Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Abstract

Relativamente cellule staminali somatiche quiescenti sostenere il rinnovamento cellulare per tutta la vita nella maggior parte dei tessuti adulti. Le cellule staminali neurali nel cervello dei mammiferi adulti sono limitate a due specifiche nicchie neurogena: la zona subgranulare del giro dentato dell'ippocampo e la zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ, chiamato anche zona subependimale o SEZ) nelle pareti del laterali ventricoli. Lo sviluppo di strategie in vivo di trasferimento genico per le popolazioni di cellule staminali adulte (cioè quelli del cervello dei mammiferi) con conseguente espressione a lungo termine di transgeni desiderati nelle cellule staminali e la loro progenie derivata è uno strumento cruciale nella corrente ricerca biomedica e biotecnologica. Qui, un metodo diretto in vivo è presentato per la modificazione genetica stabile di cellule di topo adulto V-SVZ che sfrutta la cella infezioni ciclo-indipendente LV e la citoarchitettura altamente specializzato della nicchia V-SVZ. In particolare, l'attuale protocollo comportas l'iniezione di LV vuoti (controllo) o LV codificanti cassette specifica espressione del transgene nelle memorie V-SVZ sé, per in vivo di targeting di tutti i tipi di cellule nella nicchia, o nel lume ventricolo laterale, per l'orientamento dei ependimali solo le cellule. cassette di espressione vengono poi integrati nel genoma delle cellule trasdotte e proteine ​​fluorescenti, codificate anche dal LV, permettere la rivelazione delle cellule trasdotte per l'analisi di cellule, effetti autonomi e non autonomi nicchia-dipendente sulle cellule marcate e loro progenie.

Introduction

La zona ventricolare-subventricular murino (V-SVZ), nelle pareti del ventricolo laterale rivolta verso lo striato, è una regione germinale molto attivo in cui un processo continuo di replicazione delle cellule progenitrici e differenziazione risultati nella produzione persistente bulbo olfattivo (OB ) interneuroni e oligodendrociti corpo calloso ^1. La generazione per tutta la vita di queste cellule sembra essere sostenuta dalla presenza in questa regione di cellule neurali staminali (NSC; anche chiamate cellule B1), che esprimono l'antigene astrociti proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) e gambo marcatori di cellule, come nestina, Id1 e Sox2 ^2. GFAP-cellule che esprimono B1 generare cellule (TAP) (cellule C), che esprimono fattori di trascrizione Dlx2 transito amplificando progenitore (distale-meno homeobox 2) e Ascl1 (mammiferi achaete-Schute omologo 1) e dividere rapidamente un paio di volte prima che danno luogo a neuroblasti migrazione (cellule a) o oligodendroblasts ^3. Appena generata prolifneuroblasti migrano rative anteriormente, formando il flusso migratorio rostrale (RMS) per l'OB, in cui si integrano nel granulari e strati glomerulare come interneuroni inibitori differenziati. Migrazione giovani oligodendroblasts muovono al CC, dove diventano cellule NG2-positive immature che continuano a dividere localmente o differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti maturi ^1,4.

celle B1, che derivano da cellule gliali radiali fetali, conservano la morfologia allungata e polarizzata dei loro predecessori e presentano un rapporto altamente specializzato con la loro nicchia. Essi spaziano tra il ependima che allinea il ventricolo e la rete di vasi sanguigni che irrigano la nicchia V-SVZ. Il piccolo processo apicale delle cellule B1 intercala tra ependymocytes multiciliated e termina in un singolo ciglio primario non mobili, mentre il loro processo basale si estende lunghe distanze per avvicinarsi il plesso vascolare planare che irriga questo finale nicchia nel BAsal lamina dei capillari del plesso ^2,5-8.

Il modo più affidabile per distinguere B1-NSC da astrociti non neurogena, che sono anche GFAP ^+, nella nicchia V-SVZ intatto si basa sulla preparazione della parete laterale del ventricolo e la loro analisi del 3-D microscopia confocale tutto il montaggio dopo immunocolorazione per GFAP per etichettare il sottile processo apicale B1-NSC, β-catenina a delineare le membrane cellulari, e sia γ-tubulina come marcatore di corpi basali cilial o acetilata α-tubulina di etichettare l'entità di ogni ciglio ^5,8. Le osservazioni di questi interi-monti dalla superficie ventricolare hanno indicato che le cellule B1 e ependimali sono disposti in "girandole" ^5, in cui i processi apicali uniciliated di uno o più GFAP ^{+ B1} cellule sono circondate da una rosetta di cellule ependimali multiciliated.

La morfologia caratteristica delle cellule B1 correla con l'evidenza sperimentale indicating che i vasi sanguigni / cellule endoteliali e ventricolare liquido cerebrospinale (CSF) costituiscono fonti regolamentati di segnali solubili che agiscono su NSC ^2,6,9-11. In superficie ventricolare, omotipica e le interazioni apico-laterale eterotipica che coinvolgono cellule ependimali e B1 comprendono giunzioni strette e giunzioni aderenti ^5,12. Inoltre, molecole di adesione coinvolte nei complessi giunzionali tra cellule B1 e ependimali, come N-caderina e V-CAM, hanno dimostrato di regolare non solo il posizionamento altamente organizzato di B1 nella nicchia V-SVZ, ma anche la loro quiescenza ^{12 , 13.} Il monostrato di cellule ependimali-B1 sembra agire come barriera di diffusione che consente il flusso regolamentato di acqua e piccole molecole dal CSF, ma limitando il passaggio intercellulare grandi proteine ^​​10,11. Evidenze sperimentali indicano che la posizione unica ciglio apicale delle cellule B1 potrebbe svolgere un ruolo di sensore di segnalazione polipeptidi presenti nel liquor ^2,5-7. Cellule ependimali sono, di per sé, anche una sorgente di segnali solubili e di membrana con un ruolo nella regolazione del comportamento NSC ^14,15.

