Introduction
בשנת 2006, גישה חדשנית תוארה לתכנת מחדש תאים סומטיים למצב pluripotent. לאחר prescreening של מערך של תכנות מחדש פוטנציאל גורמי fibroblasts עכברי יכולים להיות מומר בהצלחה למה שנקרא בתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) על ידי התמרה וביטוי יתר של ארבעה גורמי שעתוק retroviral (Oct4, Sox2, Klf4, ג-Myc) 1. בהמשך טכניקה זו יעילה שוחזרה באמצעות תאים סומטיים של מיני יונקים שונים כולל בני אדם 2, 3 קופים, חולדות 4, 5 כלבים, כבשים וחזירים 6 7. בנוסף, שונו השמטת פרוטוקולים או החלפת גורם שעתוק הפוטנציאלי שעור C- MYC פורסמו 8, 9.
ללא קשר לתכנות מחדש הראשוני להתקרב pluripotency האמיתי של מושבות גדלו יש לקבל אישור, משימה מפרכת וזמן רב. חסרון עיקרישל רוב הניתוחים אלו הוא שהם לא יכולים להתבצע על תאי חיים. גורמי pluripotency הוקמו כגון Oct4, Sox2, NANOG או REX1 מייצגים גורמי שעתוק ממוקמים בגרעין וזיהוי שלהם דורש קיבוע של התאים לפני אימונוהיסטוכימיה או תמוגה תא לניתוח RT-PCR 10 -. 12 מכאן ואילך, תאים אלה הולכים לאיבוד לעתיד ניסויים הדורשים תרבויות לשכפל של כל מושבה.
לפיכך, טכנולוגיה לנתח pluripotency בתאים חיים רצויה מאוד. אכן יכולים להתבצע במספר גישות ישירות על תאי חיים באמצעות נוגדנים המכוונים נגד אנטיגנים המבוסס על קרום (למשל. TRA-1-60, SSEA4) 12, ניאון דיווחו צבעים כדי לזהות מולקולות phosphatase 13 או קטן אלקליין שדווקא תווית גזע עוברי (ES) ותאי iPS 14. עם זאת, הנוגדנים עשויים בכל זאת להשפיע לרעה על התאים וכל ספידOD מוגבל לסמן pluripotency יחיד. לבסוף, משואות מולקולריות ניאון, oligonucleotides הכפול antisense עם מבני סיכת ראש, המאפשרים צביעת חיות של תאים, תוארו 15. למרות שגישה זו עשויה להיות מיושמת על גנים רבים, הטכניקה דורשת nucleofection של השעיה תא בודדת, אשר אינה חל על מושבות iPS גוברת.
לפני כמה שנות חלקיקי גן ספציפי תוארו לנתח ביטוי Survivin בתאי סרטן השד האנושיים SKBR3 16. כתב יד זה מתאר גישה חדשנית לגילוי רומן סמני pluripotency בES החי ותאי iPS באמצעות ננו-חלקיקי זהב conjugates. חלקיקים אלה כוללים חלקיקי זהב מרכזיים עם גדיל ללכוד יחד נושא את רצף RNA המשלים וגדיל כתב שכותרתו Cy3. אות הניאון של גדיל הכתב הוא הרווה ידי חלקיקי הזהב המרכזיים. בנוסף, מתאיםחלקיקים לשמש בקרות שליליות וחיוביות כ, בהתאמה (איור 1). ליישום חלקיקים פשוט הוסיפו למדיום התרבות (איור 2) ולהזין את התאים באמצעות אנדוציטוזה (איור 3). אם RNA היעד מתבטא זה מחליף את גדיל הכתב אשר לאחר מכן פולט אות ניאון. שיטה זו אינה דורשת מניפולציה של תא המטרה והביטוי של גן המטרה יכולה להיות במעקב אופטי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות בתאים חיים. יתר על כן, הטכנולוגיה יכולה להיות מיושמת על כל גן מטרה רצוי בין מינים במקרה של תאי iPS וכך יכולה להיות מועסק בתחומי מחקר רבים ושונים. לבסוף, זרימת cytometric מנתח לאפשר זיהוי והעשרה של תאים חיוביים Cy3.
