Dette betyr at 80-90% av de analyserte stammene ikke produsere EPS under betingelser som er brukt, og derfor en ytterligere analyse av den detaljerte karbohydrat fingeravtrykket var ikke nødvendig. Ettersom dette meget avansert identifikasjon av den monomere sammensetningen er en tidkrevende prosess, særlig for dataanalyse, til en hurtig pre-screening-metoden identifisere stammer som positive i EPS produksjon, vil drastisk øke effektiviteten. Videre reagenser,forbruksvarer og tidsmåling på UHPLC-UV-ESI-MS ville bli redusert. I tillegg er de forskjellige analytiske modulene, mens på den ene side gjør fremgangsmåten meget pålitelig og er på den annen side kompliserer manuell håndtering av mer enn to 96-brønners plater i parallell, og som sådan begrenser det fulle potensialet av fremgangsmåten. Av disse grunner, bestemte vi oss for å utvikle en automatisert screening plattform. Derfor, i kombinasjon vi den modulære formatet på eksisterende karbohydrat fingeravtrykket teknikk med en helautomatisk hurtig påvisning fremgangsmåte av den totale sukkerinnhold, basert på absorbans måling.

Den fenol-svovelsyre metode representerer fortsatt metoden for valg for rask bestemmelse av total karbohydrat innhold av bakterier og plante polysakkarider ^7,8. Denne metoden ble først beskrevet av Dubois et al. ⁹ og tilrettelagt for ulike programmer og utvalgsstørrelser, selv for liten skala i 96-brønners plater ^10,11. den phenol-svovelsyre-metoden måler det totale karbohydratinnhold av en verdi, summating alle monomere, oligomere og polymere karbohydrater av prøvene.

Å ta disse forhold i betraktning, er valget av et egnet dyrkingsmedium viktig å anvende denne metoden. Komplekse medier som inneholder oligomere eller polymere karbohydrat forbindelser som gjærekstrakt kan føre til en endret polymerinnhold og derfor bør strengt unngås. Videre er store mengder sukker anvendes som C-kilde for dyrking av stammene. Høye nivåer av gjenværende karbohydrater fra dyrking prosessen kan negativt påvirke målingen av EPS-innhold.

Derfor er bruk av definerte og rene sukker anbefales. I våre forsøk har vi brukt glukose for dyrking av cellene. De resterende glukose etter kultivering ble redusert ved hjelp av en gel-filtrering og bestemt ved hjelp av en glukose-assay. Til slutt, glukose tilsvars av polysakkaridene ble beregnet ved å subtrahere den gjenværende glukose etter gelfiltrering fra det totale karbohydratinnhold som var blitt detektert med fenol-svovelsyre-metoden. Gelfiltrering og glukose-assay i kombinasjon med fenol-svovelsyre-metoden sikrer pålitelige resultater og er i stand til å være vårt første, fullstendig automatisert deteksjon system.

To nye analysemoduler ble inkludert i den automatiserte screening plattformen for å øke mengden av informasjon fra EPS-deteksjonssystem: utfellingen og observasjon av en økning i viskositeten.

Mange forskjellige EPS - f.eks suksinoglykan, xanthan og colonic syre ¹² - er rapportert å være modifisert med en ikke-karbohydrat pyruvat ketal på sukker stillinger C4 og C6. Disse pyruvat ketaler (på samme måte som succinyl halvestere og uronsyrer) bidrar til den polyanioniske natur, og derfor, til den fysiske properties av polymeren ved å kommunisere via toverdige kationer, broer ^13. For å identifisere de bestemte polymerer bestemmelse av pyruvat ble etablert som en annen ytterligere analysemodul. Dette øker informasjon om polysakkarid substituenter og deres potensielle makroskopiske egenskaper.

Ved å kombinere samtlige moduler gjør det mulig å identifisere forskjellige EPS, samt en rask og effektiv fastsetting av EPS-produsenter. Ved at tilnærmingen screening plattformen kan deles inn i to hoveddeler (figur 1). Innenfor automatisert screening (del I) arbeidsflyten skjer helautomatisk (tabell 1) for raskt å forhåndsvelge EPS produserende stammer. Karbohydrat fingeravtrykk-analyse (del II) bestemmer kvantitativt monomersammensetningen av EPS produsert av forut valgte stammer. Derved ble det dataanalyse minimalisert for å optimalisere den screening av store strekk-samlinger. Dettetilbyr muligheten for å analysere 384 spenninger i en enkelt automatisert screening løp og med to løp som er mulig pr dag av 768 stammer per dag. I tillegg gir den karbohydrat fingeravtrykk analyse en enda mer detaljert oversikt over alle de identifiserte EPS. Dette gjør det mulig rettet analyse og identifikasjon av bare litt forskjellige EPS-varianter eller helt nye sammenlignet med de allerede beskrevne kjemiske strukturer av EPS.

Protocol

1. Automatisert Screening

Merk: Alle væskehåndtering trinn er ferdig med en robot flytende håndtering system. Sammensetningen av roboten tegnebrettet er presentert i figur 2. Alle forbruksvarer blir lagret i lagrings karusellen, med mindre annet er nevnt. For alle automatiserte screening trinn en robotmanipulator (RM) beveger forbruksvarer, (dyp brønn plate (DWP), mikro-titer-plate (MTP), polymerase kjedereaksjon plate (PCR-plate) og så videre) mellom karusellstillingene (CP ) og arbeidsbordet stillinger (betalingsvillighet). Alle pipettes trinn utføres med en 96-kanals-pipette-arm, bortsett fra hvis det er nevnt noe annet. Alle trinn programmeres og utføres automatisk i 96-brønners format.