Nucleosidi tracciabili, come bromo-deossiuridina (BrdU), o retrovirus sono stati ampiamente utilizzati per marcare le cellule progenitrici, tra NSC, in vivo. Tuttavia, questi metodi non sono ottimali per il destino tracciamento a lungo termine, perché i segnali BrdU diluito attraverso divisioni cellulari ripetuti e retrovirus sembrano indirizzare preferenzialmente transitoriamente amplificare le cellule a causa della loro esigenza di proliferazione delle cellule per la trasduzione ^16,17. Per esaminare NSC fisiologia in vivo, comprese le interazioni con i componenti di nicchia, è fondamentale stabilire un metodo per etichettare e tracciare le cellule raramente che dividono, come B1-NSC sono in gran parte a riposo e le loro cellule ependimali vicini non si dividono in condizioni fisiologiche ^3. Qui, dimostriamo che vettori lentivirali (LV) consentono di marchio gene ad alta efficienzazione e modifica a lungo termine di NSC adulti e non dividendo le cellule ependimali, causa più ragionevolmente alla loro capacità di trasdurre e di integrarsi nel genoma delle cellule bersaglio in modo indipendente ciclo cellulare. Inoltre, si mostra come il percorso di consegna e virali aiuto titolo di trasdurre specificamente cellule ependimali, ma non le cellule B1 consentendo in tal modo l'analisi di nicchia-dipendente, effetti ependimali su NSC.

Protocol

ETICA DICHIARAZIONE: Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Valencia in conformità con la direttiva europea 2010/63 / UE.

1. Generazione di LV per In Vivo marcatura studi (si veda la Figura 1a)

ATTENZIONE: La procedura qui descritta è livello di biosicurezza 2, eseguire quindi tutte le seguenti procedure in una cappa di rischio biologico. Assicurare che il personale di ricerca sono adeguatamente qualificato e preparato in tutte le procedure. Indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui abito, guanti doppie e protezione per gli occhi adatto. Infine, a fondo decontaminare tutti gli strumenti e le superfici che potrebbero essere stati a contatto con i virus in base alle pratiche di impianto di disinfezione, approvate (strofinando con etanolo al 70%, il 10% di candeggina e / o autoclave).

1. Produzione di LV in embrionali umane cellule renali 293T
   1. Inizia questo protocollo per la preparazione del DNA puro per trasfezione. Preparare e purificare ogni plasmide con un doppio grad CsClcentrifugazione iente o altri metodi di colonne disponibili in commercio che producono DNA privo di endotossine. In questo protocollo abbiamo usato il trasferimento vettore plasmidico pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Plasmidi di imballaggio di base consigliate sono pMDLg / pRRE e pRSV.REV e busta plasmide pMD2G ^13,18,19.
   2. Ventiquattro ore prima della transfezione, piastra 5 x 10 ⁶ cellule 293T in Iscove Modified Medium (IMDM) Dulbecco (vedi TABELLA MATERIALI) in un piatto di plastica 10 cm, per ottenere una coltura circa 1/4 a 1/3 confluenti per trasfezione. Incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato in un'atmosfera di 5-7% CO _2.
   3. Sostituire il mezzo con fresca media 2 ore prima della trasfezione.
   4. In uno sterile mix provetta da 1,5 ml microcentrifuga 10 pg di trasferimento vettore plasmidico (contenente il cDNA del transgene o shRNA da consegnare) con 2,5 ug del pRSV.REV e 5 ug del plasmide Confezioni pMDLg / pRRE e 3.5 & #181; g del plasmide busta pMD2G. Portare la soluzione plasmide ad un volume finale di 450 ml con tampone 0.1x TE (vedi Tabella dei materiali) / DH ₂ 0 (2: 1). Quindi aggiungere 50 ml di 2,5 M CaCl _2.
   5. Formare il precipitato per aggiunta goccia a goccia di 500 microlitri della 2x Hepes Buffered Saline (HBS, vedi Tabella dei Materiali), soluzione al _DNA-TE-CaCl2 miscela 500 microlitri mentre vortex a tutta velocità.
   6. Aggiungere il precipitato alle cellule 293T immediatamente. Agitare delicatamente la piastra per mescolare. Ritorna le cellule per l'incubatore e cambiare il mezzo 14-16 ore dopo la trasfezione.
   7. Raccogliere i surnatanti cellulari 30 ore dopo aver cambiato i media. Filtrare il surnatante attraverso un filtro di nitrocellulosa 0,22 micron pori e procedere alla concentrazione.
2. Concentrazione di LV
   1. Concentrare il terreno condizionato da ultracentrifugazione a 50.000 xg (19.000 rpm con rotore ultracentrifuge SW-28) da 2hr a temperatura ambiente (RT) in una provetta conica rotore trasparente 30 ml polipropilene.
      Nota: utilizzare adattatori ultracentrifuga per tubi rotori conici (vedi tabella dei Materiali).
   2. Eliminare il surnatante per decantazione e risospendere il pellet in un piccolo volume (200 ml o meno se viene eseguita una sola centrifugazione) di tampone fosfato salino (PBS; vedi Tabella Materiali). Poi pipetta su e giù per circa 20 volte.
   3. Pool sospensioni e concentrare nuovamente ultracentrifugazione, anche 50.000 x g (23.000 rpm con SW-55 rotore ultracentrifuge) per 2 ore a temperatura ambiente. Utilizzare tubi rotori trasparenti in polipropilene con un volume nominale di 5 ml (vedi Tabella dei Materiali).
   4. Risospendere il pellet finale in un volume molto piccolo (1/500 o 1 / 1.000 del volume iniziale del mezzo) di PBS sterile e agitare su una ruota girevole per 1 ora a RT. Suddiviso in piccole aliquote (5-20 microlitri) ed fli reeze a -80 ° C.
   5. Trattare tutti i tubi vuoti con il 10% di candeggina prima dello smaltimento.
3. Lentivirali titolazione mediante citometria a flusso
   1. Il giorno prima, piatto 5 x 10 ⁴ cellule HeLa per pozzetto in piastre di coltura dei tessuti 6 pozzetti in 2 ml di Modified Media Dulbecco di Eagle (DMEM) (vedi tabella dei materiali). Incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato in un'atmosfera di 5-7% CO _{2 per} 24 ore.
   2. Il giorno della titolazione, scongelare un'aliquota dello stock virale e preparare diluizioni seriali, dal 10 ^{-3 a} 10 ^-8, in DMEM.
      1. Per fare questo, prendere un 24-pozzetti e aggiungere 2 ml di DMEM al primo pozzo e 1,8 ml alle seguenti pozzi. Quindi aggiungere al primo pozzo 2 ml di magazzino virale concentrato (ad una diluizione finale di 1: 1000 o 10 ^-3).
      2. Dopo pipettando più volte per mescolare bene la soluzione, il cambiamento punta e trasferire 200 ml di diluizione 10 ^-3al secondo pozzo. Ripetere la procedura serialmente nelle seguenti pozzetti finché non viene effettuata la diluizione 10 ^-8.
   3. Prendere cellule HeLa placcato il giorno precedente dal termostato. Rimuovere con cautela media dai pozzi. Aggiungere 1 ml di ciascuna diluizione virale insieme con 1 ml di 8 mg / ml di bromuro hexadimethrine rispettivi pozzetti di cellule contenenti HeLa. Agitare delicatamente la piastra per mescolare.
      Nota: Hexadimethrine bromuro viene aggiunto per aumentare l'adsorbimento del virus alle cellule in coltura.
   4. Riportare le cellule per l'incubatore e consentire l'infezione di procedere per 72 ore. Dopo di che, rimuovere il supporto, lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere 200 ml di tripsina-EDTA (vedi Tabella dei Materiali) in ciascun pozzetto.
   5. Dopo 5 minuti a 37 ° C, aggiungere 2 ml di soluzione salina in ogni cellule bene e raccolto in citometria a flusso tubi.
   6. Centrifugare a 300 g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante.
   7. Risospendere il pellet con 1 ml di soluti fissaon (formaldeide elettroni grado microscopia 1% e il 2% di siero fetale bovino in PBS), quindi vortice i tubi.
   8. Analizzare le cellule in un citofluorimetro utilizzando un 488 nm argon-ionlaser a 15 mW di potenza.
   9. Impostare lo strumento con la configurazione standard: forward-scatter (FS), side-scatter (SS), e fluorescenza per GFP (525/40 nm). Selezionare gating popolazione di cellule in un FS vs SS dot plot di escludere aggregati di cellule e detriti. Raccogliere fluorescenza in scala logaritmica. Calcolare il numero di cellule GFP ⁺ in ciascun campione.
   10. Calcola vettore titolo con la seguente formula:% GFP ⁺ / 100 x numero di cellule infette fattore x di diluizione (DF) = unità di trasduzione (TU) / ml.

