Introduction
Durante o desenvolvimento embrionário, a morfogénese do tecido e órgão ter lugar através de um programa precisa que pode ser descrito em termos de proliferação celular, a migração celular e especificação linhagem 1-4. Estes processos biológicos estão também envolvidas na manutenção da homeostase dos tecidos adultos, o que requer a regeneração de células estaminais. Rastreamento de linhagem, a identificação e rastreio dos descendentes de um tipo específico de população celular, fornece uma importante ferramenta para o estudo da embriogênese e haste homeostase celular. Com efeito, é cada vez mais a ser utilizado em muitos campos da investigação. Particularmente, o rastreamento linhagem tornou-se uma ferramenta essencial na identificação da origem e destino das células-tronco na homeostasia e câncer desenvolvimento. Isto é porque pode fornecer informação essencial sobre a célula comporta-se como no contexto do tecido ou organismo intacto, com um mínimo de intervenção experimental, em contraste com o isolamento de células e cultura in vitro ou transplantatiem que pode resultar em viés indesejado.
Tradicionalmente, os corantes tais como carbocianina solúvel em lípidos, que incorporam-se na membrana plasmática das células, foram utilizadas para o traçado da linhagem. Embora estes tipos de experiências conduziram com sucesso a grandes descobertas e conceitos seminais conformados na biologia do desenvolvimento 5,6, eles têm algumas limitações, incluindo a dificuldade em controlar a especificidade das células alvo, o impacto indesejado do corante no comportamento das células e a diluição do rótulo ao longo do tempo. Nucleotídeo abordagens de rotulagem análogo permitiram documentar a existência de-ciclismo lento "etiqueta reter células" que presumivelmente correspondem às células-tronco quiescentes 7,8. No entanto, embora esta técnica foi demonstrada a presença de células em divisão lenta com base na cinética de proliferação ao longo de um período de tempo limitado não poderia fornecer informações importantes sobre a funcionalidade das células estaminais. Um meth linhagem rastreamento idealmeto- deve minimizar o efeito de rotulagem sobre as propriedades da célula marcada, a sua progenitura, ou os seus vizinhos. Além disso, seria benéfico ter controlo sobre a rotulagem de indução, isto é, ter a capacidade de codificar a população de células de interesse numa fase e tempo de forma dependente, bem como de uma maneira única célula (clonal). Um método de marcação estável e irreversível, que é passada para toda a progenia da célula fundador é importante para que a etiqueta seria retido ao longo do tempo, e não será transferida para as células vizinhas.
Mais recentemente, foram desenvolvidas abordagens genéticas da marcação celular. Nestes sistemas, os promotores específicos de células podem ser usadas para desencadear a expressão da recombinase Cre, a fim de remover um bloqueio flanqueado-loxP e permitir a expressão dos genes repórter, tais como a proteína fluorescente verde ou Β-galactosidase genes repórter 9-13. Essa abordagem permite não só o acompanhamento das células e sua progênie, mas também permite celular éolation e caracterização molecular. Rastreamento celular ao nível da célula única tornou-se possível pela indução da expressão de um único gene repórter fluorescente. Uma limitação importante deste sistema é o facto de que apenas quando muito baixa percentagem de células é marcado, é possível separar e rastrear clones individuais. Para superar esta limitação repórteres multicolor pode ser usado. Ao usar rotulagem multicolor, o rastreamento do destino diferencial das células vizinhas no mesmo nicho pode ser alcançado de forma eficiente 14-17. Recentemente, uma variedade de Brainbow (BR) alelos foram desenvolvidos para o rastreio de linhagem experiências, permitindo uma expressão estocástica de vários genes repórter fluorescentes, utilizando o sistema Cre / lox. O sistema Cre / lox consiste da enzima Cre recombinase, o qual reconhece e se liga a sequências de ADN específicas, tais como locais loxP. Após a ligação da recombinase Cre, ocorre recombinação específica do local, que faz com que as sequências de remoção de loxP flanqueado resulting na expressão aleatória de diferentes proteínas fluorescentes (o mecanismo é descrito abaixo). Uma variedade de linhas Br estão disponíveis para uso (ver comentários 16,18,19). As principais diferenças entre as estirpes Br incluem: (i) as diferenças no número de genes fluorescentes incluídos na cassete, variando de 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) a 4 (BR1.1, Br2.1) genes fluorescentes , (ii) a presença de locais lox mutuamente orientados para permitir a inversão do gene (Br2.0-2.1), (iii) o tipo de locais lox utilizados, e (iv) a expressão ou silêncio da expressão do gene fluorescente antes da activação Cre. O Br3 recentemente criada oferece um método melhorado para multicolor imagens de neurônios. Uma das principais características deste transcrito é que ele contém um novo conjunto de proteínas fluorescentes farnesilada fotoestável, que permitem uma coloração mesmo dos melhores neuronal processa 20.