1. Strain Dyrking (Oppgave 1 i figur 1)
   Merk: Håndtak inokulering av de antatte EPS-produserende stammer og forsegling av dyrkningsplater under sterile betingelser (LAF). den automatiserterask screening kan håndtere fire 96-brønners plater per løp. Ulike stammer av flere slekter var allerede testet ^seks.
   1. vaksinere manuelt pre-kulturen (1 ml EPS-medier i en DWP) med en 96-pinners portreplikator fra en 96-brønns glyserol lager plate. Dekke platen med et pustende tettende film for å unngå avdamping og for å tillate lufting. Inkuber ved 30 ° C i 48 timer ved 1000 rpm med en MTP-shaker.
   2. Inokulere hovedkultur (990 ul EPS-medier i en DWP) ved å overføre 10 ul pre-kulturen ved hjelp av en 50 ul 12-kanals pipette og inkuberes under de samme betingelser som den pre-kulturen. Ta et notat av alle stammer som ikke vokser.
2. Klargjøring av Robot arbeidsbord og Storage Carousel
   1. Gi alle forbruks oppført i materialer og utstyr til riktig posisjon i lagrings karusellen. Legg 990 ul dobbeltdestillert vann (ddh ₂ O) i hver brønn av DWP for 1: 100 fortynninger av the glukose-analysen (karusell posisjon 4-1 til 4-4).
   2. Arrangere en 250 ml trau inneholdende 150 ml DDH ₂ O ved arbeidsbordet stilling (WTP) 11.
   3. Avsette en 250 ml trau inneholdende 50 ml glukose-assay reagens-blanding (4 ml 500 mM kaliumfosfat (pH 5,7), 1,5 ml 50 mM 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-sulfonsyre, 2 ml 100 U glukose oksidase, 10 mL 1000 U pepperrotperoksydasekonjugat og 42.49 ml DDH ₂ O) i posisjon WTP 1-2.
   4. Plasser to tomme dummy F-bunn MTPS i posisjon WTP 3-1 og 3-2.
   5. Fjern pustende forsegling film, fordele de viktigste kulturer i karusellen stillinger (CP) 1-1 til 1-4 og starte automatisert robotprogrammet.
3. Ekvilibrering av gel-filtrering Plater
   Merk: Gelfiltrering plater som brukes i løpet av denne screening kan gjenbrukes. For dette vaskes og sentrifuger tre ganger hver med 150 ul DDH ₂ O ved 2000 xg i 2 min ved 20 ° C. Etterpå oppbevar ved 4° C med 75 mL 20% etanol og dekk med en silikonhette matte.
   1. Beveg 250 ml trau (CP 5-7) med 5 mM ammoniumacetat buffer (pH 5,6) til den WTP 3-3.
   2. Overfør gel-filtrering plater (CP 1-6, 1-7, 2-6 og 2-7) fra karusellen til WTPs 4-1 til 4-4.
   3. Sug av 150 ul av ammonium-acetat-buffer ved bruk av 200 mL spisser og dispensere inn i sentrum av alle gel-filtrering plater for likevektsinnstilling.
   4. Overfør gel-filtreringsplater inn i sentrifuge (2000 x g i 2 min ved 20 ° C).
   5. Overfør platene tilbake til arbeidsbordet, gjenta trinnene 1.3.3, 1.3.4 og 1.3.3. Ikke gjenta sentrifugeringstrinn for å unngå dehydrering av gel-filtrering plater. Oppbevar ekvilibrert gel-filtrering platene tilbake inne i karusellen.
4. Cell Fjerning via sentrifugering (Oppgave 1 i figur 1)
   Merk: For å sikre en lav bakgrunn innen screening tilnærming, analysere cellefrittEPS inneholder supernatanter bare og fjerne celler via sentrifugering etter dyrking.
   1. Overfør hovedkulturen DWP fra karusellen (1-1 til 1-4) inn i sentrifugen (4300 xg i 30 minutter ved 20 ° C).
   2. Forbered arbeidsbordet via RM å behandle den viktigste kulturen.
      Merk: For trinn 1.4.2 til 1.4.3.5 systemet alltid håndterer to plater parallelt og deretter gjentar alle trinn med de neste to plater.
      1. For nedbør før filtrering flytte MTP fra CP 6-1 og 6-2 til WTP 4-1 og 5-1. Flytt pH-indikator MTPS fra CP 7-1 og 7-2 til WTP 4-2 og 5-2.
      2. Overfør filtrering plate sammen med oppsamler plate fra CP 2-1 og 2-2 til WTP 4-3 og 5-3. Flytte hoved-kulturen DWP 1-1 og 1-2 fra sentrifugen til WTP 4-4 og 5-4.
      3. Forbered analytiske moduler.
         Merk: Ta 200 mL tips fra tuppen lagring (stilling 2-1 til 2-4). For å redusere forbruks, bruker samme tip-sett for trinn 1.4.3.1.
         1. Overfør 180 ul av hoved-kultursupernatanten til filtreringsplate. Sug 150 ul fra hoved-kultursupernatanten og dispensere 50 ul, og i MTP for utfelling før filtrering, og 100 pl til pH-indikatorplate.
            Merk: pH-bestemmelse er ikke avgjørende; imidlertid, etter tilsetning av 12,5 ml metyl- rød indikator (50 mg i 50 ml etanol) i hver brønn med en flertrinns pipette det indikerer høy syre-produserende stammer. Denne informasjonen kan være nyttig for å unngå veksthemming (ved lav pH) for ytterligere cultivations, for eksempel for en andre screening med høyere buffer konsentrasjon. Videre kan lav pH også indusere EPS produksjonen for å beskytte cellen mot det sure miljø.
         2. Gjenta trinn 1.4.3.1 til den andre hoved-kulturplate. Bruk en frisk spiss-set.
         3. Flytt filtrering platene til sentrifugen og fjerne alle andre platene fra arbeidsbordet tilbake til sine hjem stillinger i carousel.
         4. Gjenta trinn 1.4.2.1 til 1.4.3.3 for tredje og fjerde hoved-kultur plate.
         5. Ta et notat av disse fermenteringskrafter, som viser redusert sedimentering etter sentrifugering av de viktigste kulturplater, når de blir overført tilbake til karusellen (viskositet kontroll).
5. 96-brønn filtrerings for fullstendig celle fjerning (Oppgave 2 i figur 1)
   Merk: For å sikre celle fjerning fra viskøs fermenteringskraft et filtreringstrinn er inkludert i screening.
   1. Sentrifuger filtrering platene ved 3000 xg i 10 min ved 20 ° C og bringe dem tilbake til deres karusellen stilling.
   2. Forbered gel-filtrering plater.
      1. Flytt ekvilibrert gel-filtrering plater fra karusellen til sentrifugen og sentrifugering ved 1000 xg i 2 min ved 20 ° C.
      2. Overfør gel-filtreringsplater fra sentrifugen til WTP 4-1 til 44.
      3. Flytt frisk gel-filtration samleplater fra CP (3-1 til 3-4) til WTP (5-1 til 5-4).
      4. Overfør likevekt gel-filtrering plater (WTP 4-1 til 4-4) for å friske solfangeren plater (5-1 til 5-4).
      5. Rydd opp arbeidsbordet unntatt posisjonene 5-1 og 5-2 og flytte posisjon 5-1 til posisjon 4-1.
   3. Forbered arbeidsbordet via RM å behandle filtratene.
      Merk: For trinn 1.5.3 til 1.6.3.5 systemet håndterer to plater i parallell og gjentar alle trinnene med de neste to plater.
      1. Flytt 50 mL tips fra karusellen (4-6 og 4-7) til WTP 3-3 og 3-4.
      2. Overfør filtrering platene fra CP 3-1 til 3-2 på arbeidsbordet (4-4 og 5-4).
      3. Flytte avvanningspressen (1: 100 fortynning) for påvisning av den glukoseforbruk fra CP 4-1 og 4-2 for å WTP 4-2 og 5-1.