Figura 1: Rappresentazione schematica delle diverse parti del procedimento (a) La parte 1 t.egli protocollo: generazione di LV per gli studi in vivo di etichettatura, dalla trasfezione di cellule HEK293T con plasmidi appropriati per generare i LV alla determinazione del titolo del virus mediante citometria di flusso con la formula indicata. I nomi dei plasmidi e rotori centrifughe sono indicati. (B e C) Parte 2 del protocollo: l'iniezione stereotassica di LV. "B" raffigura un esempio di una scala Vernier, un dispositivo che è parte di strumenti stereotassica e serve per misure fini. Come esempio, le frecce indicano 4.23 cm. Una scala Vernier viene utilizzato per determinare le coordinate del antero-posteriore (AP), medio-laterale (ML), e dorso-ventrale asse (DV) come mostrato per un top-view (sinistra) e per una sezione sagittale (destra ) del cervello. "C" indica la posizione del bregma come intersezione tra le suture sagittali e coronali. LV sono iniettati con una siringa. (D) disegni schematici che mostra come il cervello is preparate per l'analisi. I due emisferi sono divisi ed ognuno è diviso in due blocchi. Blocco "a", contenente gli OB, è prodotto da un taglio coronale a livello AP immediatamente posteriormente alla giunzione OB con telencefalo (bregma 2,46 millimetri; vedi Paxinos' Atlas per riferimento). Blocco "b" è prodotta da due tagli coronali, uno al livello appena anteriormente alla aspetto più rostrale del corpo calloso (bregma 1,7 mm) e una seconda a livello della giunzione dei due ventricoli laterali (bregma -0.22 mm). GL, strato glomerulare; GCL, strato di cellule dei granuli; st, striato; cc, corpo calloso; AC, commissura anteriore; lv, ventricolo laterale.

2. Stereotassica Iniezione di LV in / Striatum bordo V-SVZ o nel ventricolo laterale (vedi figura 1b)

1. Preparazione
   1. Sterilizzare una capacità siringa 5 microlitri con un ago 33 gauge spruzzando lungo il corpo e l'ago con il 70% di etanolo con lo stantuffotirato fuori tutta la strada. Ripetutamente aspirare l'etanolo da un tubo da 1,5 ml microcentrifuga ed espellere tutta la via d'uscita più volte, e sciacquare la siringa accuratamente con acqua sterile in seguito. Posizionare la siringa in modo sicuro da parte nel cofano della cultura e lasciarlo asciugare.
   2. Preparare un contenitore per rifiuti a rischio biologico con il 10% di candeggina ad un volume adatto ad immersione di tutti i rifiuti dalla presente procedura (in genere 200 ml in un contenitore da 500 ml).
   3. Preparare e preriscaldare un letto ad acqua C 37 ° riempiendo un sacchetto di plastica sigillato con l'acqua e il riscaldamento a 37 ° C. Questo permetterà di recuperare i topi dopo l'iniezione.
   4. Rimuovere stock virali da -80 ° C stoccaggio freezer 1 ora prima di iniziare le iniezioni e posizionare il flacone su una ruota girevole a RT. Dopo lo scongelamento, mantenere lo stock virale sul ghiaccio durante il periodo delle iniezioni. Prima l'iniezione stereotassica di LV, diluire le scorte virali concentrati per 10 ⁶ TU / ml con PBS nel cofano cultura.
   5. Sanificare l'area selezionata per eseguire l'operazione con il 70% di etanolo.
2. La microiniezione di LV
   1. Selezionare e sterilizzare gli strumenti necessari per la chirurgia (bisturi, trapano, e piccole pinzette).
   2. Anestetizzare un mouse 6-8 settimane di età per via intraperitoneale (ip) iniezione di una miscela di veterinaria-supervisione di ketamina e medetomidina. Pesare ogni animale e dosare ciascuno con 50-75 mg di ketamina e 0,5-1 mg medetomidina per kg di peso corporeo del mouse (circa 100-125 ml di ketamina / medetomidina soluzione per il mouse di lavoro).
   3. Valutare il piano anestetico pizzicando la punta dei piedi, la coda o orecchie e far sì che l'animale non mostra alcuna reazione.
   4. Una volta che il mouse è anestetizzato, iniettare butorfanolo per via sottocutanea ad una dose finale di 0,4-0,5 mg per kg di peso del mouse per ridurre al minimo il dolore post-operatorio.
   5. Radere l'area tra le orecchie e disinfettare la pelle utilizzando un iodoforo come iodopovidone o 70% di etanolo. Pulire con cotone sterileapplicatori -tipped. Fare attenzione a non bagnare eccessivamente l'animale come questo può esacerbare l'ipotermia.
   6. Posto l'animale in posizione prona su un telaio stereotassico e con attenzione fissare la testa utilizzando le barre orecchio e il sostegno palato dell'apparato. Mantenere il mouse con un set pad di riscaldamento a 37 ° C e lubrificare oftalmica per gli occhi.
   7. Fare un lungo un'incisione di 1 cm sulla pelle testa longitudinalmente con un bisturi, e ritrarre delicatamente la pelle per esporre il cranio con una pinzetta sottile.
   8. Pulire accuratamente la superficie ossea con un applicatore con punta di cotone sterile. Pulire l'osso del cranio esposto di qualsiasi tessuto rimanente.
   9. Montare la siringa sterilizzata sul dispositivo stereotassico utilizzando il supporto della siringa.
   10. Spostare l'asse titolare siringa x, yez finché la punta dell'ago della siringa è posizionato sul bregma, il punto di congiunzione in cui la sutura sagittale (longitudinale e mediale) è perpendicolarmente interseca con la sutura coronale (Figure 1b). Assicurarsi che la posizione "zero" dell'asse dorso-ventrale (DV) è alla superficie del cranio a bregma.
   11. Spostare la siringa per le coordinate X e Y di destinazione (vedi Tabella 1 e Figura 1b).

