Introduction
Inntil nylig var det post-natal generasjon av nye blodkar antas å oppstå utelukkende gjennom en prosess som kalles angiogenese, definert som spirende av nye skip fra endotelcellene av eksisterende fartøy. 1 Denne prosessen kontraster fra vaskulogenese, eller de novo dannelsen av blodkar fra endotel-forløpere, noe som ble antatt å skje utelukkende under embryogenese. 2. Imidlertid har nyere studier identifisert og isolert sirkulerende endoteliale progenitorceller (PP-) i perifert blod hos voksne. Disse cellene har evnen til å differensiere til modne endotelceller i kultur og antas å delta i postnatal vaskulogenese. 3,4
Protokoller for isolering og utvidelse av disse EPCs involverer typisk kultur av perifere mononukleære blodceller (PBMNCs) i media inneholdende endoteliale vekstfaktorer, inkludert vascular endotelial vekstfaktor (VEGF), og fibroblast vekstfaktor-2. 5-8 EPC kulturer produsere en rekke dramatisk forskjellige celletyper. Initial kulturer (<7 dager) er dominert av et monocyttisk celletype, som er kjent i litteraturen som "tidlig" EPCs. Til tross for sitt navn, er disse cellene uttrykker monocytt markør CD14, er negative for progenitor markør CD34 og uttrykker bare minimale nivåer av den klassiske endotel markørene CD31 og VEGF-reseptor 2 (VEGFR2). 5 Fortsatt kultur gir opphav til et sekundært populasjon av celler, kjent som sene utvekst EPCs eller blod utvekst endotelceller (BOECs), som vises som diskrete kolonier av endotelceller lignende celler. I motsetning til monocyttiske tidlige EPCs, BOECs, som også har blitt kalt endoteliale kolonidannende celler (ECFCs), utvekst endotelceller eller sen-utvekst endotelceller, oppviser den brostein morfologi som er typisk for endotel-cellemonolagene og er svært like i overflatemarkør5 og genuttrykk 9 til modne endotelceller.
Genereringen av endotel-lignende celler fra perifert blod byr på flere fordeler, særlig for studiet av endotelial celledysfunksjon i forbindelse med vaskulære forstyrrelser slik som pulmonal arteriell hypertensjon (PAH) 10 eller von Willebrands sykdom. 11 Før tilgjengeligheten av BOECs, endotelial Cellene kan bare bli avledet fra eksplanterte organer på tidspunktet for død eller organtransplantasjon, eller isolert fra navlevenen ved fødselen. Dette reduserte tilgjengelighet representerte en alvorlig begrensning for å forstå biologien til endotelceller fra pasienter med kardiovaskulære lidelser, så vel som interaksjonen mellom endotelceller og enten blodceller eller veggceller. Videre isolering og dyrking av en ren populasjon av endotelceller fra disse kildene er teknisk krevende og cellene avledet av disse metodene oppviser bare en Limited proliferativ kapasitet. BOECs gir derfor en verdifull surrogat for isolering og kultur av pasient-avledet primære endotelceller.
I tillegg til deres in vitro-applikasjoner, BOECs er også potensielt nyttige i autologe celle transplantasjonsterapi. Disse programmene inkluderer både endotelial celletransplantasjon for å fremme neovaskularisering (se 12 og referanser deri), samt generering av induserte pluripotente stamceller (iPSCs). 13 BOEC-avledet iPSCs kan brukes til sykdom modellering og har enormt potensial som utgangs materiale for autologe cellen terapi. BOECs omprogrammere raskere og med høyere virkningsgrad enn hudfibroblaster. Videre BOECs også gi rom for generering av iPSCs som er fri for karyotypic abnormiteter, som er en viktig funksjon i enhver teknologi som vil være egnet for translasjonsforskning applikasjoner. Evnen til å generere iPSCs fra en pasient blodprøve enlso eliminerer behovet for en hud biopsi og generering av hudfibroblaster, for derved å lette genereringen av celler fra pasienter med sårheling lidelser, eller de svært unge.
Protokollen beskrevet nedenfor, godkjent av og utføres i samsvar med retningslinjene fra Den nasjonale forskningsetiske Tjenesten Committee (East of England), gir en enkel og pålitelig metode for generering av BOECs med mer enn 90% effektivitet fra et relativt lite volum (60 ml) i perifert blod. Disse cellene er svært proliferativ og kan passaged gjentatte ganger, noe som åpner for generering av hundrevis av millioner av celler fra en enkelt blodprøve.
