Summary
Meyve sırasında davranış kalıpları dinamikleri mücadele, gözlenen ve ilişkili öğrenme ve bellek deneysel koşullar etkilenmiştir, kavgalar sinek. Burada sunulan protokol tamamen deneyler sırasında sinekler işlenmesini ortadan kaldıran yeni bir yordam açıklanır. Bu mücadele dinamikleri geliştirir ve güçlü "kaybeden" etkilerinin oluşumunu verir.
Abstract
Drosophila melanogaster saldırgan davranış basmakalıp davranış kalıplarının sıralı ifade oluşmaktadır (analiz için bkz 1). Bu kompleks davranış, genetik, hormonal ve çevresel faktörlerden etkilenir. Birçok organizma olduğu gibi, daha önceki savaş deneyimi sinek mücadele stratejisi ve sonraki yarışmaların sonucunu etkiler: kavga kaybetme olasılığı öğrenme ve hafıza 2-4 dahil "kaybeden" etkileri açığa sonraki yarışmalar kaybetme olasılığını artırır. Saldırganlık gibi karmaşık sosyal davranışların ifadesini eşlik öğrenme ve bellek, hayvanların 5,6 işlenmesini test öncesi duyarlıdır. Birçok deneysel prosedürler ancak saldırganlık 7-9, sineklerin işleme şu anda kullanılabilir dışlayan hiçbir rutin olarak kullanılan protokol incelemek için farklı laboratuvarlarda kullanılmaktadır. Burada, biz Instea kullanarak, sineklerin taşıma ortadan kaldırır yeni davranış cihazı raporud doğuştan olumsuz geotactic yanıtlar içine veya mücadele odaları dışında hayvanları taşımak için. Bu protokol, bir gıda fincan içeren küçük dairesel mücadele arenalarda önce sineklerin tanıtımına çıkartılabilir plastik kaydırıcı tarafından iki eşit parçaya bölünür. Sinekler odası kapı ve geotaxis sürgülü yoluyla ev izolasyon flakonlarından odacıkları girin. Plastik sürgü çıkarılması üzerine, sinekler etkileşime ücretsizdir. Belirtilen süreler sonra, sineklerin sonraki deneyler için sürgü tarafından tekrar ayrılır. Tüm bu bireysel sinekler ele olmadan kolayca yapılır. Bu cihaz saldırganlık ve sinek kavgalarına "kaybeden" etkilerin oluşumu da dahil olmak üzere ilgili öğrenme ve hafıza, çalışmak için yeni bir yaklaşım sunuyor. Buna ek olarak, bu yeni genel amaçlı davranış cihazı sinekler, diğer sosyal davranışlarının incelemek için kullanılabilir ve, genel olarak, temel bir davranışsal sürece deneyimi ile ilgili değişikliklerin araştırılması için ilgili olmalıdır.
Introduction
Hayvan sistemlerinde Saldırganlık şiddetle edinimi ve gıda, toprak ve arkadaşları gibi kaynakların holding ile ilişkilidir. Bu bireylerin uygunluk oynadığı önemli rol göz önüne alındığında, bu saldırganlık hayvan krallığının genelinde gelişmiştir olması şaşırtıcı değildir. Doğrudan bireyler fayda adaptif özelliği olarak, güçlü bir öğrenme ve bellek bileşeni saldırganlık ile ilişkilidir. Sosyal rütbe için rekabet, bir önceki dövüş deneyimi sonraki yarışmaların sonuçlarını etkiler. Genel olarak, önce kaybeden tecrübe artar ve kazanan bir deneyim azalır, daha sonraki yarışmaları kaybetme olasılığı ("kaybeden" ve "kazanan" etkileri denir). "Kaybeden" etkileri türlerin geniş bir yelpazede gözlenen ve bazı raporlar "kazanan" etkiler genellikle kısa süreli 2,10,11 arasında ise bu birkaç gün sürebilir düşündürmektedir oylandı.