      4. Flytt MTP for andre nedbør etter filtrering fra CP 8-1 og 8-2 til WTP 4-3 og 5-3.
      5. Løft filtrerings platene fra kollektorplatens (betalingsvillighet 4-4 og 5-4) og flytte dem til WTP 3-1 og 3-2.
   4. Forbered analytiske moduler etter filtrering. For å redusere forbruks, bruker samme tip-settet for trinn 1.5.4.1 og 1.5.4.3.
      1. Ta 50 ul spisser og pipettere en 10 ul alikvot av filtratet til avvanningspressen (1: 100 fortynning) i glukose-analysen (glukoseforbruk).
      2. Pipetter 35 ul av filtratet til sentrum av den ekvilibrerte gelfiltrering platen og 50 ul til MTP som brukes for utfelling.
      3. Gjenta trinn 1.5.4.1 til 1.5.4.2 for andre filtreringsplate.
      4. Flytt gel-filtrering platene til sentrifugen og flytte alle andre platene fra arbeidsbordet tilbake til utgangsposisjonene i karusellen.
      5. Gjenta trinn 1.5.3.1 til 1.5.4.4 for tredje og fjerde filtrering plate.
      6. Etter lagring av alle platene tilbake i karusellen legg merke til høyviskøse supernatanter, som indikert av restene i filterplaten (høy viscosity kontroll etter filtrering trinn). Mangel på filtratet kan føre til falske negative resultater i de følgende analytiske moduler.
6. Fjerning av glukose via 96-brønners Gel-filtrering (Oppgave 3 i figur 1)
   1. Sentrifuger gel-filtrering platene ved 1000 xg i 2 min ved 20 ° C.
   2. Forbered arbeidsbordet via robot manipulator å behandle gel-filtratene.
      1. Gi 50 mL tips fra karusellen (5-3 og 5-4) til WTP 3-3 og 3-4.
      2. For bestemmelse av den gjenværende glukose etter gelfiltrering flytte to MTPS fra CP 9-1 og 9-2 for å WTP 4-1 og 5-1.
      3. For fenol-svovelsyre metode flytte to MTPS fra CP 8-5 og 8-6 til WTP 4-2 og 5-2.
      4. Overfør to gel-filtrering plater fra sentrifugen til WTP (4-3 og 5-3).
      5. Løft gel-filtrering plater fra samleren plate (4-3 og 5-3) og flytte dem til WTP 3-1 og 3-2.
   3. Forbered arbeidsbordet via robot manipulator å behandle gel-filtratene.
      Merk: For å redusere forbruks, bruke samme tip-sett for trinn 1.6.3.1 og 1.6.3.2.
      1. For å registrere det gjenværende glukose etter gel-filtrering (1:10 fortynning) ta 50 mL tips og overføre 25 mL av DDH ₂ O (WTP 1-1) til en frisk MTP. Sug 20 ul av DDH ₂ O (WTP 1-1), 5 ul av luft og 5 pl av gel-filtrat og dispensere inn i den samme plate.
      2. For den fenol-svovelsyre-metoden-pipette 20 pl gel-filtrat til MTP.
      3. Gjenta trinn 1.6.3.1 og 1.6.3.2 for andre gel-filtrat plate.
      4. Overfør alle platene fra arbeidsbordet tilbake til utgangsposisjonene i sin karusell.
      5. Gjenta trinn 1.6.2.1 til 1.6.3.4 for tredje og fjerde gel-filtrering plate.
7. Glukose-analysemoduler
   1. Forbered arbeidsbordet via robot manipulator å utføre glukose-assi.
      1. Flytt DWP (1: 100 fortynning) fra CP 4-1 og 4-4 ​​til WTP 5-1 og 5-4.
      2. Flytt alle MTPS fra CP 9-5 og 9-8 til WTP 4-1 og 4-4.
      3. Ta 200 ul spisser og blande den fortynning ved aspirering og dispensering av ti ganger volum på 180 ul. Deretter pipettere en 50 ul alikvot av MTP.
      4. Gjenta trinn 1.7.1.2 og 1.7.1.3 for alle fire DWPs (1: 100 fortynning).
      5. Fjern alle DWPs (5-1 til 5-4) fra arbeidsbordet.
   2. Forbered arbeidsbordet for å starte glukose-analysen.
      1. For bestemmelse av den gjenværende glukose etter gelfiltrering overføre alle MTPS fra CP (9-1 til 9-4) for å WTP (5-1 til 5-4).
      2. Flytt glukose-analysekalibrering plate - som inneholder tre ganger 50 ul av de følgende glukosekonsentrasjoner (90, 45, 18, 9, 4,5, 1,8, 0,9, 0,45 og 0 mg / L) - fra CP 9-9 til WTP 3- 3.
      3. Ta 200 mL tips og aspirer 50 ul av glukose-assay reagens-mix fra WTP 1-2, for å starte den første analysen. Flytt MTPS inn i inkubatoren (30 ° C ved 150 rpm i 30 min).
      4. Sett tidsplan for å starte programmet med 5 min forsinkelse i mellom platene.
      5. Etter 30 min inkubering bevege platene fra inkubatoren til MTP-leseren og registrere absorpsjonen ved 418 og 480 nm.
      6. Etter målingen bevege platene til sin utgangsposisjon i karusellen.
8. Utarbeidelse av nedbør
   Bemerk: For å vurdere den EPS produksjon utføre en utfelling av supernatanten med 2-propanol før og etter den første filtreringstrinnet. Videre evaluere adsorpsjon av polymeren på filtermembranen ved observasjon av fibre og flak i den første, men ikke i det andre felle.
   Forsiktig: Håndter 2-propanol som en brennbar væske strengt under en avtrekkshette.
   1. Fjern alle nedbørs plater (CP 6-1 til 6-4 og 8-1 til 8-4) fra karusellen. og leggmanuelt 150 ul 2-propanol til hver brønn med en 12,5 ml flertrinns pipette.
   2. Dekk alle MTPS med en silikonhette matte og rist ved romtemperatur (RT) (10 min ved 900 rpm). Visuelt observere fiber eller flake formasjoner etter risting som indikerer EPS produksjon.
9. Fenol-svovelsyremetoden
   Forsiktig: Håndter konsentrert svovelsyre-syre og fenol under en avtrekkshette. Fenol er et etsende og mutagene agent.
   1. For den fenol-svovelsyre-metode, fjernes platene (CP 8-5 til 8-8) fra karusellen og plassere dem inn i væskehåndteringssystemet (posisjon 4 til 8). Omfatte kalibrerings plate med 20 ul av forskjellige glukosekonsentrasjoner (10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05; 0 g / l) i tre paralleller.
   2. Plasser en avfallsbeholder i posisjon 1, en ​​200 mL tips boksen i posisjon 2 og en 250 ml trau med 110 ml fenol-svovelsyre (tilberedes på isen with18.3 ml fenol 5% (w / v) i DDH ₂ O og 91,7 ml kons. sulfuric acid) i posisjon 3.
   3. Bruke en 8-kanal pipette med 300 mL tips og overfør 180 pl fenol-svovelsyre inn i hver rad av alle platene.
   4. Dekke alle MTPS med lokk, bland dem med rysting (5 min ved 900 rpm, RT) og inkubere dem i 35 minutter ved 80 ° C i en ovn for fargereaksjon. Etter avkjøling under en avtrekkshette, måle utryddelse på 480 nm.
10. Valg av EPS Positiv Supernatantene (Oppgave 4 i figur 1)
    1. For evaluering av EPS produksjon, velge disse stammer fra den automatiserte screening som oppfyller minst to av de tre kriteriene som positive (viskositet kontroll 2.6.1 og 2.6.2, påvisning av polymer 2.6.3, glukose tilsvar 2.6.5). Overfør de resterende filtrater fra de positive treff på en ny MTP for videre behandling.
       Merk: Når platene er dekket med en aluminium forseglingsfilmen de kan lagres ved -20 ° C i minst én uke. Innen den tid bestemmelsesjon av karbohydrat fingeravtrykk må utføres.