Protocol
1. הכנת מדיה, ריאגנטים ותא תנאי תרבות
- 293 תאי כליה עובריים האנושי HEK
- תרבות HEK 293 תאים (CRL-1573, ATCC) במדיום של DMEM / חם F-12 בתוספת 5 FCS%, L- גלוטמין (2 מ"מ), ופניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר).
- למעבר התאים, לשטוף תאי פעם עם PBS, להוסיף 0.05% טריפסין / EDTA ודגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. העברת תאים לתוך שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל"ד (300 x ז) ולהעביר כ 5x10 5 תאים לבקבוק תרבות T25 טרי.
- fibroblasts העוברי Murine (MEFs)
- הוסף 1 מיליליטר של פתרון ג'לטין 0.1% עד 6-בארות בודדות ודגירה בטמפרטורת חדר (RT) במשך שעה 1. נוזל לשאוב ולאחסן ב RT עד לשימוש.
- תרבות MEFs DMEM בתוספת 10% FCS, L- גלוטמין (2 מ"מ), L-גלוקוז (4.5 גר '/ ליטר), פירובט נתרן (1 מ"מ), ופניצילין (100 U /מיליליטר) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) על 6 צלחות גם ג'לטין מצופה.
- להפיץ MEFs לתוך 6-גם צלחות ולתת להם לגדול עד מפגש. להוסיף mitomycin (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 2.5 שעות לעצור תאים. בינוני לשאוב, לשטוף תאי פעמיים עם מדיום MEF מלא ולהוסיף 3 מיליליטר בינוני MEF לכל 6 היטב. תאים אלו משמשים כמזין-שכבה של תאים בעכברים וiPS חזירי.
- תרבות של ES עכברי ותאי iPS
- כדי להכין עכבר בינוני תרבות ES, להשלים DMEM בינוני עם FCS 15%, L- גלוטמין (2 מ"מ), L-גלוקוז (4.5 גר '/ ליטר), חומצות ממ שאינן חיוניים אמינו (1X), β-mercaptoethanol (0.1 מ"מ) וגורם מעכב לוקמיה (1.000 U / ml).
- לשטוף 6-בארות עם MEFs-נעצר צמיחה פעם עם הסרום ללא DMEM, להוסיף עכבר בינוני ES 2 מיליליטר ותאי iPS עכברי (20% מהתאים של צלחת ומחוברות). כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם הסרום ללא DMEM ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני ES עכבר טרי.
- למעבר התאים, לשטוף היטב כל פעם עם הסרום ללא DMEM, להוסיף 0.25% טריפסין / EDTA ודגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. העברת תאים לתוך שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל"ד (300 x ז), תאים גלולים במדיום ES עכבר 500 μl ולהוסיף מההשעיה 100 μl למדיום ES עכבר 2 מ"ל בטרי 6-גם עם מזין שכבת MEF.
- תרבות של חזיר שב"ס תאים
- להכין מדיום iPS חזיר, להשלים של DMEM / חם F-12 בינוני עם 20% בסרום בנוקאאוט, L- גלוטמין (2 מ"מ), חומצות ממ שאינן חיוניים אמינו (1X), β-mercaptoethanol (0.1 מ"מ), ופניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר). סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 3 שבועות. עם השימוש ראשון, להוסיף bFGF (10 ng / ריכוז סופי מיליליטר).
- לשטוף 6-בארות עם MEFs-נעצר צמיחה פעם אחת עם תאי iPS סרום ללא DMEM / F-12 ולהוסיף 1.5 מיליליטר החזיר הבינוני iPS של בשר חזיר והחזירי (10% מהתאים של צלחת ומחוברות). כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם הסרום ללא DMEM / F-1 של בשר חזיר2 ולהוסיף 1.5 מיליליטר בינוני iPS חזיר טרי.
- כדי להכין חיץ ניתוק להוסיף טריפסין 2.5%, IV collagenase (10 מ"ג / מיליליטר), סרום בנוקאאוט (20%) וCaCl 2 (1 מ"מ) לCa 2 + -חינם PBS. לשטוף את תאי פעמיים עם PBS ו דגירה עם חיץ ניתוק במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. העברת תאים לתוך שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל"ד (300 x ז).