Saldırgan davranış ilk raporumeyve sinekleri (D. ampelophila) seks tanıma ve cinsiyet seçimi 12 ile ilgili bir makalede 1915 yılında Sturtevant oldu. Daha sonra, erkek meyve daha tam muayeneleri saldırganlık uçmak Yarım yüzyıl meyve sineği kavgalar sırasında gözlenen davranış kalıplarının çoğu tarif, yapılmıştır. Bu deneyler genellikle saat 13-15 gözlenen kadın ve erkek sineklerin küçük gruplar halinde yürütülmüştür. Son zamanlarda, güçlü genetik araçlar diyadik tek seks mücadele kurulumları ve gözlem, D. kısa zamanlarda eklenmesiyle melanogaster saldırganlık 1,16 biyolojisi çalışmaları için önemli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Erkek ve dişi sineklerin aynı cinsiyetten çiftleri arasındaki kavgalar Analizi saldırganlık bir istatistiksel güvenilir bir şekilde 1,17 yılında birinden diğerine geçiş basmakalıp davranış kalıplarını içerdiğini göstermiştir. Diğerleri mücadelede görülürken gözlenen davranış kalıplarının bazıları cinsiyete özgü olanHer iki cinsiyette de s. Erkek kavgalar açık "kazananlar" ve "kaybedenler" ile egemenlik ilişkilerinin oluşumunda kadın kavgalar ve sonucu daha yüksek yoğunluk seviyelerine gidin. Şu anda birçok laboratuvarlar biyokimyasal 18, nöral 7,19-21 ve saldırganlık genetik temelleri 22 soruşturma başladı. Ne yazık ki, çalışmaların bir meta-analiz, farklı laboratuvarlarda deneysel prosedürlerin çokluğu kullanımına mücadele dinamikleri içgörü ve oluşumu ve egemenlik ilişkilerinin bakımı sorunlu kazanmak için. Esasen literatürde tanımlanan tekniklerin tüm arenalarda dışarı sinekler aktarmak için arenalarda 19,23,24 içine ve davranışsal deney 3,4 sırasında bunları tanıtmak için sinek kullanım ve manipülasyon içerir. Nazik aspirasyon sinekler 3,4,23-25 işlemek için en yaygın yolu, ancak soğuk ya da CO 2 anestezi de olsa p rağmen, 9,26 kullanılırnceki çalışmalar zaten bu işlemler sinek davranışı 27,28 üzerinde zararlı etkilere sahip olduğunu bildirmişlerdir. En az 24 saatlik bir süre davranışı 29,30 üzerindeki etkilerini en aza indirmek için herhangi bir anestezik kullanımı sonra tavsiye edilir.
Sinekler önceki mücadele deneyimlerinden öğrenmek ve öğrenme ve hafıza eşlik ve agonistik karşılaşmaların sonuçları olduğunu öne sürerek, yeni durumlarda kendi davranışsal model kullanımını değiştirin. Bu anlamda, kavgalar sonraki karşılaşmalarda sırasında daha fazla ve daha sık kullanmak sonra strateji çalışmış olduğunu öğrenmek ve sinekler hangi edimsel koşullanma öğrenme ortamlarına benzer uçmak. Egemenlik ilişkileri kavgalar sırasında oluşturulan edildikten sonra Sinekler kazananlar daha fazla ve kaybedenler daha az lunging ile kendi dövüş stratejilerini değiştirmek. Ayrılık bir süre sonra, önceki kaybedenler çok daha uysal davranışlar göstermek ve naif fl ile eşleştirilmiş savaşır nd 2 kaybetmek son derece muhtemeldirler veya önceki kazananlar 3,4. Ancak, sinekler ele dışlayan bir deneysel işlemin yokluğu zor "kaybeden" etkileri detaylı çalışmalar yapmıştır. Yeni bir çalışmada, rutin kullanımını ortadan kaldıran yeni prosedüre davranışsal odalarına sinekler tanıtmak için laboratuvarlar (aspirasyon ve soğuk anestezi) kullanılan iki deneysel prosedürleri karşılaştırıldı. Sonuçlar soğuk anestezi aspirasyon çok saldırganlık üzerine daha büyük olumsuz etkileri vardı, ama bile aspirasyon sinekler tarafından saldırganlık düzeyini azalttığını göstermiştir. Aspirasyon, ancak saldırganlığı eşlik öğrenme ve hafıza üzerinde çok önemli etkilere neden etmedi. İki deneysel prosedürler (aspirasyon ve hiçbir işleme), sineklerin ele deneysel prosedür 5,6 elendiği zaman sağlam "kaybeden" etkisi sadece gözlendi özdeş protokol sonrasında.