Mais importante, as versões de diferentes cassetes de Br podem conter o específico neuronal Thy1 PRomoter ou o ubiquamente expresso CAG (CMV). Finalmente, enquanto alguns dos ratinhos transgénicos Br pode conter um único transgene Br, outras podem consistir de várias cópias do transgene, permitindo assim a produção de um imenso número de possibilidades de combinações de cores a serem expressos em cada célula (por exemplo, ver 16).
Em nosso estudo, utilizamos o mouse R26R-Confetti que contém a cassete Br 2.1 21. Br2.1 destina-se exclusivamente para permitir que as inversões de ADN mediada por Cre e não só porque as excisões da orientação recíproca dos locais loxP (Figura 1). Assim, esses eventos inversão / excisão que levam à mudança de cor pode continuar enquanto Cre está presente 16. Por essa razão, um sistema de expressão de Cre temporais indutível é essencial para o rastreamento de células fiável utilizando Br2.1. Tal como mostrado na Figura. 1, o Br2.1 contém um promotor ubíquo CAG seguido por flanqueado-loxP NeoR -cassette, que actua como uma barreira de transcrição, que é seguido por 4 fluorescentes genes repórter, que codifica para verde (GFP), amarelo (YFP), vermelha (RFP) e ciano (PCP) proteínas fluorescentes, posicionados em duas tandem. Nenhuma fluorescência é expressa antes da activação Cre. A indução da recombinase Cre faz com que a remoção da cassete neo-R permitindo a expressão aleatória de uma das proteínas fluorescentes em 4 de uma determinada célula. O primeiro segmento contém GFP flanqueado-loxP e um YFP invertida, enquanto que o segundo segmento contém RFP flanqueado-loxP e um PCP invertida. Estes segmentos de ADN podem ser continuamente invertido (usando loxP que está na orientação inversa), ou excisados, contanto que a recombinase Cre se encontra presente. Portanto, um transgene Cre transiente e controlada deve ser utilizada. A cassete Br2.1 fornece um excelente sistema para distinguir entre as emissões de sobreposição com a localização do sinal: a expressão de YFP e RFP é citoplasmática, a GFP é nuclear e PCP está ligada à membrana celular. GFPe emissões RFP são facilmente separados por microscopia de fluorescência convencional. A fim de separar as emissões YFP / GFP / CFP, é necessário um sistema de imagem confocal espectral. No total, a cassete Br2.1 permite a expressão específica aleatório, indutivel, e tecido de um de quatro genes fluorescentes distintas em cada uma das células alvo. De facto, quando é necessário um maior número de combinações de cores, pode-se gerar murganhos homozigóticos que contêm alelos de Br2.1 2, resultando assim na expressão de 2 etiquetas de cor para cada célula e no aumento do número de combinações possíveis de cores para 10 22. Algumas das estirpes de ratinho Br permitir a expressão de um muito maior número de possíveis combinações de cores desde que múltiplas cópias da cassete foram integradas no seu genoma 16. No entanto, na maioria dos casos, as quatro combinações de cor fornecidos por um único alelo Br2.1 são suficientes. Seguindo o protocolo proporcionado aqui, pode-se estabelecer esse método utilizando uma configuração relativamente simples de Spectrmicroscopia al com pouca ou nenhuma necessidade de calibração.
Aqui nós fornecemos um protocolo adaptável para a utilização dos ratinhos R26R-confetes que contêm um único alelo Br2.1, para o rastreio de linhagem experiências do epitélio da córnea. Esta estirpe de ratinho transgénico tem sido utilizada para estudar a origem e o destino dos dois pontos 21,23 e células estaminais epiteliais da córnea 22,24, a presença de actividade de células estaminais no cancro intestinal 25, e para a caracterização de podócitos renais em glomerulosclerose focal e segmentar (FSGS) 17.
Protocol
Declaração de Ética: Neste estudo cuidados com os animais e uso foram conformados com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética local.