- Resuspend תאי iPS חזירי ב500 μl הבינוני iPS חזיר טרי ולהוסיף 50 μl של ההשעיה ל -1.5 בינוני iPS מיליליטר חזיר בטרי 6-גם עם מזין שכבת MEF. כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם סרום ללא DMEM / חזיר טרי בינוני iPS F-12 ולהוסיף 1.5 מיליליטר של בשר חזיר.
- תרבות חופשית מזין של תאי iPS אדם
- להפשיר את הבקבוקון המקורי המכיל את הכנת קרום במרתף על 4 מעלות צלזיוס ולדלל עם סרום ללא DMEM קר כקרח / F-12 8 מ"ג / מיליליטר, aliquot והחנות של בשר חזיר ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
- להפשיר aliquot של הבסיסהכנת ment קרום על 4 מעלות צלזיוס ולדלל עם DMEM F12 קר כקרח סרום ללא / של בשר חזיר (90 מיקרוגרם / מיליליטר). Pipet 1 מיליליטר של פתרון זה לתרבות מנות 3 סנטימטר ומערבולת בעדינות על מנת להבטיח שכל פני השטח מכוסים. לאטום מנות עם parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. לפני השימוש לתרבית תאי דגירה מנות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס או 3 שעות על RT כדי לאפשר פילמור של הכנת הקרום במרתף.
- בינוני לשאוב ממאכלים מצופים בהכנת הקרום במרתף ולשטוף פעמיים עם הסרום ללא DMEM / של בשר חזיר F-12. להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני E8 למנה התרבות ותאי iPS אדם (10% מהתאים של צלחת ומחוברות). כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם סרום ללא DMEM / F-12 ולהוסיף 1.5 מיליליטר בינוני E8 הטרי של בשר חזיר.
- למעבר התאים, לשטוף כלים פעמיים עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר PBS / 0.5 mM EDTA. דגירה המנות במשך 5 דקות על RT. צג התאים תחת מיקרוסקופ. הערה: כאשר המושבות מתחילות לאסוף וappear יש חורים הם מוכנים להעברה.
- לשאוב את הנוזל, להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני E8 ולנתק תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. העברת תאי שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל"ד (300 x ז), גלול במדיום E8 500 μl ולהוסיף 50 μl של ההשעיה 1.5 מיליליטר בינוני E8 בצלחת תרבות טרי מצופות בהכנת הקרום במרתף .
2. עיצוב של יעד-רצפים בין מינים גבולות
- אדם בחר התייחסות, עכברי ורצפי cDNA חזירי של גני המטרה (GAPDH, NANOG, GDF3) ולבצע ניתוח יישור מרובה רצף CLUSTAL.
הערה: זה יציין הרצפים הומולוגיים בין מינים.- השתמש בהגדרות הבאות ליישור מרובה: עונש פער (קבוע) 10, עונש פער (משתנה) 5, שקלול מעבר 0, מגוון עונש הפרדת פער 8, זהות% לעיכוב 40, מספר מרבי של חזרות כדי לבצע 3.
- שלח רצפי יעד רצויים ליצרן (ראה טבלה של חומרים) לעיצוב בדיקה וייצור.
הערה: היצרן לאחר מכן לאשר תאימות של רצף רצוי עם הטכנולוגיה. אם רצף רצוי אינו תואם, היצרן יציע רצפים אלטרנטיביים.- ודא שאזורים הומולוגיים שיכול לשמש כיש רצפי גדיל ללכוד פוטנציאל אורך של 27 נ"ב.
הערה: מומלץ להזמין כמה חלקיקים עם גדילי לכידה שונים לגן מטרה נבחרת כמו שרק הניסוי הסלולרי האמיתי ייתן הוכחה מובהקת של הפונקציונליות של רצף בודד. לכן, שני רצפים שונים לGAPDH וGDF3 הוערכו תוך שלושה חלקיקים שונים נבדקו להעריך ביטוי NANOG. מיקומם והרצפים המדויקים כבר פורסמו במקומות אחרים 17. היצרן מסחרי מייצר nanopמאמרים עם רצפים רצויים ומספק אותם בפורמט lyophilized.
- ודא שאזורים הומולוגיים שיכול לשמש כיש רצפי גדיל ללכוד פוטנציאל אורך של 27 נ"ב.