İdeal olarak, labo Drosophila saldırganlık çalışmalarıratories normalde (kaçmaya savunmak için kaynaklar için rekabet, bölge ve uzay) vahşi karşılaşabileceğiniz sinekler çevresel durumları içermelidir. Buna ek olarak, deneysel koşullar güvenilir, neden gözlemlemek ve inceleme altında davranışlarını yorumlamak için optimize edilmelidir (hayvan taşıma minimize anestezik olarak CO 2 kullanımını sınırlamak ve deneysel prosedürler standart çalışın). Çoğu veya bütün bu konular ele çalışırken, biz sırasında ve davranışsal arenalarda onları tanıttıktan sonra, daha önce sineklerin işlenmesini ortadan kaldıran yeni bir davranış aparat tasarladı. Bu aparat sayesinde, sinekler kendi doğuştan negatif geotaxis taşındı ve içine ve kavga odalarından dışarı aktarılacak kullanın. (A) bireyler arasında davranışsal değişkenlik azaltmak;: sinekler işlenmesini ortadan kaldırarak, protokol hedefliyor Sinekler etkileşim ve net baskınlık ilişkileri (erkek) oluşturmak için (b) gerekli zaman azaltmak; ve (c) güvenilir yeterince güçlü behavio nedenral değişiklikleri "kaybeden" etkilerin oluşmasına izin vermek.
Bu protokol, yeni bir deneysel düzenek ve aşamalı bir prosedür ile bir adım saldırganlık analiz etmek ve D'de güçlü bir "kaybeden" etkisi oluşumuna izin vermek için tarif melanogaster. Biz bu davranışsal cihaz kolayca meyve sinekleri tarafından sergilenen diğer sosyal davranışların incelenmesi için adapte edilebilir bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıdaki biz erkek meyve sinekleri çiftleri arasındaki güvenilir saldırganlık tetikleme izin kullanmak deneysel protokol (D. melanogaster) bir adım-adım açıklama. Bu prosedür, bir "kaybeden" etkisi oluşumunu uyarır. Bu protokolü kullanarak, aynı zamanda olmuştur kısa vadeli "kazanan" etkisi son zamanlarda 5,6 bildirildi. Şekil 1 davranışsal deneyler zaman çizelgesini gösterir.
Saldırganlık deney 1. Timeline Şekil. 1. gün, geç evre erkek pupa (kanatlar siyah olunca) taze hazırlanmış izolasyon şişeler içinde izole edilmiştir. Yetişkinler olarak ortaya çıkan 5 gün sonra, 4 günlük erkek sinekler CO 2 ile anestezi uygulanır ve tanımlama amacıyla farklı renklerle boyanmış. 7. günde, gıda bardak ve mücadele odaları vardırdavranışsal deneyler kurmak için hazır. İki 6-7 gün eski yetişkin erkekler odalarına yüklenen ve etkileşim edebiliyoruz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
1. 1. Gün: Pupa Sosyal İzolasyon
- Kaldırın ve 25 ° C'de ve% 50 nispi nemde bir çevresel olarak kontrol edilen, 12 saat ışık / 12 saat karanlık çevrimi inkübatör sinek stoklarının bakımını.