2. Karbohydrat Fingeravtrykk

Merk: Alle trinn for karbohydrat fingeravtrykk utføres manuelt.

1. Gelfiltrering av den positive Supernatanter (Oppgave 5 i figur 1)
   Merk: Gel-filtrering er nødvendig da det ikke er filtrat igjen fra den automatiserte screening. Gelfiltrering med et volum på mer enn 35 ul resulterer i redusert renseeffekt.
   1. Forbered ekvilibrering av de gel-filtreringsplater ved å dispensere 150 ul ammoniumacetatbuffer i alle brønner via en 12,5 ml flertrinns-pipette.
   2. Overfør gelfiltrering platen inn i sentrifugen (2000 xg i 2 minutter ved 20 ° C).
   3. Gjenta trinn 2.1.1, 2.1.2 og igjen 2.1.1. Sentrifuger gelfiltrering plate ved 1000 xg i 2 min ved 20 ° C før ytterligere bruk.
   4. Pipetter 35 mL av filtratet innmidten av gelfiltrering plate ved anvendelse av en 12-kanals 50 ul pipette.
   5. Sentrifuger gelfiltrering plate på 1000 xg i 2 min ved 20 ° C og deretter løfte den fra samleren plate.
   6. Forbered glukose-analysen før hydrolyse: Utfør en 1:10 fortynning ved å tilsette 45 mL av DDH ₂ O og 5 mL av gel-filtratet med en 12-kanals 50 pl pipette og dekke MTPS med silikon cap matte.
      Merk: For riktig bestemmelse av glukoseverdien av polymeren, måler glukoseinnholdet før hydrolyse og trekker den fra glukoseinnholdet kvantifisert etter hydrolysetrinnet.
   7. Fremstille pyruvat-analysen før hydrolyse: Utfør en 1:20 fortynning ved bruk av en 12-kanals 200 ul pipette for å legge til 95 mL av DDH ₂ O, transfer 5 pl gel-filtrat til hver brønn og forsegle MTP med en silikonhette matte .
2. 96-brønns mikroHydroLyse (Oppgave 6 i figur 1)
   Merk: Varm oppinkubasjonen ovn (inkludert en sand-bad) til 121 ° C i minst 1,5 timer før bruk. En spesiell kleminnretning ble utviklet for å forhindre fordampning under liten skalert hydrolysetrinnet.
   1. Ta en ny PCR-plate og overføre 20 ul gel-filtratet med en 12-kanals 50 ul pipette.
      Forsiktig: Trifluoreddiksyre er en etsende syre og giftig. Ammonium løsning er etsende. Håndtere både kjemikalier bare under en avtrekkshette.
   2. Tilsett 20 ul 4 M trifluoreddiksyre med en 1,25 ml flere trinn pipette til hver brønn. Deretter dekker PCR-plate med en termoplastisk elastomer (TPE) hette matte og sett PCR-platen i den spesielle klemanordningen.
   3. Blande oppløsningene via invertering av kleminnretningen ti ganger. Sett PCR-plate i en sentrifuge og sentrifugering ved 2000 xg i 2 minutter for å samle all væsken på bunnen. Sett PCR-platen tilbake til kleminnretningen og feste enheten med skruer.
   4. Plassersikret kleminnretning i den forvarmede sandbadet og inkuber i 90 min ved 121 ° C.
   5. Fjern klemanordning fra sandbadet og la det avkjøles til romtemperatur.
   6. Fjerne skruene og spinne igjen i en sentrifuge ved 2000 xg i 2 min for å samle all kondensat i bunnen av brønnene og for å forhindre kryssforurensning under fjerning av hetten matten.
   7. Legg 3,2% ammoniakkløsning for å justere pH til ca. 8 ved hjelp av en 12-kanals 200 ul pipette. Dekk til PCR-plate med en TPE cap matte og rist den manuelt ved hjelp av klemanordning.
   8. Etter nøytralisering sentrifuger PCR-platen ved 2000 x g i 2 min.
3. High-throughput-1-fenyl-3-metyl-5-pyrazolon (HT-PMP) -derivatization av karbohydratene (Oppgave 7 på figur 1)
   1. Overføre 25 ul av det nøytraliserte hydrolysat i en ny PCR-plate ved bruk av en 12-kanals 50 ul pipette.
      Merk: Etter å ha tatt delmengde, sjekk neutralization av den gjenværende væske i hydrolyseplaten via tilsetning av 12,5 ul fenolrødt indikator (0,05 g fenolrødt i 5 ml 20% etanol) med et 1,25 ml flertrinns-pipette. Alle brønner som ikke blir til rosa farge (pH 8) er ikke riktig derivatiseres.
   2. Legg 75 mL derivatisering reagens-blanding (125 mg PMP, 7 ml metanol, 3,06 ml DDH ₂ O, og 438 ul 3,2% ammonium-løsning) og dekke platen med en TPE-cap matte.
   3. Etter rysting av PCR-platen i kleminnretning sentrifuger platen ved 2000 xg i 2 min for å samle all væsken ved bunnen.
   4. For derivatisering sted PCR-plate i en PCR-cycler ved 70 ° C i 100 minutter, fulgt av avkjøling til 20 ° C.
   5. Overfør en 20 pl prøve inn i en ny MTP ved hjelp av en 12-kanals 50 ul pipette. Deretter kan du bruke en 12-kanals 200 mL pipette og tilsett 130 mL 19,23 mM eddiksyre (0,962 ml 1 M eddiksyre + 49.038 ml DDH ₂ O) til hver linje. Bland direkte via aspirating og utleverings (minst seks ganger) og overføre all væsken til et 0,2 um filterplate med en MTP kollektorplaten.
   6. Sentrifuger plate (1000 xg i 5 min), ta ut filteret plate, forsegle MTP med en silikonhette matte og plasser MTP inn i UHPLC-UV-ESI-MS for bestemmelse av karbohydrat fingeravtrykk ^14.
4. Klargjøring av glukose-analysen
   1. Utfør en 1:10 fortynning via tilsette 45 mL av DDH ₂ O og 5 mL av nøytralisert hydrolysat ved hjelp av en 12-kanals 50 pl pipette og dekke MTPS med silikon cap matte. Legg tre ganger 50 ul av forskjellige glukose standarder (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 og 0 uM) til en ny MTP brukes for kalibrering.
   2. Tilsett 50 ul av glukose-assay reagens-blanding (oppskrift step1.2.3) ved bruk av en 12-kanals 50 ul pipette. Da dekke platene med en silisium lokk matte og inkuber ved 30 ° C og 400 rpm i 30 minutter i en MTP-inkubator.
5. Fremstilling av pyruvat-analysen
   1. Utfør en 1:20 fortynning ved hjelp av en 12-kanals 200 mL pipette. Legg 95 mL av DDH ₂ O og overføre 5 mL av nøytralisert hydrolysat til hver brønn. Dekk MTP med en silikonhette matte.
   2. Tilsett 100 ul av pyruvat-assay reagens-blanding (3 ml 1 mM N - (karboksymetylamino-karbonyl) -4.4'-bis (dimetylamino) -diphenylamine natriumsalt (DA-64), 300 ul 10 mM tiamin-pyrofosfat, 60 pl 100 mM magnesiumklorid-heksahydrat, 2,4 ml 500 mM kaliumfosfat-puffer (pH 5,7), 30 pl 100 E pyruvat-oxidase, 12 pl 1000 U pepperrotperoksydase og 24,19 ml DDH ₂ O) ved anvendelse av en 12-kanals 200 ul pipette.
   3. Dekk platene med en silikonhette matte ennd inkuberes ved 37 ° C og 150 rpm i 30 min. Rett etter inkubasjon tiltaket absorbans i en MTP-leser ved 727 og 540 nm.
6. Evaluering av alle resultater av automatiserte Screening og karbohydrat fingeravtrykk.
   1. Legg merke til de prøvene som viser redusert sedimentering etter hovedkulturplater har blitt sentrifugert og lagret tilbake til karusellen (viskositet kontroll trinn 1.4.1). Prøver som ikke viser pellet dannelse er positive (kriterium 1 for automatisert screening).
   2. Legg merke til høyviskøse supernatantene, som er angitt av rester i filterplaten etter filtreringstrinnet (høy viskositet kontroll trinn 1.5.4.6). Mangel på filtratet kan føre til et falskt negativt resultat i de følgende analytiske moduler. Prøver som opprettholder kultursupernatanter i filter-brønner er positive (også kriterium 1 for automatisert screening).
   3. Visuelt observere fiber eller flak formasjon etter inkubasjon. Ta notater som thIS indikerer polysakkarider. Rangere ingen nedbør med (-); lav utfelling av fibrer eller flak med (+) og høy utfelling med (++). Videre detektere adsorpsjon av polymeren på filtermembranen via observasjon av fibre og flak i den første, men ikke i det andre felle (kriterium 2 for automatisert screening).
   4. Utføre en lineær kalibrerings for beregning av glukosekonsentrasjonen.
      