Regione di iniezione	coordinate
	Antero-posteriore (AP)	Medio-laterale (ML)	Dorso-ventrale (DV)
SEZ / striato confine	+0,6 mm	+1,2 mm	-3.0 mm
ventricolo laterale	-0.3 mm	+1.0 mm	-2.6 mm

Tabella 1: Coordinate Stereotassica per l'aproiezioni. Per l'AP e l'asse ML, coordinate x e y sono dati come distanza (in mm) dal bregma. "-" Indica "verso posteriori". Per coordina il DV "zero" è la superficie del cranio nel punto bregma e coordinate DV indicano la distanza (in mm) rispetto a questo punto.

12. Annotare il x, Y e Z destinazione nella scala Vernier, al fine di essere in grado di tornare al sito di iniezione in seguito. Mark l'osso alle coordinate x e y utilizzando un pennarello chirurgico.
13. Spostare la siringa dalla zona di lavoro.
14. Utilizzando un trapano elettrico praticare un foro sul cranio attenzione a non danneggiare il cervello. Non forare la superficie piale in quanto ciò potrebbe danneggiare la superficie del cervello.
15. Caricare la siringa con 1 ml di soluzione virale 10 ⁶ TU / ml. Utilizzare un calibro 33 ago tagliente smussato la cui punta ha un angolo di 10-12 °. Posizionare l'ago della siringa in un 90 ° angle rispetto alla superficie del cervello.
16. Spostare la siringa al sito di iniezione e spostarlo verso il basso fino a quando la punta tocca la superficie piale.
17. Penetrare il cervello con la siringa al coordinata z lungo l'asse DV.
18. Rilasciare lentamente la sospensione virale, ad una velocità di 0,2 ml / min, per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale causa dell'aumento della pressione del fluido.
19. Attendere 5-10 minuti per minimizzare il riflusso di sospensione virale e quindi ritrarre la siringa molto lentamente. Blot ogni eccesso di liquido che possono apparire in superficie a seguito della retrazione della siringa con un laboratorio pulire e collocarlo immediatamente nel contenitore rifiuti biosicurezza candeggina contenenti.
20. Prendere l'animale fuori del set stereotassica, posizionarlo su un pad caldo, e chiudere la ferita con adesivo pelle. Invertire la sedazione con 0,1-1,0 mg / kg di peso corporeo atipamezolo.
21. Iniettare Bupenorphrine per via sottocutanea ad una dose finale di 0,1 mg per kg di peso del mouse ogni 12 ore,a partire dal 4 ore dopo la somministrazione del corto analgesico Butorfanolo durata.
22. Posto l'animale in una gabbia individualizzato con un pad caldo e monitorare da vicino fino a quando il mouse recupera da anestesia. Mettere un sacchetto di idrogel nella gabbia per aiutare l'idrato animali dopo il recupero.
23. Smaltire tutti i rifiuti bio-contaminati nello smaltimento di candeggina rischio biologico liquido. Pulire la siringa per aspirazione ed espulsione di etanolo e risciacquare con acqua. Disinfettare la zona, il set stereotassica e il materiale chirurgico che è stato utilizzato con candeggina e il 70% di etanolo.
24. Mantenere i topi iniettati isolati nel biosicurezza di livello 2 spazio per 24-48 ore dopo di che possono essere trasferiti ad una struttura di alloggiamento convenzionale

3. analisi istologica

1. Perfusione, la raccolta dei tessuti, e sezionamento
   1. Profondamente anestetizzare il mouse utilizzando una miscela veterinaria-supervisione di medetomidina e ketamina (valutare il piano anestetico pizzicando la tOES, la coda o orecchie), come descritto prima.
   2. Transcardially profumato topi con 25 ml di soluzione salina seguiti da 75 ml di 4% PFA nel PB alla stessa velocità ^17.
   3. Estrarre il cervello e post-fissarlo immergendolo in almeno 10 volte il suo volume di freddo 4% PFA in PB per 1-16 ore (aumento dei tempi di post-fissazione possono diminuire l'immunoreattività di alcuni antigeni). Lavare accuratamente il restante PFA con PB.
   4. Tagliare il cervello seguendo le indicazioni della figura 1d e incollare il blocco risultante al titolare di un vibratome con cianoacrilato.
   5. Raccogliere 30 micron di spessore sezioni coronali di serie con un vibratome. Conservare le fette di cervello in piastre da 24 pozzetti con PB a 4 ° C. Per prevenire la contaminazione, 0,05% di sodio azide può essere aggiunto alla soluzione PB.
2. immunoistochimica
   1. Incubare sezioni libero di fluttuare in tampone di bloccaggio (PB con sodio azide 0,05%, 1% glicina, 5% di siero normale di capra, e 0,1% Triton X-100) per 1h a RT con agitando delicatamente in una piattaforma oscillante.
   2. Rimuovere con attenzione il tampone di bloccaggio con una pipetta, aggiungere una diluizione appropriata di anticorpi di coniglio primaria anti-GFP (vedi Tabella dei materiali) in tampone di bloccaggio e incubare il tessuto con questa diluizione per 48 ore a 4 ° C con un leggero scuotimento.
   3. Lavare la soluzione di anticorpo primario un minimo di 3 volte con PB, un lavaggio ogni 10 min.
   4. Incubare sezioni free-floating con opportuna diluizione di anticorpi secondari fluoroforo coniugato) in soluzione bloccante (vedi Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente e agitando delicatamente. Proteggere le sezioni dalla luce diretta durante l'incubazione.
   5. Lavare la soluzione di anticorpo secondario con PB, 3 volte ogni 10 min, e colorazione di contrasto tessuto incubando le sezioni con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) a 1 mg / ml in acqua per 5 min. Lavare la soluzione DAPI risciacquando due volte e rapidamente ingegnoh di acqua.
   6. Posizionare delicatamente sezioni su un vetrino da microscopio utilizzando un pennello fine. Versare alcune gocce di mezzo di montaggio per i preparati fluorescenti (vedi Tabella dei Materiali) sopra il tessuto e con attenzione inserire un coprioggetto sopra, controllando che la soluzione di montaggio è distribuito correttamente su tutta la superficie e non ci sono bolle. Premere delicatamente verso il basso il vetrino per drenare l'eccesso di mezzo di montaggio.
   7. Quando la soluzione di montaggio si asciuga (2-16 ore), analizzare il campione microscopio confocale a scansione laser con il laser 488 nm.