3. הכינון מחדש של חלקיקים ותוספת לתא תרבויות
- אחסן חלקיקי lyophilized עם קבלה על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- מחדש חלקיקים על ידי תוספת של מים מזוקקים כפולים 50 μl אשר נותנת ריכוז סופי של 100 ננומטר. ברגע מחדש חלקיקי חנות ב RT בחושך. שים לב: במצב זה הם יציבים לשנה אחת לפחות. אחסון של דגימות מחדש על 4 מעלות צלזיוס עלול להשפיע לרעה על יציבותם.
- טרום לדלל את פתרון מניות ננו-חלקיקים עם PBS לריכוז של 2 (HEK 293 תאים) או 8 ננומטר (iPS ותאי גזע עובריים) ביום היישום. הערה: ריכוז זה הוא פי 20 גבוהים מהריכוז הסופי בצלחת התרבות. בתאי גזע עובריים ותאי iPS, 400 בערב של חלקיקים מושרה אות ניאון לזיהוי בקלות מתחת למיקרוסקופ. לתאי HEK 293, AConcentration של 100 PM מספיק.
- μl Pipet 12.5 של חלקיקי prediluted למדיום תרבות תא שלם 237.5 μl 24 גם מכיל. לבארות בגדלים שונים, להתאים את הכמויות בהתאם. מערבולת הצלחת בקפידה כדי להבטיח חלוקה שווה של חלקיקים. דגירה תאי הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באווירת humidified.
- למחרת לנתח תרביות תאים לקרינת Cy3 גן ספציפי עם גל עירור של 546 ננומטר (פליטה 575-640 ננומטר) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: התקופה הנדרשת כדי להשיג הקרינה חזקה מספיק עשוי להיות תלוי בסוג התא וגן המטרה. בניסויים אלה, זה היה נראה בין 16 ו -20 שעות לאחר היישום של החללית.
4. אוכלוסיות תאי זיהוי של Cy3 חיובי על ידי הזרימה cytometry
- לגדול HEK 293 או תאי גזע עובריים בעכברים באמצעות התנאים המפורטים בסעיף 1.1 או 1.3, respectively. יום אחד לפני ניתוח FACS להוסיף חלקיקי -specific GAPDH בריכוזים שונים לHEK 293 תאים (ראה איור 6 א) וב -400 PM לMurine תאי גזע עובריים. דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באווירת humidified.
- לנתח תרביות תאים לקרינה מושרה Cy3 גן ספציפי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- לנתק HEK 293 תאים כמפורט בנקודה 1.1.2. צנטריפוגה, להעביר לתוך צינור 1.5 מ"ל וגלול ב200 BSA μl קר כקרח PBS / 0.5% / 2 (חיץ FACS) mM EDTA. שמור את התאים חשוכים על קרח עד ניתוח התזרים cytometric.
- לנתק את תאי גזע עובריים בעכברים כמפורט בנקודה 1.3.3. צנטריפוגה, להעביר לתוך צינור 1.5 מ"ל וגלול ב200 BSA μl קר כקרח PBS / 0.5% / 2 מ"מ EDTA. שמור את התאים חשוכים על קרח עד ניתוח התזרים cytometric.
- לחץ על התאים דרך מסנן 30 מיקרומטר כדי למנוע צבירת תא ולהוסיף יודיד propidium דקות 2 (ריכוז סופי 2 מיקרוגרם / מיליליטר)לפני ניתוח FACS להוציא תאים מתים.
- כדי לנתח תאים Cy3 חיוביים להגדיר שערים היררכיים על FSC-A / SSC-משנה ראשון, FSC-H / FSC-W-משנה ותת SSC-H / SSC-W. השתמש בקדימה וצד הפיזור להוציא פסולת תא ותאים שאינם מפוזרים. תכלול תאים מתים על ידי צביעת יודיד propidium בו מוצגות PE נגד אדום PE-טקסס. בצע את שער הסוג הסופי על תאים חיוביים Cy3-PE (איור 4).