      Klikk her for å se en større versjon av denne ligningen.
   5. Utføre den lineære kalibrerings (absorpsjon i løpet av konsentrasjon) mellom 5 og 0,1 g / l glukose. Beregning av glukose tilsvarer de hydrolyserte polymerer og evaluere etter følgende parametre: glukose-ekvivalent:> 700 mg / L = positiv; 300-700 mg / L = antatte positive; <300 mg / L = negativ med hensyn på EPS formation (kriterium 3 for automatisert screening).
      
      Klikk her for å se en større versjon av denne ligningen.
   6. Kvantifisere alle karbohydrater bestemt med HT-PMP-metoden. Oppsummere alle mengder og evaluere som følger:> 300 mg / l (positiv); 150-300 mg / l (antatt positivt) og <150 mg / L (negativ).
   7. For beregning av pyruvat-konsentrasjonen utføre en lineær kalibrerings (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 og 0 uM). For å utelukke de rester pyruvat i supernatanten, korrigere pyruvat innhold etter hydrolyse via pyruvat innholdet før hydrolyse.
      
      Klikk her for å se en større versjon av denne equation.

Representative Results

Validering av fenol-svovelsyre-metoden viste gode resultater med en determinantkoeffisient (Ri) av 0,9998 (Tabell 2). For det 5 g / l konsentrasjon variasjonskoeffisienten (CV) og nøyaktigheten viste en god ytelse med 1,8% og 2,2% feil, men lavere ytelse på 0,25 g / l standard med 5,3% (CV) og 6,1% feil ( Partiskhet).

Koeffisientene til bestemmelse av både pyruvat-assay kalibreringskurver (med og uten matrise) var> 0,9999 i et kalibreringsområde på 150 pM (tabell 3). De variasjonskoeffisient (CV) for den høyeste og laveste kalibreringsnivået var <4,6% og nøyaktigheten viste en meget god ytelse over hele kalibreringsområdet med mindre enn 3,9% feil. Således matrisen fra hydrolysetrinnet viste ingen påvirkning på enzymatisk assay, som derfor i stand til å measure pyruvat før og etter hydrolyse.

Tabell 4 viser de detaljerte resultatene av tre eksempelvise nye stammer som med hell er identifisert med screening plattformen. Den venstre del av tabellen viser resultatene av de automatiserte screening modulene som gjelder viskositet i formasjonen, polymerproduksjon og glukosetilsvarende fra den totale hydrolyse som ble anvendt som vurderingsparametre for detaljerte karbohydratfingeravtrykkanalyse. Karbohydrat fingeravtrykk basert på kalibrerte sukker samt ukjente sukkere, dimerer og substituenter er gitt i den høyre del av tabellen. Ved bruk av denne informasjonen den monomere sammensetning kan beregnes og sammenlignes med allerede kjente polymerstrukturer. Videre kan en målrettet screening for interessante monomere blandinger og sjeldne karbohydrater utføres.

Den høye ytelsen til mikroskala hydrolyse og HT-PMP-derivatisering ble demonstrert i vårt tidligere arbeid ^14. Videre validering av gel-filtrering og karbohydrat-fingeravtrykk av forskjellige slekter, er beskrevet i en annen publikasjon ^6. I sum kan det screening plattformen med sin modulære struktur lett kan modifiseres og tilpasses individuelle krav til brukeren. Den automatiserte screening av plattformen gjør det mulig for en åtte ganger høyere gjennomstrømning og gir pålitelige resultater. Nye analysemetoder moduler som pyruvat-analysen kan integreres og i kombinasjon med karbohydrater fingeravtrykk analyse gir de svært detaljerte opplysninger om de identifiserte EPS. Dermed er det screening plattform avgjørende når du søker etter både litt modifisert og helt nye EPS varianter.