Protocol
En skjematisk av BOEC generasjon protokollen er vist i figur 1.
1. Blodprøvetaking og densitetsgradientsentrifugering
- For hver donor, tilsett 3 ml natriumcitrat til hver av to 50 ml koniske sentrifugerør. Samle 60 ml blod ved venepunksjon og tilsett 30 ml i hvert rør. Vend forsiktig 2-3 ganger for å blande. Bruke så lite som 40 ml blod i protokollen, med citrat volum justeres tilsvarende.
MERK: Det er viktig at blodprøver blir behandlet innen to timer av samlingen. Forsinket behandling av blod resulterer i en markert reduksjon i utvekst koloni yield. - Forbered nye koniske rør som inneholdt densitetsgradientsentrifugering medium ved først å snu flasken opp ned flere ganger for å blande. I en steril hette, tilsett 15 ml av densitetsgradientsentrifugering medium per 50 ml konisk rør (1 rør for hver 10 ml blod, 6 rør pr donor).
- Fortynne blodet 1: 1 med Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline (DPBS). Vippe røret som inneholder densitetsgradientsentrifugering medium til en vinkel på 20 ° med arbeidsflaten. Ved hjelp av en pipette hjelpemiddel og en 25 ml serologisk pipette, langsomt lag 21 ml fortynnet blod på toppen av medium ved gradvis tilsetning av blod ned veggen av skråstilt rør.
MERK: Dette vil minimalisere blanding av blodet med densitetsgradient sjiktet og vil produsere en strammere buffy coat, så vel som en forbedret utbytte. - Sentrifuger prøver ved 400 xg for 35 min ved RT med gasspedalen og bremsen off.
- I løpet av denne sentrifugering perioden, begynner kollagen belegg beskrevet i trinn 2.1 - 2.4. Sikre at disse trinnene er fullført før du fortsetter til trinn 3.1.
2. Kollagen Coating av T-75 Flask og klargjøring for kultur Medium
MERK: Utfør følgende trinn i en cellekultur hette.
- Forbered en 50 mikrogram / ml kollagen løsning ved å fortynne lager Type I kollagen i 10 ml 0,02 M eddiksyre. Eksempel: for kollagen lager ved en konsentrasjon på 4,05 mg / ml, tilsett 123,5 mL av kollagen til 10 ml 0,02 M eddiksyre. Sterilt filter kollagen suspensjon før bruk.
- Ved hjelp av en serologisk pipette, tilsett 7,5 ml av kollagen løsning på et T-75 cellekultur kolbe. Dette volum gir 5 ug kollagen / cm 2 (eller 375 mikrogram / kolbe). Coat kolbe i 1 time ved RT.
- Klargjør endotelial vekstmedium brukes for BOEC generasjon ved å supplere endothelial basal medium med vekstfaktor kosttilskudd gitt av produsenten. Legg alle kosttilskudd, men ikke legg serum. For å fremstille 15 ml BOEC generasjon medium, tilsett 2,5 ml definert føtalt bovint serum (FBS) til 12,5 ml av endotelial vekstmedium inneholdende vekstfaktor-tilskudd.
- Fortsett med fremgangsmåten under punkt 3. Etter en time belegg periode, aspirer kollagen løsning og vaske bort rester av eddiksyre ved pipetteringi 10 ml DPBS. Aspirer av DPBS og gjenta dette vasketrinn gang. Dersom cellesuspensjonen oppnådd i trinn 3.3 er ikke klar for plettering på dette tidspunktet, tilsett 5 ml BOEC generasjon medium til kolben for å holde kollagen belegget tørker ut.
3. Innsamling og plating av PBMNCs
- Etter densitetsgradientsentrifugering beskrevet i trinn 1.4, forsiktig samle buffy coat-lag med en steril plast overføring pipette. Samling av buffy coat bør gi omtrent 20 ml av cellesuspensjonen og plasma fra hvert rør. Unngå å overføre densitetsgradienten medium.
- Fortynne mononukleære cellesuspensjon 1: 1 i DPBS og invertere å blande. Sentrifuger ved RT i 20 minutter ved 300 xg med bremse- og gasspedalen ved maks.