Representative Results
בניסיון ראשון לאמת ולבסס את זיהוי תאיים של ביטוי גנים ספציפי בתאים חיים באמצעות חלקיקים החלטנו לבצע ניסויי טייס באמצעות גן בית השמירה הביע constitutively (GAPDH) בHEK 293 תאים האנושיים. הריכוז של חלקיקים המשמשים בניסויים אלה נבחר על פי ההמלצה של היצרן. התוספת של בדיקה -specific GAPDH למדיום התרבות בריכוז סופי 100 PM המושרה ברורה Cy3 הקרינה בתאים אלה שהיו גלויים לעין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר O / הדגירה N (איור 5 א). שני פקדים נכללו בניסויים אלו על מנת לבסס את התוצאה. שליטה אחת כוללת של ננו-חלקיקים שנקרא "לטרוף" שבו גדיל הכתב אין רצף התאמה בתאי יונקים או האיקריוטים. ננו-חלקיקי "לטרוף" קובע fluorescen הרקע נוקביםce בשל השפלה בדיקה אפשרית או מרווה שלמה של הקרינה. התוספת של הבדיקה לטרוף מיוצרת אות שולית בלבד ניאון, שהינה זניח (איור 5). שליטה "ספיגה" באופן קבוע שזורחת במסייעת לקבוע את היכולת של תאים לשלב חלקיקים על ידי אנדוציטוזה אשר עשוי להשתנות בין סוגי תאים שונים. חלקיקי שליטה החיוביים אלה מיוצרים אות ניאון בוהקת בHEK 293 תאים (איור 5 ג). לפיכך, את ההיתכנות של הטכנולוגיה להקליט אות ניאון ספציפית של גן תאיים עם אות רקע זניחה אושרה. יש לציין כי ההבדל בין אות הרקע והקרינה הספציפית פוחת עם זמן. עליות הרקע בשל לחקור השפלה או מרווה שלמה בעוד הקרינה הספציפית נמוגה בהדרגה (5D איור). יש לי אותו חלקיקי -specific GAPDHנבדק בתרבויות פיברובלסטים עיקריות של עכברי, חזירי וכבש מקור 17. תאים אלו מייצרים אות רקע גבוהה בהרבה מHEK 293 תאים בעוד הקרינה היעד ספציפי היא די חלשה, אולי בשל יכולת השגשוג הנמוכה יחסית של תרבויות אלה.
ניסויי פיילוט אלה הניעו אותנו להשתמש בטכנולוגיה זו לצורך זיהוי של ביטוי גני pluripotency בiPS נגזר ממינים שונים. לצורך כך NANOG וGDF3 נותחו, אשר שניהם ידועים להתבטא בתאי pluripotent 18. בתאי iPS הראשונים נובעים מfibroblasts זנב-קצה של קו עכבר מהונדס משפר לב Nkx2.5 19 נחקרו. לשני גני אות ניאון חזק הושגה (איור 6 א) וCy3 הקרינה זניחה של השליטה לטרוף (מידע לא מוצג). תוצאות דומות התקבלו בתאי iPS אנושיים וחזיריים (איור 6B ו- C). חשוב לציין, אות הקרינה הוגבלה למושבות iPS ולא לתייג את fibroblasts משמש כשכבת מזין לעכבר וiPS חזירי (ראה חיצים באיור 6 א ו- C). הניתוח של ביטוי גני NANOG גם גילה שלא כל רצף חזה בסיליקון ולהיות "טוב" סוף סוף הוא פונקציונלי. אחד משלושה עיצובים של חלקיקי -specific NANOG המושרה כמעט ולא אות ניאון דומה לזה של השליטה לטרוף למרות 100% התאמת רצף בתאי iPS עכברי (איור 6 ד). תוצאה דומה התקבלה בתאי iPS של אדם ומקור חזירי עם בדיקה זו (מידע לא מוצג). כך, ניתן להשתמש בננו-חלקיקים כדי לזהות ביטוי גני pluripotency מעבר לגבולות מינים ואילו את הפונקציונליות של כל בדיקה שנועדה צריכה להיות מוערכת מראש.