Figur 1: Samlet ordningen av modulære high-throughput exopolysaccharide screening plattform. Den automatiske screening omfatter de tre første oppgavene. Etter at bakterier er dyrket i 96-brønners plater, blir cellene fjernet ved sentrifugering (oppgave 1) og en 96-brønn filtrerings (oppgave 2). Deretter blir de gjenværende monomere sukkere fra vekstmediet fjernet via en 96-brønns gelfiltrering (oppgave 3). EPS inneholder prøvene blir vurdert i oppgave 4. karbohydrat fingeravtrykk av screening plattform inneholder de siste tre oppgaver. De resterende filtrer av de positive treff fra oppgave 2 gir grunnlag for gel-filtratet i oppgave 5. Etter hydrolysering i oppgave 6 karbohydrat fingeravtrykk kan analyseres via HT-PMP-metoden (høy gjennomstrømming 1-fenyl-3-metyl -5-pyrazolone, oppgave 7). Alle oppgavene er fulgt av ulike analytiske moduler og / eller en kontroll viskositet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Robot arbeidsbord oppsett for screening plattform utforminger av både flytende håndtering robot arbeidsbord vises. (A) robot flytende håndteringssystem og (B) væskehåndtering stasjon. (A) Oppsettet består av en mikrobærer med to posisjoner (posisjoner 1-1 til 1-2), en transportør for engangsspisser med fire posisjoner (posisjoner 2-1 til 2-4) og tre mikro bærere med fire posisjoner hver (posisjonene 3-1 til 3-4, 4-1 til 4-4 og 5-1 til 5-4). I tillegg er det et lagrings karusell med fem hotell bærere (1 til 5) som hver for syv dype brønnplater (DWP) og fire hotell transportører (6-9) som hver er beregnet for 21 mikro-titer-plater. Maskinvare som er installert på væskehåndtering roboten er en 96-kanals-pipette-arm for bruk med engangsspisser og en robot manipulator (RM) som beveger platene / utstyr between arbeidsbordet, lagring karusell, MTP-leser, sentrifugen og riste-inkubator. (B) Den væskehåndtering Stasjonen er utstyrt med en væskehåndtering arm og en 8-kanals 300 mL pipette, en avfallsbeholder i posisjon 1, et tips adapter med 300 mL tips (posisjon 2), en høyde adapter 30 med en 250 ml trau (stilling 3) og fem høyde adapter 60 for MTPS (posisjon 4 til 8). Nummereringen av stillingene er referert til i denne protokollen. Alternative arbeidsbord kan også brukes hvis det er tilsvarende oppsett tilgjengelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Pyruvat innhold av 16 kommersielt tilgjengelige polymerer som bestemt via pyruvat-assay. Etter at 1 g / l polymeroppløsnings ble hydrolysert og nøytralisert, ble pyruvat-analysen utføres fra en 1:10 fortynning (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Flytskjema av den modulære high-throughput screening plattform. Det automatiserte screeningssystem, som kombinerer ulike polysakkarid-deteksjonsmoduler: analyse av viskositet i formasjonen, polymerfremstilling og bestemmelse av det totale karbohydratinnhold. Den andre delen gir en detaljert monosakkarid analyse for alle de valgte EPS produsenter identifisert i den første delen. Alle data fra den automatiserte screening og data fra karbohydrat fingeravtrykk via UHPLC-ESI-MS er samlet i en database og gjøre det mulig for enkel identifisering av strukturelt beslektede varianter av ALReady kjent EPS eller nye EPS og derfor en målrettet screening. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hoved skritt / Analytisk modulen	arbeidsflyt	Observasjon / Beskrivelse
Dyrking av stammene	1 ml EPS-medium en Pre-kulturen 48 timer, 30 ° C, 1000 rpm et Hoved-kulturen 48 timer, 30 ° C, 1000 rpm et	Produksjon av EPS
Cell fjerning / viskositet	Sentrifugering: 30 min ved 4300 xg	Ingen pellet = økt viskositet = positiv
Påvisning av Polymer: Nedbør	50 pl supernatant + 150 ul 2-propanol b Risting 10 min ved RT og 900 rpm b	Visuelle: Fiber og flak = positiv utfelling av polymer
Cell fjerning / høy viskositet	180 mikroliter supernatant av hoved-kultur Sentrifugering: 10 minutter ved 3000 xg 1,0 mikrometer glassfibermembran	Ingen filter bestått = høy viskositet = positiv
Påvisning av Polymer: Nedbør	50 ul filtrat + 150 ul 2-propanol b Risting 10 min ved RT og 900 rpm b	Visuelle: Fiber og flak = positiv utfelling av polymer
Glukose forbruk: Glukose-analyse	Fortynning 1: 100: 10 mikroliter filtrat + 990 mL DDH 2 O 50 mL delmengde + 50 pl Reagent-mix Inkubasjon 30 min ved 30 ° C 150 rpm Måling 418-480 nm	Gjenværende glukose etter dyrking
Gelfiltrering	likevekt: 3 x 150 mL NH 4 -acetat buffer pH 5,6 2 x 2 minutter ved 2000 xg 1 x 2 minutter ved 1000 xg Gelfiltrering: 35 ul filtrat, 2 minutter ved 1000 xg vasking: 3 x 150 mL DDH 2 O, 2 minutter ved 2000 xg 75 ul 20% etanol for oppbevaring	Polymer rensing: Fjerning av salter, pyruvat, glukose og andre sukker monomerer fra dyrking supernatant
Gjenværende glukose etter gelfiltrering Glukose-analyse	Fortynning 01:10: 25 mL DDH 2 O + 20 mL DDH 2 O og 5 mL filtratet + 50 ul reagens-mix Måling 418-480 nm	Subtraksjon av gjenværende glukose etter gel-filtrering fra fenol-svovelsyre-metoden
Glukose tilsvarende: Fenol-svovelsyre-metoden c	20 pl gel-filtrat + 180 pl fenol-svovelsyre-eddiksyre (30 ul 5% (vekt / volum) fenol i DDH 2 O + 150 pl kons. H SO 2 4 (ρ = 1,84 g / ml)) Risting 5 min ved 900 rpm Inkubasjon 35 min ved 80 ° C Måling ved 480 nm	Glukose tilsvarende: Δ (fenol-svovelsyre-verdi - værende glukose etter gelfiltrering) <300 mg / L negativ > 300 og <700 mg / l antatte positive > 700 mg / l positiv
en Håndtert manuelt under sterile forhold (LAF).
b Brennbar væske håndteres manuelt under en avtrekkshette.
c Fenol-svovelsyre håndteres med Brand Væskehåndtering Station (LHS) under en avtrekkshette.

Tabell 1:. Komplett arbeidsflyten av automatiserte prescreening med robot flytende håndteringssystem og væskehåndtering stasjonen Oversikt over alle parametre for automatiserte analysemoduler.

linearitet			LOD	LOQ
Ri en	Slope en	Offset et	mg / l	mg / l
0,9998	0,0007	-0,021	50	100
Standard		Mean b	Precision b	nøyaktighet b
mg / l		mg / l	CV%	Bias (% feil)
5000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
en Gjennomsnitt av åtte målinger, kalibrering med seks nivåer glukose fra 0,1 til 5 g / l
b Utføres med en t-test (α = 0.05, n = 8).
LOD: grense på besluttsomhet, LOQ: kvantifiseringsgrensen, CV: variasjonskoeffisient.

Tabell 2:Validering av fenol-svovelsyre-metoden ble utført med flytende håndteringsstasjonen. Linearitet ble beregnet på grunnlag av en seks-punkts kalibrering (n = 8). Mean, presisjon og nøyaktighet på to exemplarily valgt glukosekonsentrasjoner er gitt her.

	linearitet			LOQ
	Ri en	Slope en	Offset et	iM
uten matrix	0,99999	0,0223	-0,0019	1
01:10 utvannet matrise	0,99999	0,0221	-0,0011	1
	Standard	Mean b	Precision b	nøyaktighet b
	iM	iM	CV%	Bias (% feil)
uten matrix	50	49.96	3.05	-0,09
	1	1,04	2,95	3,86
01:10 utvannet matrise	50	49.98	0,44	-0,04
	1	1.00	4,58	0,33
en Gjennomsnitt av tre målinger, kalibrering med seks konsentrasjoner av pyruvat fra 1 til 50 uM.
b (n = 3)
LOQ: kvantifiseringsgrensen CV: variasjonskoeffisient.