Representative Results

Sistema di erogazione gene LV-mediata può essere utilizzato per il lungo termine in vivo trasduzione di cellule nel topo adulto V-SVZ, permettendo loro di inseguimento e modificazione genetica durante la proliferazione, la migrazione e la differenziazione. L'infezione e l'espressione sono altamente efficaci e producono numerose cellule che possono essere facilmente distinta tra le altre cellule non infette con l'espressione del reporter incluso. Abbiamo finora visualizzato cellule trasdotte con i giornalisti GFP fluorescenti, guidata dal promotore chinasi fosfoglicerato ubiquitariamente espresso, ma altri giornalisti o tag proteina può anche essere usato. Noi abitualmente uso di anticorpi per GFP, invece di basarsi sulla rilevazione diretta delle emissioni giornalista in quanto produce un segnale fluorescente più forte. Inoltre, i cervelli possono essere sezionati fresco e immerso nel fissativo ma risultati migliori sono ottenuti mediante perfusione transcardial.

Purificata, le scorte vettore concentrati sono lentamente injected sotto guida stereotassica in V-SVZ al limite con striato (figure 2a, b). Due mesi dopo l'iniezione, numerose cellule GFP ⁺ sono stati trovati nella V-SVZ e in un raggio approssimata 1 mm dal sito di iniezione (figure 2a, b). L'infezione da VL risultati nella trasduzione di tutti i tipi di cellule del V-SVZ e l'espressione del reporter da cellule ependimali indica che LV può anche efficiente bersaglio non-divisione delle cellule (Figura 2c; vedi anche ^15). Modello GFP-etichettatura nel V-SVZ era simile a quello trovato dopo 2 settimane ^18. Nessun segno di reazione del tessuto, tuttavia, era rilevabile a 2 mesi dopo l'iniezione dal periodo lungo permette il recupero del tessuto dalla ferita inflitta dalla chirurgia. Durante il periodo di due mesi, le cellule infette TAP progressi in A-neuroblasti che migrano fuori dalla zona verso il OB. Poiché questo processo richiede pochi ^giorni 3, la presenza di GFP⁺ Neuroblasti in RMS 60 giorni dopo l'infezione indica che LV anche bersaglio neurogena B1-NSC (Figura 2d). La trasduzione di B1, C, e A cellule al momento dell'iniezione rendimenti GFP ⁺ interneuroni in OB (figura 2e).

L'iniezione di una piccola quantità di alto titolo concentrato scorte LV nei risultati ventricolo laterale nella infezione di ependymocytes solo (figure 2f-h). La maggior parte delle cellule ependimali, che contengono il calcio di legame con le proteine ​​S100β, esprimono il giornalista, dopo soli 15 giorni dall'infezione (Figura 2i). In contrasto con l'iniezione nel V SVZ-limite / striatali, non le cellule GFP ⁺ sono stati osservati subependymally trovano o nelle RMS o OB che utilizzano questa procedura (figure 2 ore, j). Entrambi i tipi di infezioni possono essere analizzati in sezioni attraverso il V-SVZ come spiegato. Possono anche essere analizzati in preparazioni di sfiato laterali tutto il montaggiomuro ricle (vedi protocollo ^a 8).

Recentemente, abbiamo descritto come N-caderina adesione mediata cellula-cellula di cellule B1 per ependymocytes regola la quiescenza. Abbiamo usato la procedura qui descritta per fornire LV trasportano caderina costrutti dominanti negativi che hanno portato l'inattivazione di N-caderina. Abbiamo dimostrato che la perdita di N-caderina nelle NSCs e cellule ependimali o in cellule ependimali promossa solo un aumento del numero e ciclo cellulare entrata di NSCs a seguito della perturbazione delle interazioni cellula-cellula omotipiche (figure 3a, b; vedi ^15).