- Etter sentrifugering, Aspirer supernatanten og resuspender cellene ved å tilsette 1 ml av BOEC generasjon medium til hver pellet og pipettering opp og ned flere ganger. Pool cellesuspensjonene end fyll totale volumet til 10 ml med de resterende medium.
- For å få et estimat av totalt celleantall, prøve 10 ul av cellesuspensjonen og fortynnet 50 ganger med 490 ul Turk løsning, som skal lyses de røde blodcellene. Telle en 10 pl prøve av den fortynnede cellesuspensjon ved bruk av et hemocytometer.
MERK: 60 ml blod bør gi ca 100-150 x 10 6 hvite blodceller for plating. - Plate hele cellesuspensjon i en enkelt, kollagen-belagte T-75 kolbe, top-up medium volum til 15 ml / kolbe og kulturen ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2. Cellene sådd på dette tidspunkt representerer passasjen 0.
Merk: Det er mulig å fryse de isolerte PBMNCs før BOEC isolasjon for å utlede BOECs på et senere tidspunkt, eller for å transportere PBMNCs til et annet laboratorium hvor BOECs kan genereres. Det er imidlertid viktig å merke seg at frysing PBMNCs kunne redusere effektiviteten av BOEC isolasjon. See avsnitt 8 nedenfor for metoden.
4. Langsiktig Cell Culture
- Endre medium hver 2. dag ved tilsetning av 15 ml friskt medium BOEC generasjon (5: 1 blanding av endotelial cellevekstmedium og definert FBS). For helgene, kan mellom endringer utsettes til etter 3 dager.
MERK: utvekst kolonier bør være mellom 7 og 14 dager med kultur. - Overvåke BOEC kultur kolben på dager 7-14 for utseendet utvekst kolonier. Identifisere kolonier som sirkulære grupper av celler som utviser en klassisk endothelial brostein morfologi.
- Når en koloni eller flere kolonier er identifisert i kolben, fortsett med middels endringer og la koloniene å vokse til ca 1000 og 2000 celler per koloni før aging. Bestem celle nummer per koloni gjennom en grov visuell estimat.
MERK: Som en guide, er det vanlig å passasje innledende utvekst kolonier en uke etter identifiseringen av den første utvekst kolonien. <li> Passage celler ved å skylle kolber to ganger med 10 ml DPBS. Tilsett 5 ml trypsin-EDTA-1X og inkuberes i et 37 ° C inkubator i 5 min. Etter 5 min, nøytralisere trypsin med 10 ml medium (inneholdende FBS) og bringe cellene i suspensjon ved gjentatt pipettering. - Sentrifuger suspensjonen ved 300 xg i 5 minutter, resuspendert i 15 ml frisk BOEC generasjon medium og plate hele cellesuspensjonen i en ny T-75 kolbe (som representerer en passasje, P1). Ingen kollagenbelegg er nødvendig.
- Fortsett mellom endringer som beskrevet ovenfor til cellene er sammenflytende (omtrent 3-5 x 10 6 celler per flaske). Når konfluent, passerings celler som beskrevet i trinn 4.3.
MERK: Fra passage to og utover, cellene ikke lenger kreve BOEC generasjon medium og kan dyrkes i endothelial cellevekst medium og 10% standard varmeinaktivert FBS. Kollagen belegg kan brukes som et ekstra skritt fremover, så det er noe som tyder på at tilstedeværelsen av kollagen kan forbedre BOEC proliferasjon priser. - For fortsatt aging, plate ikke mindre enn 750.000 celler per T-75 kolbe så lavt celletettheter kan føre til at BOECs å stoppe voksende.
5. frysing og tining BOEC kulturer
- Trypsineres cellene, som beskrevet i avsnitt 4.3 og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender i 10 ml medium. Dette krever ikke endotelial cellevekstmedium; DMEM med 10% FBS standard vil være tilstrekkelig. Samle en 10 pl prøve av cellesuspensjonen for å utføre en manuell celletall ved bruk av et hemocytometer.