- Izolasyon şişeleri hazırlayın: eriyene kadar taze sinek gıda ısıtın. Pasteur pipet kullanarak, tek boş cam test tüpleri (1.6 x 10 cm) içine yaklaşık 1.5 ml erimiş sinek gıda aktarın. Gıda katılaşmaya izin verin.
- Pupa izole edin: (kanatlar siyah olunca) ince bir fırça ile hafifçe stok şişeden bir geç evre erkek pupa kaldırmak ve taze hazırlanmış yiyecek içeren test tüpünün tarafına yerleştirin. Pamuk ile yakın izolasyon şişeleri (Şekil 2).
Şekil 2. Sosyal İzolasyon. Bir ileri evre erkek pupa taze hazırlanmış izolasyon şişenin üzerine tarafında yer alıyor. Pupa içeren İzolasyon şişeleri 25 ° C ve% 50 bağıl nemde 12 saat ışık / 12 saat karanlık inkübatör yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Gün 5: Bireyi Tanıma Amaçlı Sinekler Boyama
- CO 2 anestezi olumsuz etkisini en aza indirmek için 4 günlük erkek sinekler ve davranışsal deneyler öncesinde iki gün ile 5 gün bu adımı gerçekleştirin.
- CO 2 ile sinek anestezisi. Ince bir kürdan ile, göğüs üzerinde akrilik boya küçük bir nokta koyun. Baş, kanatlar, karın ya da bacaklarda (Şekil 3) boya koymaktan kaçının.
- Yaklaşık 10 saniye boyunca boya kurumaya bırakın ve yavaşça orijinal izolasyon şişeleri geri sinekler aktarın.
- 25 ° C'de ve% 50 nispi nemde, 12 saat ışık / 12 saat karanlık inkübatör yalıtım şişeleri dönün.
Şekil 3. Bireysel kimlik. CO 2, akrilik boya, küçük bir damla ile bir sinek anestezi sonra toraks uygulanır. Bireysel kimlik amaçla, farklı renklerde (beyaz ve burada mavi) kullanılır. Bu aşamada CO 2 kullanımı hakkında aşağıdaki açıklamalara bakın. Bu figu büyük halini görmek için tıklayınızyeniden.
3. Gün 7: Aparatı hazırlanması
- Gıda Kupaları hazırlayın:
- O eriyene kadar taze sinek gıda ısıtın.
- Pasteur pipeti kullanılarak, vida kapaklı bir küçük şişe (1.5 cm çapında, 1 cm yükseklik) kapağının yaklaşık 0.8 mi gıda transferi ve soğumaya bırakın. Hava kabarcıkları kaçının.
- Su birkaç damla kuru maya karıştırılarak taze maya hamur yapın. Ne zaman kalın, bir kürdan (Şekil 4) ile gıda fincan yüzeyinin merkezine maya hamur küçük bir damla uygulayın.
Gıda fincan hazırlama Şekil 4.. Bir gıda fincan taze sinek gıda ile hazırlanmıştır. Gıda katılaşır sonra, maya hamur bir nokta gıda fincan yüzeyinin merkezine yerleştirilir. V için tıklayınızBu rakamın büyük bir sürümünü iew.
- Bireysel Mücadele Chambers hazırlayın:
- Kullanmadan önce iyice su ile her zaman cihaz ve bireysel mücadele odaları yıkayın. Kullanmadan önce kağıt havluyla kurulayın.
- Her mücadele odasının ortasında bir gıda fincan yerleştirin ve macun bir damla yere sabitleyin.
- Cihaz kapağının (Şekil 5) ile mücadele odaları örtün.
- 25 ° C'de bir yüksek nemli ortama (% 60) halinde cihazı yerleştirin.
- Mücadele odaları aydınlatmak ve yukarıdan kayıt için bir video kamera ayarlamak için aparat üstünde bir ışık kaynağı yerleştirin.