Figura 2: rilevamento Reporter per immunofluorescenza in sezioni di topi iniettati (a) Rappresentazione schematica della nicchia adulti zona secondaria-ventricolare.. Una semplificazione della componen cellularets della nicchia è raffigurato. celle B1 sono polarizzati e presentano un rapporto specializzata con la nicchia. Essi spaziano tra il ependima che allinea il ventricolo e la rete di vasi sanguigni che irrigano la nicchia V-SVZ. Il piccolo processo apicale delle cellule B1 intercala tra ependymocytes multiciliated e termina in un singolo ciglio primario non mobili, mentre il loro processo basale si estende per avvicinarsi il plesso vascolare planare che irriga questa nicchia che termina in lamina basale dei capillari del plesso. Derivati ​​di cellule B1 sono progenitori intermedi che proliferano attivamente nei dintorni di vasi sanguigni e migrazione catene di neuroblasti verso i bulbi olfattivi a contatto con astrociti di nicchia. (B) Schema di una sezione coronale attraverso un emisfero mostrando il livello di iniezione e la posizione dell'ago della siringa per iniezioni nello / striato confine V-SVZ. (C) Micrografia assunto sempre allo stesso livello mostrato nella sta schematicained con DAPI (grigio, a sinistra) e per la immunolocalizzazione di GFP (verde; a destra) 60 giorni dopo l'iniezione. Le linee tratteggiate indicano i limiti del corpo calloso. (D) maggiore ingrandimento di un sistema di rilevamento immunofluorescenza del reporter GFP iniettato in prossimità V-SVZ o un bordo striato in una sezione coronale attraverso il V-SVZ. Le linee tratteggiate indicano i limiti della V-SVZ. Si noti che molte cellule sono infettate nella nicchia V-SVZ. cellule ependimali possono essere riconosciuti come celle cubiche che limitano il lume ventricolo. (E) immunofluorescenza per GFP (verde) e il marcatore neuroblast PSZ-NCAM (rosso). Si noti la presenza di cellule doppiamente positivi, indicante la generazione di neuroblasti da NSCs che sono stati infettati 60 giorni prima. frecce bianche indicano a neuroblasti. Inserti alla regione corrispondente racchiuso all'interno del quadrato bianco. (F) schematica di una sezione coronale attraverso un emisfero mostrando il livello di iniezione e la posizione dil'ago della siringa per iniezioni nello ventricolo laterale. (G) Micrografia presa allo stesso livello mostrato nello schema colorate con DAPI (in grigio, sinistra) e per la immunolocalizzazione di GFP (in verde; destra) 15 giorni dopo l'iniezione. Le linee tratteggiate indicano i limiti del corpo calloso. (H) maggiore ingrandimento di rilevamento immunofluorescenza del reporter GFP iniettato nel ventricolo in una sezione coronale attraverso il V-SVZ. Le linee tratteggiate indicano i limiti della V-SVZ. Si noti che solo le cellule ependimali sono infetti. (I - j) immunofluorescenza per GFP e il marcatore delle cellule ependimali S100β. Si noti la presenza di numerose cellule doppiamente positive lungo la dorsale (i) e ventrale (j) V-SVZ. punti Arrowhead ad un astrociti nel parenchima striato, etichettati anche con S100β. K. Sezione coronale attraverso l'OB macchiato con DAPI (grigio, a sinistra) e immunolocalizzazione di GFP (GREit; destra) nella regione delimitata dalla quadrato bianco 60 giorni dopo una V-SVZ / iniezione striato. Si noti numerosi neuroni marcati. (L) Sezione coronale attraverso l'OB macchiato con DAPI (grigio, a sinistra) e immunolocalizzazione di GFP (in verde; a destra) regione delimitata dalla quadrato bianco 45 giorni dopo un'iniezione ventricolo laterale. Si noti che non ci sono i neuroni OB etichettati. cx, corteccia cerebrale; lv, ventricolo laterale; str, striato; GL, strato glomerulare; GCL, strato di cellule dei granuli; MCL, strato di cellule mitrale. Barre di scala: C, G = 500 micron; d, e, hj = 10 micron; kl = 250 micron; 100 micron.

Figura 3:. NSC adulti proliferano più attivamente quando diventano indipendente dalla loro nicchia (a) microscopio confocale di sezioni attraverso il V-SVZ di topi che hanno ricevuto iniezioni striatali di LV vuoti (pannello superiore) o LV carrying un costrutto dominante negativo caderina (pannello inferiore), immunostained per la rilevazione della GFP LV giornalista (verde), il marcatore GFAP NSC (rosso), il marker ciclo cellulare Ki67 (ciano), e DAPI (blu) 60 giorni dopo le infezioni. pannelli indipendenti per ciascun indicatore sono mostrati (grigio, a destra). (B) micrografie confocale di sezioni attraverso il V-SVZ di topi che hanno ricevuto iniezioni di VL vuote (pannello superiore) o LV trasportano un costrutto caderina dominante negativo (pannello inferiore) nel ventricolo laterale immunostained per la rilevazione del reporter GFP LV (verde), il marcatore GFAP NSC (rosso), l'indicatore di ciclo cellulare Ki67 (ciano), e DAPI (blu), 15 giorni dopo l'infezione. pannelli indipendenti per ciascun indicatore sono mostrati (grigio, a destra). Frecce bianche indicano a / GFP doppie cellule positive GFAP e frecce bianche indicano a / Ki67 / GFP cellule positive triple GFAP cui nuclei in entrambi i casi sono indicati da un asterisco giallo. L'analisi quantitativa indicata più NSC bicicletta quando l'N-CADlivelli Herin sono diminuiti nelle NSC stesse o solo nelle cellule ependimali ^15. Scala: 10 micron.

Discussion

LV offrono importanti vantaggi rispetto ad altri sistemi virali per la modificazione genetica degli adulti NSC ^16,18. consegna stereotassica del lentivirus alla nicchia V-SVZ rappresenta un metodo efficace per etichettare e tracciare rado dividendo B1-NSC superare i limiti di altri metodi di uso comune come BrdU, che è diluito dopo molteplici divisioni cellulari, o retrovirus, che prendono di mira solo le cellule che proliferano al momento dell'applicazione. LV, insieme con adenovirus, può infettare le cellule indipendentemente dal loro status di ciclismo e questo è particolarmente rilevante per le cellule che non ciclo, come le cellule ependimali, o sono relativamente quiescente, e quindi dividono raramente, come adulti NSC ^16,18. I transgeni diventano stabilmente integrati e hanno espresso ad alta efficienza che permette caratterizzazione morfologica delle cellule trasdotte e la loro progenie.

NSC si annidano in una nicchia altamente specializzata con le cellule vicinecome le cellule ependimali o vascolari così come la loro stessa progenie cellulare creando così un ambiente strettamente regolamentato ^2. Come molti NSC fetali, cellule B1 si trovano vicino al ventricolo e il ventricolo di contattare il suo fluido attraverso piccoli processi apicali che finiscono in un unico ciglio primario non mobili immerso nel ventricolo CSF ¹ (Figura 2a). Questa organizzazione dettagliata può essere sfruttata per indirizzare specificamente cellule ependimali o tutte le celle nella nicchia attraverso il controllo della zona titolo e consegna virale. Adherens e giunzioni strette in epiteli polarizzati hanno dimostrato di ostacolare l'ingresso di virus stranieri nelle cellule e nei tessuti, a volte a causa della posizione ristretta dei recettori ingresso del virus (cioè recettori CAR) nei complessi giunzionali. Turbativa di adesione intercellulare favorisce quindi l'infezione da diversi tipi di virus, tra cui il lentivirus (LV). È interessante notare che, LV hanno dimostrato di interrompere complessi giunzionali quando viene utilizzatoa concentrazioni elevate dell'epitelio polmonare ^20-23. Questo potrebbe spiegare precedenti segnalazioni di infezioni di B1-NSC di LV iniettati nel ventricolo laterale ^24.