1. Escolha um Cre-recombinase adequados Expressando Rato Strain
- Fora da grande variedade de linhas transgénicas Cre disponíveis para aquisição 26 e, dependendo do tecido alvo a ser investigado, escolher um ratinho transgénico Cre estirpe em que o gene da recombinase Cre é controlado por um promotor que é específico para o tecido de interesse. Em caso é necessário controle temporal, escolher uma linha de Cre induzível.
Nota: Nós escolhemos o tamoxifeno induzível transgene K14-Cre ERT para rotular especificamente células-tronco / progenitoras epiteliais do limbo e córnea 24. Note-se que pode haver diferenças entre as linhagens, como Di Girolamo e colegas de trabalho relataram especificidade de limbo sem expressão da córnea para o seu K14-Cre ERT 22. Uma vantagem de usar indutíveis ratinhos transgénicos Cre é que ele permite a indução da linhagem rastreio em intervalos de tempo versáteis.
2. Escolha um Adequado Br Rato Strain
- Escolha a cassete Br apropriado, dependendo da pergunta de pesquisa e disponível Cre linha 16,18,20.
- Se um não-indutível Cre rato estirpe é utilizado, escolha uma cassete Br que não permite contínuas de DNA inversões / excisões e, assim, dar origem a produtos sem saída (por exemplo Br1.0 ou BR1.1) 16.
3. Cruze os transgênicos Linhas de interesse
- Para o protocolo mostrado aqui, atravesse a homozigoto R26R-Confetti estirpe (Br2.1 / Br2.1) com o homozigoto Cre ERT estirpe (ERT Cre / Cre ERT) para obter descendentes hemizigóticas (Br2.1 / +; Cre / +) que estão prontos para rastreamento como todos eles contêm um único alelo Br2.1 mono-allelic linhagem e umalelo Cre único.
Nota: Para aumentar a eficiência de marcação, pode-se gerar ratinhos que contêm dois alelos Cre (Br2.1 / +; Cre / Cre), enquanto dois alelos Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) seria aumentar combinações de cor (tal como detalhado em 22).
4. Indução recombinase Cre
Nota: A administração de tamoxifeno nestas experiências foi efectuada por injecção intraperitoneal diária, para a duração de 3-4 dias, de modo a induzir a translocação da recombinase Cre ERT para o núcleo de limbo e córnea haste basal K14-positiva / progenitoras células epiteliais. O protocolo seguinte pode ser utilizado para a injecção de quatro ratinhos. Alternativamente, a aplicação tópica de Tamoxifen à superfície ocular produz uma eficiência mais elevada. A solução Tamoxifeno pode ser mantida no escuro a 4 ° C durante até uma semana. Aquece-se a solução antes de usar.
- Pesar 100 mg de Tamoxifeno e dissolvê-la em 5 mL de óleo de milho aosformar um / ml solução tamoxifeno 20 mg.
- Injectar 200 ul de solução de tamoxifeno (4 mg) por via intraperitoneal a 8 semanas de idade os ratinhos durante 3-4 dias consecutivos.
Nota: A solução de tamoxifeno pode ser mantida no escuro a 4 ° C durante até uma semana. Aquece-se a solução antes de usar. - Para aplicação tópica: pesar 60 mg de Tamoxifeno e dissolvê-lo em 1 ml de óleo de milho de modo a formar uma solução / ml de tamoxifeno 60 mg. Vortex e definir a solução num banho de água com agitação mantido a 65 ° C até que se torne evidente que Deixar no banho até à sua utilização.
- Aplicam-se cuidadosamente 100 ul da solução de tamoxifeno para cada superfície ocular do rato.
5. Preparação do tecido for Imaging
- Sacrifício animais utilizando isoflurano (2% vaporizado em oxigénio) anestesia (confirmar anestesia adequada pela ausência de reflexos) seguido por inalação de CO 2 em pontos de tempo apropriados após a injecção e col Tamoxifenoleccione o tecido relevante.
- Para estas experiências, enuclear olhos nos seguintes momentos: 1, 4, 8, 12, e 16 semanas após a injecção Tamoxifen. Alcançar enucleação usando uma pinça curva. Pressione as pálpebras, causando o globo ocular saltar para fora da cavidade ocular. Coloque a pinça por trás do globo ocular, segurando o nervo óptico. Puxe delicadamente o globo ocular e retirá-la.
Nota: Nesta fase, como descrito abaixo, os tecidos podem ser preparadas para análise wholemount de células marcadas. Cortes de tecido congelados regulares também podem ser preparadas, fixadas em PFA e fotografada como descrito a seguir (ver secção 6 e 22).