Tabell 3:. Validering av pyruvat-analysen med og uten en 1:10 fortynnet nøytralisert trifluoreddik-syre-matrise To seks punkts kalibrering (n = 3) med og uten evaluering av matriks-påvirkninger ble utført. Mean, presisjon og nøyaktighet av to som eksempel valgte pyruvat konsentrasjoner med og uten virkningene av en 1:10 fortynning ble beregnet.

Tabell 4:.. Resultater av tre eksemplariske stammer screenet med plattformen Data som samles inn fra den automatiserte screening og karbohydrat fingeravtrykk Vennligst cslikke her for å laste ned denne tabellen som en Microsoft Excel-fil.

karbohydrat	Absorpsjon max [nm]	Absorpsjon ved 480 nm gjennomsnittlig ± SD		Absorbans i forhold til glukose [%]
Diutan tannkjøtt	470	0,342	± 0,010	187
gellangummi	472	0,334	± 0,002	183
guar gum	478	0,387	± 0,017	212
Gummi arabicum	476	0,393	± 0,034	215
Hyaluronsyre	484	0,231	± 0,011	126
kayaragummi	478	0,455	± 0,023	249
Konjac tannkjøtt	480	0,297	± 0,009	163
lerk tannkjøtt	480	0,337	± 0,032	185
Johannesbrødgummi	478	0,354	± 0,033	194
skleroglukan	484	0.168	± 0010	92
suksinoglykan	482	0.168	± 0,005	92
Tara tannkjøtt	480	0.318	± 0,016	174
tragant	478	0,513	± 0,003	281
welangummi	472	0,226	± 0,016	124
Xylan 472	0,567	± 0,007	311
Xantangummi	482	0.245	± 0,021	134
glukose	484	0,191	± 0,014	100
SD: standardavvik

Tabell 5:. Resultatene som oppnås med fenol-svovelsyre-metoden for 16 kommersielt tilgjengelige polymerene og glukose Den absorpsjonsmaksimum og absorpsjonen ved 480 nm av 16 kommersielt tilgjengelige polymerene (1 g / l), så vel som glukose (1 g / l ) ble målt anvendelse av fenol-svovelsyre-metoden. Absorbansen i forhold til glukose av alle de polymerer som ble beregnet.

	Standard	Mener	Precision en	nøyaktighet en
	mg / l	mg / l	CV%	Bias (% feil)
1:10 fortynning	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1,41	-0,70
1: 100-fortynning	4500	5026	1,19	11.6
	450	471	1.16	4,55
b Utføres med en t-test (α = 0.05, n = 8).
CV: variasjonskoeffisient.

Tabell 6:. Validering av den automatiserte fortynning for glukosebestemmelse fortynning for glukose-assay etter dyrking (1: 100) og etter gelfiltrering (01:10) ble validert. To glukosekonsentrasjoner (n = 8) ble fortynnet med en væskehåndteringssystemet og evaluert. Mean, presisjon og nøyaktighet ble beregnet.

Teoretisk glukoseverdi	Dekket med silikon cap matte			Test av fordampning (udekket)
	bety en	Precision en	nøyaktighet en	bety en	Precision en	Nøyaktighet en </ Strong>	fordampning
mg / l	mg / l	CV%	Bias (% feil)	mg / l	CV%	Bias (% feil)	%feil
45,0	45.2	0.69	0,44	46,0	0,66	2.05	1,60
18,0	17.7	0,80	-1,68	18,0	0,72	-0,01	1.69
9.0	8,74	1,20	-2,98	8,92	0,81	-0,95	2,09
4.5	4,50	1,26	-0,04	4,58	1,57	1.76	1,80
1.8	1,85	0,74	2,90	2.01	2,82	11.6	8,48
0.9	1,03	1,43	14.1	1.16	3,52	28.3	12.4
en (n = 4)
CV: variasjonskoeffisient.

Tabell 7:. Evaluering av effekten av fordampning dekket og åpne MTP Seks forskjellige glukosestandarder (n = 4) ble lagret i karusellen i 3,5 time ved romtemperatur. Effekten av fordampning ble evaluert ved å benytte avdekket samt dekket (silisium matte) standard prøver. Mean, presisjon, nøyaktighet og fordampningen i% feil ble beregnet.

Før gel-filtrering <td> 25,1

	Etter gelfiltrering		Gjenværende glukose etter gelfiltrering
	bety en	SD en		bety en	SD en
	mg / l	mg / l	mg / l	mg / l	%
1	8647	110	259	121	3,00
2	5108	56	116	37	2,27
3	2014	12	50,8	14	2,52
4	1015	12	8.1	2,47
5	510	4.9	12.8	4.3	2,51
6	223	8.6	6.6	1.5	2,94
7	122	5.6	4.3	0.9	3,48
8	75	6.0	3.1	0.3	4.18
en (n = 8)
SD: standardavvik

Tabell 8:. Resultater av den gel-filtreringseffektivitet Åtte forskjellige glukose standarder ble bestemt før og etter gelfiltrering for å vurdere effektiviteten av gel-filtrering. Gjennomsnitt, standardavvik og gjenværende glukose etter gelfiltrering i% ble beregnet.

Discussion

Polysakkarid deteksjon med fenol-svovelsyre-metoden: forskjellige monosakkarider vis forskjellig absorpsjonsmaksima og molare ekstinksjonskoeffisienter ved bruk av denne metoden ^9. Dette resulterer i forskjellig absorpsjonsmaksima av polymerer, som inneholder flere sukker i forskjellige mengder. De forskjellige bølgelengder av absorpsjonsmaksima for 16 forskjellige kommersielt tilgjengelige polymerer er gitt i tabell 5. Polymerene ble oppløst (1 g / l) i DDH ₂ O, omrørt (150 opm) over natten og målt med fenol-svovelsyre-syre-metoden . Diutan tyggegummi viste den laveste absorpsjonsmaksima ved 470 nm og skleroglukan og hyaluronsyre det høyeste på 484 nm. Basert på disse resultatene 480 nm ble valgt for screening plattformen. Den relative absorbans av polymerene ble beregnet ut fra absorbansen oppnådd med 1 g / l glukose (angitt som 100%). De laveste resultater ble oppnådd med skleroglukan og suksinoglykan, begge med 92%. Dette var expected fordi skleroglukan bare inneholder glukose og suksinoglykan inneholder glukose og galaktose i et forhold på 7: 1. Både kommersielle polymerer som har forskjellige tapene av tørking og forskjellige askeinnhold, er dette grunnen til at den teoretiske verdien av ~ 110% ikke ble nådd. Xylan viste den høyeste relative absorbans med 311%. Grunnen til dette er den høye molare ekstinksjonskoeffisient oppnådd fra xylose på grunn av den mer dominerende furanose form. Ved et nivå på 0,1 g / l glukose kvantifisering grensen ble nådd, samt påvisningsgrensen i en konsentrasjon på <0,05 g / l. Imidlertid er deteksjonsgrensen for positive spenninger i screening høyere enn 0,7 g / l, og derfor analysen viste en god ytelse. For å få pålitelige resultater, ble den gjenværende glukose etter gelfiltrering bestemt med et glukose-assay, og denne verdi ble subtrahert fra verdien fra fenol-svovelsyre-metoden.