- Sentrifuger på nytt og resuspendert ved 2x10 6 celler / ml i iskald nedfrysing medium (40% DMEM med 50% FBS og 10% DMSO). Legg 0,5 ml (10 6 celler) til hvert hetteglass, sted ampuller i en iskald isopropanol cryopreservation fartøy og plasser i en -80 ° C fryseren i minst 2 timer før du overfører til flytende nitrogen. Ikke la cellene ved -80 ° C i mer enn 24 timer. For å tine-celler, tilsett 10 ml forvarmet medium i et 15 ml konisk sentrifugerør.
MERK: Når du tiner passasje 1 celler, tine i endotelceller vekstmedium supplert med 20% definert FBS for de 2 første dagene etter tining. Dette fører til en mer stabil celleisolasjon fremover. - Fjerne celler fra flytende nitrogen og opptining i et 37 ° C vannbad med forsiktig omrøring til det bare er en liten iskrystall er igjen i flasken. Tilsett innholdet i hetteglasset dråpevis til den koniske sentrifugerør og spinne ned ved 300 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml EGM-2 mV + 10% FBS. Legg til T-75 kolbe og topp opp medium til 15 ml.
6. Karakterisering av BOECs av flowcytometrisystemer
- Når BOEC koloniene som beskrevet i seksjon 4 har fått lov til å ekspandere, Cellene trypsineres som beskrevet i avsnitt 4.4 og resuspendert ved en konsentrasjon på 10 6 celler pr ml i flekker buffer (DPBS with 2% FBS og 2 mM EDTA).
- Kombiner 10 5 celler med fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer rettet mot CD45, CD14, CD34, CD31 (bruk alle på 1:20 fortynning) eller VEGFR2 (fortynne 01:10) (se tabell 1 for detaljer). Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellene med 1 ml buffer beising og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender i 400 ul farging buffer for analyse. Holde-celler ved 4 ° C og beskyttet mot lys før analyse.
- Utføre cytometri-analyse på en cytometer utstyrt for å detektere at det fluorescens-konjugerte antistoffene som anvendes i analysen.
- Bruk en uenset BOEC prøve for å identifisere cellepopulasjonen på cytometer ved å justere forover og sidespredningsspenninger, samt spenningene for FITC og APC-kanaler.
- Bestem gating terskler bruker isotype farget celler for hver fluorokrom. Vurdere positivitet for hver celleoverflatemarkør, basert på presence av en topp forskyvning i fluorescensstyrke i forhold til isotype kontroll for fluorokrom som analyseres.
7. Karakterisering av BOECs av Immunofluorescent Mikros
- Plate BOECs i en 24-brønnen, flatbunnet vevskulturplate uten dekkglass ved en tetthet på 5 x 10 4 celler i 500 mL av endotelceller vekstmedium + 10% varmeinaktivert FBS per brønn og la til å overholde og vokse ved 37 ° C, 5% CO2 inntil cellene dekke minst 70-80% av overflatearealet til hver brønn (estimat konfluens ved visuell inspeksjon under et lys microsope).
- Vask celler i hver brønn i 5 minutter med 1 ml DPBS.
- Løse celler O / N ved 4 ° C med 500 pl av 4% paraformaldehyd oppløsning i DPBS.
- Vask celler i 3 x 5 minutter med 1 ml DPBS pr brønn. Legge til og fjerne DPBS ved hjelp av en pipette og en vifte, henholdsvis.
- Permeabilisere celler i 3 x 10 minutter med 0,2% polysorbat 20 i DPBS. Inkuber cellene i 1 time ved romtemperatur i blokkeringsbuffer inneholdende 10% FBS i DPBS.
- Flekk-celler ved 4 ° CO / N i 300 ul av antistoff fortynningsbuffer (0,1% bovint serum albumin i DPBS) inneholdende primære antistoffer rettet mot CD34 (10 ug / ml), CD144 (1: 300) eller vWF (1: 250) . Se tabell 1 for detaljer.
- Vask av ubundne primære antistoffer for 5 x 10 min med DPBS.
- Inkuber cellene i 1 time ved RT med det passende fluorescens-merket sekundært antistoff, som beskrevet i tabell 1 (alle på 1: 200).
- Vask av ubundne sekundære antistoffer for 5 x 10 min med DPBS.
- Inkuber cellene med 1 pg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i DPBS i 10 minutter ved RT.
- Vask celler med DPBS i ytterligere 3 x 5 min.