- Para estas experiências, enuclear olhos nos seguintes momentos: 1, 4, 8, 12, e 16 semanas após a injecção Tamoxifen. Alcançar enucleação usando uma pinça curva. Pressione as pálpebras, causando o globo ocular saltar para fora da cavidade ocular. Coloque a pinça por trás do globo ocular, segurando o nervo óptico. Puxe delicadamente o globo ocular e retirá-la.
- Coloque cada olho em um prato de 60 milímetros encheu-se com PBS.
- Sob um microscópio estéreo usando fórceps segurar o olho perto do nervo óptico com a córnea voltado para baixo e usar um bisturi de forma a remover o nervo óptico, músculo e tecido conjuntivo e fazer uma pequena incisão na parte posterior do olho.
- Com uma tesoura primavera cuidadosamente ampliarcortados deixando a lente pop fora e remova a íris com a pinça.
- Aplanar a córnea, fazendo incisões 4-5 radiais a partir do centro para a periferia, usando um bisturi.
- Usar um bisturi para cortar o tecido periférico em excesso para além do limbo.
- Fix córneas em PFA a 4% durante 10 min, em seguida, lavá-los rapidamente com PBS.
- Incubar as amostras com DAPI durante 10 min e lavar rapidamente com PBS.
- Montagem de córneas em lâminas de vidro com o lado epitelial para cima. Coloque uma gota de montagem de mídia em cima da córnea e tampa com uma tampa de vidro. Deixe secar lâminas O / N em RT. Manter as lâminas a 4 ° C.
6. microscopia confocal e Análise de Imagem
- Use um sistema confocal espectral, que permite a separação das emissões YFP / GFP / CFP. Conjunto de comprimentos de onda de excitação e de emissão de fluorescência em função das proteínas fluorescentes da cassete Br. Escolha o comprimento de onda de excitação mais adequado para cada proteína visando minimizar cruzexcitação. Escolha de emissão gamas estreitas, a fim de minimizar a fuga dos sinais a partir de diferentes proteínas.
- Para a cassete Br2.1, use o seguinte configurar de excitação de fluorescência (ex) e de emissão (em) como ponto de partida: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, e RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
- Para visualizar grandes áreas de tecidos com alta resolução, aquisição de imagens lado a lado. Para os resultados apresentados na Figura 2A-B, imagem toda a córnea através da obtenção de uma matriz de 12 x 12 imagens, isto é, campos adquirir 144 (512 x 512) utilizando 4 canais fluorescentes em cada campo. Ao todo coletar 576 imagens e, em seguida, mesclar.
- Para explorar a localização das células marcadas em diferentes profundidades e estruturas do tecido, adquirir imagens Z-stack de diferentes regiões de interesse. A fim to imagem a profundidade da córnea, adquirir 8 seções ópticas a 3 mm intervalos. Vistas ortogonais das secções recolhidos, bem como projeções de imagens com base em intensidades máximas podem ser construídas utilizando softwares de imagem convencionais 24.
7. Corneal Lesão combinado com tamoxifeno Indução
- Anestesiar ratos com isoflurano (2% vaporizado em oxigénio) e administrar analgésicos (10 mg / kg, injectado subcutaneamente Carpofen). Confirme anesthetization adequada por falta de resposta aos pés-pitada.
- Pesar 1 g de pó de tamoxifeno e dissolvê-la em 5 mL de DMSO estéril para produzir 200 mg de solução de concentração / ml.
- Aquece-se a solução Tamoxifeno até 65 ° C num banho de água até que a solução se torne clara. Manter a solução em banho até à sua utilização.
- Aplicar pomada ao olho contralateral não tratado para evitar a desidratação durante a anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado con suficienteperda de consciência para manter decúbito esternal. Não devolva ratos que tinham sido submetidos a olho ferindo a companhia de outros ratos até que esteja totalmente recuperado. Os ratos devem ser cuidadosamente monitorizados após a lesão. Em caso eles perdem mais de 10% do seu peso corporal, sofrem erosão da córnea ou desconforto, a experiência deve ser interrompido. Administração analgésicos Repetir a cada 24 h durante todo o experimento.
- Utilizando uma seringa esterilizada, sem uma agulha ligada a ela; aplicar 200 solução ul Tamoxifen topicamente sobre toda a superfície da córnea de um olho de cada rato.