Dal B1-NSC producono progenie che migrano anteriormente e dorsalmente, cellule GFP-positive possono essere trovati a tutti i livelli delle RMS così come in OB e corpo calloso dove terminali differenziano in neuroni e oligodendrociti, rispettivamente. Tuttavia, non usiamo l'espressione giornalista di determinare effetti della modifica genetica sulle tariffe di neurogenesi e oligodendrogenesis. Da un lato, il corpo calloso è nel percorso della pista dell'ago e, quindi, alcune cellule che appaiono etichettati possono essere il risultato di un'infezione diretta durante il processo di iniezione. D'altra parte, poiché tutti i tipi di cellule del V-SVZ possono essere infettati non è possibile distinguere se i neuroni OB marcati sono il risultato di una modificazione genetica nelle cellule B1 o loro progderivati ​​enitor. Nel caso di esperimenti in cui è infetto solo la ependima, celle B1 e la loro progenie non sono etichettati con il giornalista e quindi neurogenesi o oligodendrogenesis non possono essere rintracciati. Tuttavia, si può usufruire di ritenzione BrdU per analizzare B1-NSC neurogenesi dipendenti alla OB o oligodendrogenesis al corpo calloso, nonché l'attività proliferativa delle NSCs lentamente si dividono in V-SVZ dei topi infettati. Per esempio, i topi può essere iniettato con BrdU seguendo protocolli precedentemente pubblicati ^{17 10} giorni dopo l'infezione con i LV e permesso di sopravvivere per 21 giorni. Rilevamento BrdU nel calloso OB / corpus può quindi essere utilizzato per determinare il tasso di neurogenesi / oligodendrogenesis, mentre la ritenzione BrdU nel V-SVZ può essere preso come una stima del numero di B1-cellule attivate ^13.

Il procedimento qui descritto può essere utilizzato per l'espressione di geni di interesse per il guadagno di funzione exesperi- ma può essere utilizzato anche per la consegna di mettere a tacere costrutti base di RNA interference o per la fornitura di cre ricombinasi costrutti per inattivare linea germinale alleli floxed trasmessi nelle cellule V-SVZ. Inoltre, questa tecnica può anche essere impiegato per la modifica del genoma CRISPR mediata se l'iniezione di RNA guida lentivirus-single viene usato in combinazione con un Cre-dipendente Rosa26 Cas9 topo Knockin ^25.

Critical punto 1:. La produzione di lentivirus e manipolazione in vivo le applicazioni di trasferimento genico con LV in aree specifiche del cervello richiede preparativi alto titolo di vettore, in quanto solo i volumi molto piccoli possono essere iniettati stereotaxically senza danneggiare il tessuto cerebrale. preparazioni lentivirali bisogno di essere purificati ed efficiente concentrato prima dell'iniezione nel cervello a causa del fatto che VL sono generati in sistemi di co-trasfezione transiente. La procedura descritta nel presente documento è il livello di biosicurezza 2, quindi tutte le procedure cherichiedono la manipolazione di virus vengono eseguite in strutture BSL2. personale di ricerca devono essere adeguatamente qualificato e preparato in tutte le procedure. Inoltre, la chirurgia deve essere eseguita da ricercatori una formazione completa seguenti routine approvati dalle autorità locali per il benessere degli animali, e dovrebbe essere fatto in condizioni asettiche con strumenti sterilizzati correttamente nel livello di biosicurezza 2 aree. Un adeguato pre-operatoria e post-operatoria cura degli animali deve essere effettuata e dovrebbe essere in conformità con le pratiche mediche e di cura veterinaria stabilite. Più in particolare, devono essere prese tutte le precauzioni per ridurre al minimo il dolore e lo stress inflitti all'animale compresa l'amministrazione di anestesia e analgesia. Ogni passo per quanto riguarda l'uso di virus negli animali deve essere autorizzato dalle autorità istituzionali e svolta in conformità alla normativa vigente. Dispositivi di protezione individuale deve essere indossato, tra cui un abito, guanti doppie e protezione per gli occhi adatto. pinnaalleato, tutti gli strumenti e le superfici che potrebbero essere stati a contatto con i virus devono essere accuratamente decontaminati secondo le facility's approvate pratiche di disinfezione (strofinando con etanolo al 70%, il 10% di candeggina e / o autoclave).

Nella nostra esperienza, il metodo del calcio fosfato di trasfezione è una tecnica molto efficiente ed economico per introdurre DNA in cellule 293T. Tuttavia commerciali reagenti di transfezione di DNA possono essere utilizzati anche come da protocollo del produttore in questa fase. Questo protocollo è ottimizzato per la raccolta del surnatante virale a 30 ore dopo la sostituzione dei supporti delle cellule 293T. surnatante lentivirali può anche essere raccolte 24 e 48 ore dopo la sostituzione dei media. Tuttavia, nella nostra esperienza di una singola raccolta al 30 hr produce un alto titolo lentivirus vettoriale.

Critical Fase 2: esempio pratico dei calcoli del titolo vettore utilizzando la formula:% GFP ⁺ / 100 x numero di cellule infette x diluizione FActor (DF) = unità di trasduzione (TU) / ml. In questo esempio, 5 x 10 ⁴ cellule (293T) vengono seminate al giorno precedente permettendo la trasduzione di 10 ⁵ cellule. Dopo aver ottenuto la% di cellule trasdotte in citometria a flusso come descritto nel protocollo, due valori di cellule trasdotte sono scelti per i calcoli, quelli dei corrispondenti alle diluizioni in cui la trasduzione è né saturi né troppo bassa. Per esempio: Fattore di diluizione 10 ^-6 cedere 8,08% cellule infette, e fattore di diluizione ¹⁰ -5 resa a cellule 61.78% infette. Il titolo è la media dei valori forniti dall'applicazione della formula utilizzando i valori delle cellule trasdotte e il suo corrispondente fattore di diluizione. In questo esempio:

Titer per il fattore di diluizione 10 ^-6 = (8.08 / 100) x 100.000 x 10 ⁶ = 8.08 · 10 ⁹ TU / ml

Titer per il fattore di diluizione 10 ^-5 = (61.78 / 100) x 100.000 x 10 ⁵= 6,178 · ¹⁰ 9 TU / ml