- Bilde cellene ved forstørrelse 100x bruker en invertert mikroskop utstyrt med en ekstern lyskilde for fluorescenseksitasjon, og ta bilder ved hjelp av en fested digitalkamera for påfølgende analyse offline.
8. frysing og tining PBMNCs
- Ved slutten av trinn 3.2, etter sentrifugering, aspirere mediet og manuelt forstyrre cellepelleten med gjentatt pipettering opp og ned ved hjelp av en P1000 pipettespiss. Tilsett 1 ml av frysemedium, 90% serum og 10% DMSO, og husk å bland forsiktig for å produsere en cellesuspensjon. Overfør cellesuspensjonen til en kryoampulle og fryse og tine som beskrevet i avsnitt 5.
Representative Results
Isolering av buffy coat mononukleære celler fra 60 ml blod typisk gir 100-150x10 6 totale hvite blodceller. Når belagt i en enkelt T-75 kolbe, gjør det store antall celler i den ikke-lyserte cellesuspensjon det vanskelig å løse enkelt adherente celler ved hjelp av lysfelt-mikroskopi. Gjentatte mellom endringer resultere i clearance av ikke-adherente celler og la for visualisering av tilhenger befolkningen i monocyttisk "tidlige" EPCs. På dag 7, T-75 vil inneholde ca. 7x10 6 av disse langstrakte adherente celler. Fra dag 7 til 14, bør kolonier av BOECs vises i kolben (Figur 2A). Kolonier første vises som 3 til 5 tilstøtende celler. Utvekst koloni tall kan variere fra 1 til 10 kolonier pr 60 ml blod. Vanligvis yngre donorer (dvs. 20-25 år) har en tendens til å frembringe et større antall utvekst kolonier, som også vises tidligere i kultur.BOECs spre seg fra denne sentrale gruppe av celler for å danne sirkulære kolonier bestående av flere hundre celler. Cellene i disse koloniene utviser en klassisk endothelial brostein morfologi.
Det er å foretrekke å passerings opprinnelige kolonier når de inneholder omtrent 1000 celler per koloni. Utvekst kolonier typisk nå denne størrelsen 7 dager etter sitt opprinnelige utseende i kultur. Når de opprinnelige kolonier blir passert inn i en ny T-75 kolbe, bør de prolifererer for å danne et sammenflytende monolag (3-5x10 6 celler pr kolbe) i løpet av 5 dager eller mindre (figur 2B). I en liten prosentandel av isoleringer (<10%), utvekst koloniene uteblir, eller ikke formere seg i tilstrekkelig grad å følge denne første aging trinnet. BOECs som viser lav spredning etter sitt første aging sjelden går videre til å bli stabile BOEC isoleringer og ofte stoppe voksende innen to til tre passasjer. Den monocyttisktidlige EPCs som finnes i BOEC kulturer er non-proliferativ og er vanligvis fjernet fra de kulturene innen 1-2 passasjer. Clearance av disse tidlige celler skyldes celledød, svikt i de første celler til å gjenholde etter aging og fortynning av de ikke-formerende tidlige EPCs med gjentatte aging.
Passasje 1 celler kan enten være passert videre i kultur eller frosset ned for senere bruk. Når en stabil isolasjon er generert, kan cellene bli passert ved en hastighet på en konfluent kolbe til 3-5 nye T-75 kolber inntil kanalen 8 eller 9 før de blir stillestående. Igjen, er celletettheten kritisk hele kulturen. I vår erfaring, bør ikke mindre enn 750.000 celler bli belagt i en T-75 kolbe, som lavere celletettheter kan føre til vekst arrest. Til tross for den høye proliferativ potensialet BOECs, celler bør heller ikke få lov til å bli overconfluent (ie.,> 5x10 6 celler per flaske), da dette kan føre samtaler ion av BOECs til en ikke-proliferativ fenotype.
Vi foreslår at enhver celle å bli stemplet som en BOEC skal vise passende celleoverflaten og intracellulær farging for endotelceller markører. Karakterisering av BOECs kan oppnås ved flowcytometri (figur 3), eller fluorescens mikroskopi (figur 4), etter farging for typiske endoteliale cellemarkører. BOECs er positivt for endothelial overflatemarkører CD31 og VEGFR2 og er negative for monocyttaktiveringsanalysen markør CD14 og pan-leukocytt markør CD45. BOECs innehar også Weibel-Palade organer og dermed uttrykke von Willebrand faktor (vWF) som diskret, punktat cytoplasma farging. I motsetning til andre modne endotelcelle typer, for eksempel lunge-arterien eller aorta-endotelceller, BOECs også uttrykke progenitor og aktiverings markør CD34 på deres overflate.
ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk diagram av BOEC generasjon protokoll. Perifert blod mononukleære celler blir isolert fra venous blod ved tetthetsgradient-sentrifugering og dyrket i kollagen-belagte plater i endotelial vekstmedium inneholdende definerte FBS. BOEC kolonier vises innen 7-14 dager kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Lysfelt bilder av representative BOEC kulturer. (A) utvekst kolonier vises i kulturer mellom dag 7 og 14. Kolonier tilstede som samlinger av endoteliale-lignende celler, som er ordnet i en brostein monolag eller formere seg radielt ut fra et sentralt punkt. Rundt utvekst koloniene er tilhenger monocytic cellene som utgjør det store flertallet av celler i tidlige kulturer. Disse cellene, tidligere beskrevet som "tidlig" endoteliale progenitorceller, har en spindel-lignende morfologi og uttrykke monocyttisk markør CD14. (B) Ved å følge aging, de svært proliferative BOECs overta kulturer, som de ikke-formerende monocyttiske celler enten dø ut eller unnlater å montere igjen etter aging. Scale bar 250 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Karakterisering av BOECs ved strømningscytometri. BOECs ble trypsinert og farget med fluorescensmerket-konjugerte isotypekontrollantistoffer (grå fylt topp) eller antistoffer rettet mot spesifikke markører på overflaten (rød linje). Overflatemarkører for cytometrisk karakteriseringinkluderer de blodkreft markørene CD45 og CD14, endothelial markører CD31 og VEGFR2 og progentior og endothelial aktivering markør CD34. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Immunofluorescent farging av BOECs for endotelcelle markører. Representative immunfluorescens bilder av BOECs immunostained med antistoffer rettet mot endothelial celleoverflaten markør CD144 (VE-cadherin, øverst til høyre panel) og blodet glykoprotein von Willebrand faktor (vWF, nederst til høyre panel) . Tilsvarende paneler som viser kjernefysisk DAPI farging er vist til venstre. Scale bar 50 pm. for CD144. Klikk her for å se en størreversjon av denne figuren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For blood collection | |||
| 60 ml syringe with luer-lok tip | BD | 309653 | |
| 19G Surflo Winged Infusion Set | Terumo | SV-19BL | |
| 50 ml conical centrifuge tube | StarLab | E1450 | 2 per donor |
| Sodium Citrate | Martindale Pharmaceuticals | 270541 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For buffy coat isolation | |||
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sterile wrapped plastic transfer pipettes | Appleton Woods | KC231 | |
| Turk’s Solution | Millipore | 1.093E+09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For cell culture, passaging and freezing cells | |||
| Type 1 Collagen (derived from rat tail) | BD Biosciences | 35-4236 | |
| Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 0.02M Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | prepared in reagent grade water |
| Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum) |
Lonza | CC-3202 | Note: It is essential that the medium does not contain heparin. Do not use EGM-2. |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined | Hyclone | SH30070 | |
| 10x Trypsin EDTA | Gibco | T4174 | Dilute to 1x in PBS prior to use |
| Heat Inactivated FBS | Gibco | 10500-064 | |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For flow cytometric characterization | |||
| FITC-conjugated mouse anti-human CD14 | BD Biosciences | 555397 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD31 | BD Biosciences | 555445 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse anti-human CD34 | BD Biosciences | 555824 | Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 560976 | Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 | R&D Systems | FAB357A | Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10 |
| FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555748 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555751 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
| APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | R&D Systems | IC002A Dilution: 1:10 |
Clone: 11711 |
| EDTA, 0.5M solution | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For immunofluorescent microscopy | |||
| Corning Costar 24-well tissue culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody | R&D Systems | MAB72271 | Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml |
| Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) | R&D Systems | AF938 | Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300 |
| Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) | Abcam | ab154193 | Clone EPSISR15, use at 1:250 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21202 | Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200 |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11055 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Life Technologies | A-10042 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 1 μg/ml |
References
- Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
- Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334 (2014).
- Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
- Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
- O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31 (2012).
- Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).