Nota: A solução líquida solidifica rapidamente sobre a superfície do olho, à TA. O efeito da lesão da córnea depende da gravidade da ferida. Após uma aplicação de solução de tamoxifeno / DMSO não há efeitos adversos são observados nos ratos. No caso de aplicações repetidas opacidade da córnea pode ser observada. - Continue com a preparação do tecido e de imagem (ver seitaíons 5 e 6) em momentos relevantes. Para os resultados apresentados aqui, sacrificar os ratinhos (como detalhado na fase 5.1) uma semana após o ferimento (Figuras 2 e 24).
Representative Results
Recentemente, teve como objetivo identificar a origem, sobrevivência e migração das células-tronco e células progenitoras do epitélio corneano 24. O acúmulo de evidências suporta o dogma de que o epitélio corneano é regenerado por células-tronco localizadas exclusivamente no nicho de limbo, uma zona em forma de anel na periferia da córnea. Esta teoria é apoiada por in vitro e in vivo de dados, e por evidência clínica de que forneceu a base para o sucesso da terapia pioneira tronco do limbo celular 27-29. No entanto, este tema permaneceu muito debatido nos últimos anos, devido a um estudo com base em experiências do limbo de enxertia que sugeriam que o limbo do mouse não participa na renovação da córnea 30. Para testar esta hipótese interessante, rastreamento de linhagem experimentos usando camundongos R26R-Confetes foram realizados, para seguir o destino das células-tronco epiteliais / progenitoras do limbo e córnea sob condições de estado estacionário para até 120 dias 24.Os olhos foram enucleados e-montagem planas córneas foram analisadas por microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser espectral 10 e 120 dias após a injecção de Tamoxifen. Como esperado, pequenos grupos de células fluorescentes esporádicos foram observados ao longo da superfície ocular de 10 dias após a injecção, enquanto 1-4 meses mais tarde (Figura 2B e 24), estrias alongadas que se estendem a partir do limbo em direcção ao centro da córnea desenvolvido lentamente. Este resultado sugere que a córnea é regenerado por células que migram a partir do limbo em direcção ao centro da córnea. Em seguida, a regeneração da córnea sob condições ferindo foi examinada. A fim de testar o destino das células corneais limbares / K14-positivos sob condições ferindo enquanto induz rastreamento célula eficiente, dissolveu-se o tamoxifeno em dimetil sulfóxido (DMSO), o que provoca lesão da córnea após a aplicação tópica. Desta forma, conseguimos induzir ferimento leve se uma única aplicação tópica foi aplicado (Figura 2C), mo derate ferindo se sozinho tratamento adicional DMSO foi aplicado no dia antes da indução da ferida grave ou tamoxifeno quando DMSO sozinho foi aplicada topicamente em 2 dias antes da indução sequencial de Tamoxifen.
Em contraste com as listras do limbo finas que lentamente desenvolvidos e atingiu o centro da córnea no prazo de 4 meses sob condições de estado estacionário, a migração celular após lesão foi rápida. Notavelmente, listras limbo longos e grossos já foram desenvolvidos sob estas condições dentro de 7 dias. Curiosamente, a diversidade de cores, por vezes, foi mínima (Figura 2D). Nas nossas mãos, ocasionalmente, principalmente as células vermelhas foram identificados em toda a córnea, o que indica que a cor diversidade pode ser inclinado para fluoróforos específicos. Este desvio indesejado pode ser calibrado por meio de testes de resposta à dose como relatado anteriormente em Br1.0L 31 e 21 em Br2.1.