התוצאות המבטיחות של באתרתיוג של תאי חיים בתרבות מנות תא תתבקש לנו לנתח ביטוי גני כמותית ידי cytometry זרימה. לשם כך חלקיקי -specific GAPDH נוספו בריכוזים מדורגים לHEK 293 monolayers כדי להשוות את יעילות התיוג בתוך אוכלוסיית תא המטרה. כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה מושרה Cy3 משופר נתפסה עם הריכוז הנמוך ביותר בהשוואה לתאים שלא קיבלו את חלקיקים. ריכוזים הולכים וגדל של חלקיקים מושרה הקרינה ברורה ריכוז תלוי של 293 תאי HEK באתרו (איור 7 א). הכפפת תאים אלה לניתוח התזרים cytometric אישרה את יעילות התיוג תלויה הריכוז. התדירות של תאים חיוביים Cy3 גדלה באופן משמעותי (יותר מ שבעתיים) כאשר הריכוז הגבוה ביותר של חלקיקים יושם (איור 7). בניסויים נוספים ES תאים מלב Nkx2.5קו העכבר מהונדס משפר 19 שימש כדי לנתח את הביטוי של גני pluripotency ידי cytometry זרימה. ניסויי פיילוט עם 400 PM של שליטת הספיגה החיובית הניבו מושבות ES החי חיוביות ברור Cy3 מתחת למיקרוסקופ וcytometry זרימה זוהו כמעט 40% מתאי Cy3 החיוביים (איור 7 ג). לעומת זאת, דומה לתאים שלא טופלו כ 0.1% מתאים שטופלו החיובי לטרוף מוכתם (מידע לא מוצג). כמו כן התוספת של חלקיקים ספציפיים לGAPDH, Nanog וGdf3 מושרה אות הקרינה שונה במושבות בודדות בצלחת תרבית תאים. התדירות של תאים חיוביים Cy3 לGAPDH כפי שנקבעו על ידי cytometry זרימה הייתה דומה לזו שנצפתה בשני גני pluripotency (איור 7 ג). תוצאה זו היא צפויה וכNanog וGdf3 הם חשבו גם לבוא לידי ביטוי constitutively בתאי הגזע העובריים pluripotent. לפיכך, נתונים אלה הזמנה אישית באופן ברורקייט שבתאים לבטא גנים מסוימים יכולים להיות מזוהים על ידי הזרימה cytometric ניתוחים, איכותי ועל ידי הכמות היחסית שלהם.
איור 1: ייצוג סכמטי של המבנה של החלקיקים. מבנה () של ננו-חלקיקי גן ספציפי. ננו-חלקיקים (ב) מירוץ (שליטה שלילית). (ג) ספיגה ננו-חלקיקים (ביקורת חיובית). מעובד מתוך לחם et al. 17, הודפס מחדש באישור מיילי.
איור 2: יישום של חלקיקים לסלולריים תרבויות פתרון מדולל כראוי של חלקיקים הוא pipetted פשוט לתוך מדיום התרבות.. לאחר O / תאי גן ספציפי הדגירה N ניאון גלויים תחת AF מיקרוסקופ luorescent.
איור 3:. תאי ספיגה פעילה של חלקיקים על ידי תאים באמצעות אנדוציטוזה () באופן פעיל לבלוע חלקיקים על ידי אנדוציטוזה (ב) היעד mRNA נקשר לגדיל ללכוד ומחליף את כתב fluorescing..
איור 4: gating אסטרטגיה לcytometry הזרימה. (א) לאסטרטגיה 293 HEK תאים. (ב) אסטרטגיה לתאי גזע עובריים בעכברים. נתונים נרכשו באמצעות מכשיר 1 לHEK 293 תאים או מכשיר 2 לתאי גזע עובריים בעכברים ונותחו לאחר מכן על ידי כלי תוכנה (ראה טבלה של חומרים).
/53268fig5.jpg "/>
איור 5:. ניתוח של -expression GAPDH בHEK 293 תאי ננו-חלקיקי -specific GAPDH התווספו לתאים ב 100 PM (ריכוז סופי) וקרינה נרשמה לאחר O / דגירה N () ננו-חלקיקי -specific GAPDH (ב.. ) לטרוף (שליטה שלילית). () ספיגה (שליטת C חיובית). (ד) קינטיקה של לטרוף ושליטה ספיגה. הקרינה נקבעה בנקודתי הזמן שצוינו לאחר תוספת של חלקיקי -specific GAPDH. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר.