Automatisert glukose-analysen fortynning: Forestillingenav glukosebestemmelsen etter dyrking (fortynning 1: 100) ble undersøkt. For dette ble 10 ul av supernatanten overført til 990 mL av DDH ₂ O i en dyp brønn plate og blandes via ti ganger suger og dispensering 180 ul av denne fortynningen. Den andre kritiske trinnet var den korrekte pipettering av bare 5 ul alikvot for 1:10 fortynning fra glukose-assay etter gelfiltrering. For å generere den fortynning 25 ul av DDH ₂ O ble overført til en 50 mL-tuppen først ble etterpå 20 pl av DDH ₂ O og 5 pl gel-filtrat suges sammen. Dette sikrer en bedre fjerning av 5 ul delmengde ut av spissen. Begge fortynningstrinn ble verifisert med forskjellige glukose standarder via en glukose-assay. Resultatene for to eksempelvise konsentrasjoner er gitt i tabell 6. 1: 100 fortynning for bestemmelse av glukoseinnholdet etter kultivering viste høy presisjon for begge standarder med en CV & #60; 1,2%. På samme tid, er nøyaktigheten for den høyere standard var opp til 11,6 (% feil). Dette er imidlertid ubetydelig som glukosebestemmelsen bare representerer den gjenværende glukoseinnholdet etter dyrking og derfor er ikke viktig for polymeren deteksjon. Den 1:10 fortynning av den gjenværende glukose etter gelfiltrering viste svært pålitelige resultater med en CV <1,4% og en nøyaktighet <2,1% feil.

Vurdering av fordampning: The screening krever 3,5 time fra første trinn til den første glukose-analysen. For å finne ut, om denne tidsrammen har en innflytelse på uncapped MTP lagring, ble 50 ul av glukose-analysen kalibreringsstandarder lagret med og uten deksel i 3,5 timer i robot karusellen. I kalibreringsområdet (45 til 4,5 mg / L) neppe øket prøvekonsentrasjon. En økning - forårsaket av fordampning - var under 2,1% og bare for de to laveste konsentrasjoner (1,8 og 0,9 mg / L) den nådde opp til 12,4% (

Gelfiltrering: Høye mengder av ikke-metabolisert glukose forstyrre den kvantitative påvisning av glukose fra den hydrolyserte polymer. Derfor ble en gel-filtreringstrinn som kreves for å fjerne gjenværende glukose etter dyrking. Dessuten renser gelfiltrering polymeren inneholdende supernatant fra salter og monomere karbohydratforbindelser, andre enn glukose, for å minimalisere den analytiske bakgrunn i monomeren analysen. Ved gel-filtreringstrinnet 35 ul av filtratet ble plassert i sentrum av brønnen. For validering av robustheten gel-filtrering i automatisert system, ble åtte kalibreringsstandarder fra 0.045 og opp til 9 g / l glukose filtrert (n = 8). Glukose av hver konsentrasjon ble alltid redusert med mer enn 95% av den opprinnelige verdien (tabell 8). Ved å gjøre dette, viste gelfiltrering meget gode resultater for forskjellige konsentrasjoner av glukose. I tillegg er de gjenværende glukose etter gel-filtration ble også bestemt med en glukose-analyse og trekkes fra fenol-svovelsyre-bestemmelse for å motta den korrekte mengden av glukose tilsvarende for den hydrolyserte polymer.

Pyruvat-analyse: For det første ble det undersøkt hvorvidt det nøytralisert og fortynnet (1:10) TFA-matrise fra hydrolysetrinnet forstyrrer den enzymatiske reaksjon. Derfor ble fullstendig assay utført to ganger, en gang med og en gang uten matrise og viste pålitelige resultater. Til slutt, pyruvat innhold av 16 kommersielt tilgjengelige polymerer som ble vellykket målt og er vist i figur 3. Det er generelt kjent at av disse 16 polymerer bare suksinoglykan og xanthan naturlig inneholder pyruvat. Med vår pyruvat-assay begge disse polymerer ble korrekt identifisert. I skleroglukan ble welangummi og xylan pyruvat også påvist i betydelige mengder. Overall, evnen til tilnærmingen ble validert og pyruvat-analysen showed en høy ytelse. Det viste seg å være i stand til å detektere pyruvat i forskjellige polymerer som etter hydrolyse.

Karbohydrat fingeravtrykk: Etter å ha utført alle analytiske moduler i automatisert screening, ble potensielle EPS produsenter valgt for karbohydrat fingeravtrykk analyse. For dette ble flere kriterier anvendt: 1) Positiv observasjon av viskositeten etter sentrifugering og / eller etter filtrering. 2) Utfelling før og etter filtreringen. Observerte fibre og flak ble vurdert som positive. 3) glukose tilsvarende verdi fra fenol-svovelsyre-metoden. Verdier> 700 mg / L ble vurdert som positive og verdier mellom 300 og 700 mg / L ble vurdert som mulige EPS produsenter. Når to eller tre kriterier ble vurdert som positive, ble stammene valgt for ytterligere karbohydrat fingeravtrykk analyse. Kriteriene kan tilpasses til den enkelte formål EPS screening (f.eks lav viskositet EPS). Vår tilnærming som tar sikte på å finne efficient EPS produsenter. Ved søk for stammer som bare danner små mengder av EPS evalueringen grense av glukosen tilsvarende bør reduseres.

Teknisk nytte og fremtidige applikasjoner: Et interessant trekk ved denne protokollen er den modulære karakter av trinnene og de ulike analytiske moduler. De kan kombineres på forskjellige måter, justert til individuelle behov og nye moduler kan lett implementeres. Videre kan analysemoduler brukes separat, for eksempel hydrolyse modul i kombinasjon med HT-PMP-derivatisering modul er i stand til å utføre en monomer komposisjon analyse fra forskjellige polymeroppløsninger (1 g / l) i 96-brønners format. For laboratorier uten å ha tilgang til et flytende håndteringssystem fullstendig screening kan håndteres manuelt uten noen endringer i pipettering ordningen. Men ved hjelp av en flytende håndteringssystem øker gjennomstrømningen til opp til 768 stammer (i stedet for 192 stammer hvis screened manuelt) per dag. Protokollen som er beskrevet her er i stand til en screening for ulike slekter og derfor for screening av store belastningsskader samlinger for å identifisere nye EPS produsenter og analysere deres karbohydrat fingeravtrykk i en tilnærming (figur 4). Videre kan en målrettet screening for polysakkarider inneholdende sjeldne sukkere som fukose, uronsyrer eller enda ukjente sukkere utføres via den detaljerte monosakkarid analyse. Dessuten kan forskjellige sukkerkombinasjoner i definerte forhold mellom bli detektert. Dette muliggjør enkel identifisering av strukturelt beslektede varianter av allerede kjente EPS eller nye EPS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2