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Figura 1. Representação esquemática da construção R26R-confetes. (A) A construção R26R-confetes contém um promotor de CAG para elevados níveis de expressão, um loxP (triângulo preto) -flanked NeoR -roadblock e a cassete no locus Brainbow2.1 Rosa26 16,21. A cassete Brainbow2.1 inclui dois head-to-tail dímeros ladeado-loxP. Um dímero é composto de proteína nuclear localizada verde fluorescente (GFP) e uma proteína fluorescente amarela citoplasmática orientada a inversa (YFP, a orientação inversa é designado - PFY). A segunda dímero contém RFP citoplasmática e uma membrana-tethered proteína fluorescente ciano-oriented reversa (PCP, a orientação inversa é designado - PFC) 16. (B - E) Após a ativação Cre-recombinase, diferentes eventos de excisão e de inversão pode ocorrer; resultados possíveis são exemplified em B - E. A atividade Cre induz rearranjo estocástica da cassete levando a mudanças genéticas e / ou inversões e, portanto, resulta na expressão aleatória de um dos quatro proteínas fluorescentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Corneal linhagem rastreamento sob a homeostase e do prejuízo. R26R-confetti / murganhos K14-Cre foram injetados com 4 mg Tamoxifeno como detalhado no protocolo. Na hora indicada pontos após a indução achatada córneas foram fotografadas (A - B). Ferimento da córnea associada com a indução de Cre foi conseguida através da aplicação tópica de Tamoxifen dissolvido em DMSO (C - D). Imagens de mosaico obtidopor multicanal telha microscopia confocal espectral são mostradas (A - D). Na homeostase, listras limbo radiais de células que migram lento estendido entre o limbo e do centro da córnea. Essas faixas desenvolveu-se lentamente, atingindo o centro da córnea dentro de 4-5 meses (B). Aglomerados de células da córnea foram bem evidentes (setas brancas, B). Em contraste, grandes estrias limbo apareceu dentro de uma única semana sob condições ferindo (C). Um exemplo para a polarização da diversidade de cor para as células vermelhas (D). A fronteira de limbo-corneano é anotada por uma linha tracejada. Barra de escala é de 500 mm. Abreviaturas: PCP, proteína fluorescente ciano; GFP, proteína fluorescente verde; RFP, proteína fluorescente vermelha; YFP, proteína fluorescente amarela. Esta figura foi modificada a partir de 24. Por favor clique aqui para ver uma versão maioresta figura.
Discussion
Experimentos descrever a linhagem foram realizados durante muitos anos. Os recentes avanços tecnológicos eo surgimento das cepas Confetti rato abriu novos caminhos para a pesquisa. Hoje, os pesquisadores podem se beneficiar de um grande número de linhas disponíveis comercialmente Cre de tecidos específicos, camundongos knockout e ratos transgênicos. Isso fornece uma oportunidade para a concepção de sistemas experimentais versátil para abordar questões científicas com experiência básica, evitando a prática laboriosa, ao fornecer dados robustos e confiáveis.
Camundongos R26R-Confetti são uma ferramenta elegante para acompanhar e estudar a natureza eo comportamento das células em um organismo vivo eficiente. O sistema é fácil de estabelecer e permite o rastreamento de linhagem não-invasiva de células individuais durante a embriogênese, caule regeneração celular sob a homeostase, ou sob circunstâncias diferentes, como lesão, inflamação e câncer. Os dados obtidos fornece um descritivas robustaião de sobrevivência de células alvo, a expansão clonal de células e a migração de células, de um modo quantificável. Um passo crítico seria escolher o mouse estirpe genética apropriada que pode permitir de forma confiável rotulagem específica de tecido eficiente em um estágio de desenvolvimento precisa. Uma limitação deste sistema é que, para monitorização de um organismo vivo, o tecido deve ser acessível e transparente. Da mesma forma, o acompanhamento de um tecido grosso dentro de um animal vivo só pode ser facilitada por dois fótons ou microscopia multi-fotão. No entanto, é possível rastreamento de células em secções de tecido post-mortem, e talvez o tecido intacto pode ser estudado após ele ter sido transformado para se tornar transparente pelo método Clareza 32,33. Outra limitação a ser considerado é que embora as células adjacentes que expressam o mesmo fluoróforo provável pertencem à mesma linhagem clonal, é também possível que eles podem ser derivados de origem celular independente que expressa de forma aleatória do mesmo gene fluorescente. Esta possibility se torna muito pouco provável ao usar vários alelos Br para permitir inúmeras combinações de cores.
No futuro, combinando o sistema confetes com ferramentas genéticas disponíveis (ou seja, ko, modelos de ratinhos transgénicos e knockin) permitirá o estudo de genes e das suas mutações na saúde e na patologia. Da mesma forma, a linhagem rastreamento sob diferentes perturbações do sistema (ou seja, caule destruição nicho de células, laser mediada ablação de células, o tratamento medicamentoso) trará novos insights sobre o envolvimento de vias de sinalização nas decisões do destino da célula. Em última análise, o uso combinatória de marcação fluorescente e bioluminescência, repórteres genéticos de vias de sinalização e de corte microscopia borda irá fornecer aos pesquisadores um sistema robusto para aprender como as células único responder ao seu redor em seu ambiente nativo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette | Jackson | strain #013731 | |
| K14-CreERT mice | Jackson | strain #005107 | |
| tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
| Carprieve 30 | b.wt | ||
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4 µg/ml |
| Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
| Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
| Duratears-eye ointment | Alcon |
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