Medio = [(8,08 + 6,178) / 2] · ¹⁰ 9 = 7.1 · ¹⁰ 9 TU / ml

passo fondamentale 3: l'iniezione stereotassica. Il metodo qui descritto si basa sull'utilizzo di bassi volumi di alti titoli di LV consegna stereotassica guidata in posizioni specifiche. Le coordinate stereotassica previste da questo protocollo sono state stabilite per topi C57 / BL6 e non possono essere adatti per gli altri ceppi di topi. coordinate stereotassica dovrebbero essere determinati per ogni razza ed età utilizzando un colorante come il verde veloce prima dell'esperimento. Per fare questo, il colorante viene iniettato e dopo il mouse viene sacrificato, il cervello viene estratto e congelato per 1 Hrat -20 ° C. Una volta che il cervello è indurito, può essere affettato con una lama al sito di iniezione e osservata sotto un microscopio da dissezione per determinare se il sito di iniezione è ottimizzato per fini sperimentali specifiche.

passaggio criticoi tempi di sopravvivenza post-: 4. tempi post-sopravvivenza saranno diverse a seconda del sito di iniezione. Un tempo di sopravvivenza a lungo termine permette tessuto cerebrale di recuperare dalla lesione iniezione e, soprattutto, le cellule osservate nelle RMS e OB dopo 60 giorni sono derivati ​​del relativo quiescente B1-NSC. Le iniezioni nel ventricolo laterale non fisicamente danneggiano il V-SVZ. Pertanto, un periodo di 15 giorni è sufficiente a garantire l'espressione dei transgeni dalle cellule ependimali.

passo fondamentale 5: tempi post-fissazione. Un'eccessiva post-fissazione del tessuto cerebrale può generare mascheramento di alcuni antigeni, dovuta all'attività reticolazione dei reagenti, come paraformaldeide. Questi sono buoni a preservare struttura cellulare, ma può ridurre l'antigenicità di alcune proteine ​​come la reticolazione può ostruire legandosi alla epitopi anticorpi. Possono essere necessarie tecniche Antigen recupero, in particolare se vi è un tempo di incubazione lunga fissazione o se un'alta percentuale di reticolazione fixative viene utilizzato. In alternativa, periodi più brevi di post-fissazione 1 ora risultano insufficienti nella nostra esperienza per mantenere la struttura del tessuto oltre a garantire una buona antigenicità all'interno delle cellule senza l'uso di procedure dell'antigene recupero di.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 1: Generation of LV for in vivo delivery.
Equipment:
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW-55
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adapters	Beckman Coulter	358156
6-well plate	SPL	PLC-30006
24-well plate	SPL	PLC-30024
10 cm dish	SPL	PLC-20101	100 x 20 style
FACS tubes	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Cup sterile FACS filter	BD	340626	30 µm
Nitrocellulose filter	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm
Flow cytometer	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Steritop filter	Biofil	FPE-204-500	0.22 µm
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmid	Addgene	#12251	Core packaging plasmid
pRSV.REV plasmid	Addgene	#12253	Core packaging plasmid
pMD2G plasmid	Addgene	#12259	Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid	Addgene	#12252	Transfer vector plasmid
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	For HeLa cell culture
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	For 293T cell culture
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-free, 0.2 µm sterile-filtered
2x HBS			0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferably not MilliQ). Adjust pH to 7.0 with NaOH solution (Calbiochem, 567530).
Fetal bovine serum (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock solution at 100x, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 10x.
Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513-100	Stock solution at 200 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 6 mM.
Sodium pyruvate	Life technologies	11360-039	Stock solution at 100 mM, used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Used to prepare 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	Stock solution contains 5,000 units/ml penicillin and 5 mg/ml streptomycin. Used to prepare HeLa and 293T culture medium at a final concentration of 1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	With phenol red, contains 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Phosphate buffered saline  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Without calcium chloride and magnesium chloride, 10x, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture. Stock solution used to prepare 1x PBS in cell culture grade water.
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	H9268	Powder. Prepare a 1,000x stock solution at 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 2: Sterotaxic injection of LV into the SEZ proper or the lateral ventricle.
Equipment:
Vernier stereotaxic instrument	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse and neonatal rat adaptor	NeuroLab, Leica	39462950
Syringe holder	KD Scientific	KDS-311-CE
33 gauge syringe	Hamilton	P/N    84851/00	#85RN
Electric drill	Fine Science Tool	98096
Thermal blanket	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver	Jata	MP373N	Model: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Comercial solution at 1 mg/ml.
Ketamine	Merial	Imalgene 500	Comercial solution at 50 mg/ml
Medetomidina/ketamine mixture			Prepare a working mixture of medetomidine at a final concentration of 0.2 mg/ml dilution and ketamine at a final concentration of 15 mg/ml in saline solution. Use as anesthesia injecting a volume to get a final concentration of 0.5-1 mg medetomidina per kg body weight and 50-75 mg ketamine per kg body weight
Butorphanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution at 10 mg/ml. Used as analgesia at 1 mg/ml in saline solution.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Stock solution at 5 mg/ml, used in a final concentration of 0.5 mg/ml in saline solution to exit from anesthesia.
0.9% saline solution	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Topical skin adhesive
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Surgical marker pen	Staedler	313-9	Permanent lumocolor
Ophthalmic lubricant		SICCAFLUID	0.5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodine	Betadine	694109.6	10% povidone-iodine
Name	Company	Catalog Number	Comments
Part 3: Histological analysis.
Equipment:
Automatic peristaltic pump	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variable-speed economy drive, 1.6-100 rpm, 230 V
Pump head	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Masterflex L/S Easy-Load pump head for precision tubing; PSF housing, CRS rotor
Silicone tube	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Scalp vein set	Vygon V-green	70246.05T	25 G, 30 cm tube length
Vibratome	Leica	VT1000
Confocal microscope	Olympus	FluoView FV10i
Hot plate	Tehtnica	SHP-10
Reagents:
Phosphate buffer (PB)			0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) and 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, adjust pH to 7.2-7.4
Paraformaldehyde (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare fresh every time. Heat dH2O up to 55–60 °C using a hot plate placed in a fume hood and pour PFA powder while stirring to obtain an 8% solution. The solution is cloudy white as PFA does not dissolve easily. Add 1N NaOH drop by drop just until the solution clears. Cool down, filter through Whatman paper and add an equivalent volume of 0.2 M PB.
Saline solution			0.9% NaCl in dH2O
Superglue	LOCTITE	767547
Sodium azide	Panreac	122712.1608
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100
Normal goat serum	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergent
Anti-GFP rabbit antibody	ROCKLAND	600-401-215	Use at a 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular probes	A-21206	Use at a 1:750 dilution
6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Fluorescent nuclear staining. Use at 2 mg/ml in ddH2O. Keep in the dark at 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mounting medium for fluorescent preparations