איור 6:. ניתוח של ביטוי גנים בתאי pluripotency iPS של מינים שונים חלקיקים ספציפיים לNANOG או GDF3 נוספו לתאים ב 400 PM (conce הסופיntration) וקרינה נרשמה לאחר O / דגירה N. (א) בתאי iPS Murine. () תאי iPS האדם B. () תאי iPS בשר חזירים C. חצים ב (א) ו- (ג) לייעד תאים מזינים-שכבת פיברובלסטים ללא תווית. פלואורסצנטי (D) בתאי iPS עכברי לאחר תוספת של ננו-חלקיקי SF3 NANOG-העיצוב. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר.
ניתן לזהות תאים חיים Nanoparticle תווית על ידי cytometry זרימה: איור 7. תדר מבט מיקרוסקופי של HEK החיובי Cy3 293 תאים לאחר תוספת של ריכוזים שונים של ננו-חלקיקים (). (ב) לתאים חיוביים Cy3 נקבעו על ידי cytometry זרימה. צביעה חי של מושבות תאי גזע עובריים בעכברים (C) וקביעת התדירות של Cy3 חיובי תאים. חלקיקים נוספובריכוז סופי של 400 PM. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר.
Discussion
העבודה הנוכחית מתארת את השימוש בחלקיקי הקרינה שכותרת המאפשרים הערכה אמינה של ביטוי גנים תאיים ישירות בתאים חיים ממיני יונקים שונים עם מקור histogenetic מגוון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יש כמה יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו. קודם כל החוקר אינו מוגבל ביחס לאו גן המטרה או סוג התא. כל שיטות זיהוי הנוגדן המבוסס מוגבלות לאפיטופ יחיד. למרות שגם יכולות להיות מתוכננות משואות מולקולריות ניאון עבור קשת רחבה של גנים, שיטה זו דורשת הניתוק של תאים ולאחר מכן nucleofection 15. לעומת זאת, היישום של חלקיקי גן ספציפי אינו דורש כל מניפולציה של תא המטרה שבולע חלקיקים באופן פעיל על ידי אנדוציטוזה. במהלך passaging הבא חלקיקי הזהב לעזוב בהדרגה את התאים והתרבות יכולה לשמש בdownstreaניסויים מ '.
עם זאת, הטכנולוגיה גם עדיין יש כמה מגבלות. סמנים חלקם ברור שלא לזיהוי בשל אופיים הפחמימות כגון SSEA-1 או TRA-1-81 20. נכון לעכשיו, מערך גדול של חלקיקים הוא זמין באופן מסחרי. חלקיקים אלה שנבדקו מראש על הפונקציונליות שלהם בניסויים סלולריים. מטרת העבודה הנוכחית הייתה לתכנן בדיקות מותאמות אישית שניתן להשתמש בם מעבר לגבולות מינים. כאשר בעקבות גישה כזו או בעת תכנון בדיקה לאחד גן מטרת רומן צריך להיות מודע לכך שהפונקציונליות של סיליקון בחזה בדיקה צריכה להיות מוערכת באופן יסודי במבחנה. הבדיקה NANOG-SF3 אשר הראתה הומולוגיה 100% להומולוגיה ברצף לא עבדה בכל הזמן שNANOG-SF1 עם בסיס אחד תואם בעכברי ורצף חזירי מיוצר אות הקרינה נחמדה. שאלה נוספת מתייחסת לספיגה היעילה של חלקיקים. החלקיקים להיכנסהתאים על ידי אנדוציטוזה, תהליך שמושפע מהגודל של חלקיקים 21, סוג התא ומצב הבידול 22 והיכולת הסלולרית לבצע phago- וmacropinocytosis 23. הריכוז האופטימלי כדי להשיג אות הקרינה מספקת יש להיבדק עבור כל יישום בודד או שורת תאים. לשם כך, הניסוי הראשון תמיד צריך להיות היישום של שליטת הספיגה להעריך את התאימות של הבדיקות בסוגי התאים ותנאי תרבות לפני שעבר ליעד ספציפי זיהוי של ביטוי גנים.
נקודה קריטית להשגת תוצאות אמינות בעת החלת פרוטוקול זה לשורת תאי רומן או אוכלוסיית תא היא ההכללה של בקרות נאותות. שליטת הספיגה אי פעם שזורחת בתספק רמז שריכוזים של חלקיקים יגרמו אות ניאון מספיק באוכלוסיית תא המטרה. הקרינה יש להעריךד למחרת כאות לדעוך עם זמן 17. במקביל השליטה לטרוף בלי עמית בגנום אוקריוטים מיושמים בריכוז זהה חייבת לגרום לאות רקע זניחה. כביקורת שלישית מומלץ להשתמש ננו-חלקיקים ספציפיים לגן משק (למשל GAPDH, β-אקטין). חלקיקים אלה משמשים כביקורת חיובית שהגישה יכולה לשמש כדי לזהות ביטוי גנים ספציפי באוכלוסיית תא היעד שנבחרה. אם בקרות אלה להתברר משביע רצון אחד יכול לצפות לקבל אותות ניאון ספציפיים אמין באמצעות חלקיקים ספציפיים לגנים מטרה אחרים. הריכוז של חלקיקים להחיל יכול להיות גם קריטי כפי שהם הוכחו למטה להסדיר את רצף היעד 24. עם זאת, השפעה זו דורשת ריכוזים גבוהים בהרבה (5 ננומטר) מהריכוזים המשמשים בניסויים שהוצגו כאן (400 בערב). בריכוז זה nanoflaמיל אינו משפיע על mRNA גן המטרה או רמות חלבון וריכוזים גבוהים ככל 2 ננומטר אינו פוגע בהתרבות המהירה של תאי גזע עובריים HEK293 ועכבריים 17. בנוסף, ניתוח ביטוי הגנום כולו לא גילה כל שינוי משמעותי בביטוי גני 25. לכן, בריכוזים של עד 1 ננומטר nanoflares לא צריך להציג שום תופעות לוואי חשובות.
יישום מבטיח מאוד של טכנולוגיה זו הוא האפשרות לתייג כל אוכלוסיית תא נתון שמסומנת על ידי גן ספציפי. לאחרונה, חלקיקי גן ספציפי בהצלחה נעשו שימוש כדי להכתים סלקטיבי myocytes החי חדרית 26, תת-אוכלוסיות של תאים מלנומה 27, מונוציטים 28 ותא המוח הקטן תרבויות 29. ניתן למיין אוכלוסיות תאים מסומנים הקרינה כזו ומטוהרות על ידי cytometry זרימת תאי חיים כ. בתחום האונקולוגיה זה ניתן להעלות על הדעת לבודד תאי גידול גרורתי בשידור חי במודלים של בעלי חייםהמבוסס על ביטוים של CEA, היקר ביותר לחיפוש של גרורות פוטנציאל קידום גנים או מבני יעד. לאחרונה הראו כי ניתן לזהות מושבות iPS עכברית באמת לתכנות מחדש באתר עם חלקיקי -specific Nanog מבוססים על עוצמת הקרינה זוהתה 17. לכן, זיהוי של מושבות iPS באמת לתכנות מחדש יכול להתבצע על פלטפורמות תפוקה גבוהות, המשתמשות בזיהוי הקרינה רובוטית והתקנים לקטוף לזהות מושבות המבטיחות ביותר. טכנולוגיה זו נראית מתאימה בתחומי מחקר רבים כדי לבחור תת-אוכלוסיות ספציפיות סלולריות ונראה כי ניתן להחיל את חלקיקים בפלטפורמות תפוקה גבוהות. לסיכום, פרוטוקול זה מייצג גישה חדשנית באמצעות חלקיקי הקרינה שכותרת המאפשר זיהוי של ביטוי גנים תאיים ישירות בתאים חיים. טכנולוגיה זו עשויה להיות כלי רב ערך כדי לטהר, להרחיב ואופי נוסףize תת-אוכלוסיות סלולריות נדירות בתחומי מחקר רבים.
Disclosures
HL קיבל חלקיקים מחברת Millipore EMD ללא תשלום. כל המחברים האחרים מה למסור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
| Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
| Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
| DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
| Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
| MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
| 0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
| Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
| Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
| E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
| EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
| Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
| Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
| BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
| Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
| FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
- Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
- Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
- Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
- Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
- Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
- Marti, M., et al.
- Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
- Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
- Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
- Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
- Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
- Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
- Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J.
- Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
- Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
- Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
- Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
- Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
- Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).