Şekil 5. Bireysel mücadele odasını hazırlamak. Yüzeyde maya hamur bir nokta ile taze hazırlanmış yiyecek fincan yıkanmış bireysel fi içine sabitlenirodaları ghting. Chambers, bireysel mücadele odalarına opak plastik bölücü sokulmasını sağlayan iki parçalı kapak ile kapatılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4. Gün 7: Davranışsal Deney
- 6-7 günlük erkek sinekler davranışsal deneyler yapın.
- Her mücadele odasına plastik bölücüler yerleştirin.
- Izolasyon tüpten pamuk fişini çıkarın ve aparatın tarafında açık bir delik altında tüp yerleştirin.
- Sinek genellikle birkaç saniye içinde, negatif geotaxis tarafından savaş odasına girelim.
- Sinek tüpü ve sol odasına girdikten sonra kayan duvarı kapatın.
- Aparatın diğer tarafta kavga odasına ikinci sinek tanıtmak için işlemi tekrarlayın.
- Işıklı videotapi geri aparatı yerleştirinng konumu.
- Video kayıt başlayın ve sinekler etkileşime izin plastik bölücü kaldırın.
- Saldırganlık Deneyleri:
- Bu deneylerde, kayıt güçlü hakimiyeti ilişkilerin oluşumunu sağlamak için en az 20 dakika boyunca savaşır.
- İstenilen süre sonra, video kaydını durdurun.
- Yukarıda açıklanan yordamı ters çevirerek mücadele odalarından sinekler çıkarın.
- İyice her kullanımdan ve durulama sonrasında hafif deterjan ve suyla davranışsal aparatı yıkayın.
- "Kaybeden" Efekt Deneyleri İçin:
Not: Bu deneylerde, ilk savaşır test aşamasında gibi şekillendirme aşaması ve ikinci kavgaları olarak kabul edilmektedir. Kavgalar arasında kalan dönemi farklı olabilir ama 10 dk güçlü bir "kaybeden" etkisi oluşumunu sağlayan.- İlk mücadele gerçekleştirmek için yukarıda açıklanan prosedürü uygulayın.
- KRİTİK ADIM: a "kaybeden" mantığı, e oluşumunu teşvik etmek içinİlk kavgalar en az 20 dakika, güçlü hakimiyeti ilişkileri kurmak amacıyla uzun bir şekilde almalarının sağlanması. 20 dakika sonra, sinekler ayırmak için mücadele odalarına plastik bölücü yeniden takın.
- Dinlenme 10 dakikalık bir süre sonra, yavaşça sinekler ikinci kavgalar için etkileşim sağlamak için plastik bölücü kaldırın.
- İkinci 20 dakika mücadele sonunda, Video kaydını durdurmak.
- Yukarıdaki gibi davranışsal odalarından sinekler çıkarın.
- Bir kez daha, iyice davranışsal cihazı temizleyin.
- Saldırganlık Deneyleri:
5. Davranış Analizi
- Filmler aktarma
- Bilgisayara kameraları bağlayın.
- "Seçilen klipleri katılmak" Video dönüştürme yazılımı ve seçeneğini kullanarak, sinekler mov ve birlikte film klipleri katılmak için sinekler .mts dönüştürün.
- Gözlemleyin ve video okuyucu yazılımı ile her film analiz.
- Puanlama Davranış
Bu elle yapılabilir ya da bize: NotVarsa davranışsal analiz programı yazılımı ing. Aşağıdaki resimde bir "kaybeden" etkisi için olası manuel analizini açıklar.- Gıda fincan üzerinde sinekler arasındaki ilk karşılaşma zamanı Puan ve ilk hamle görünüm zaman (bir sinek üzerinde yükselirse olan bir davranış paterni (karşılaştığında en az 2 sn süren sinekler çiftleri arasındaki etkileşimler vardır) onun Arka ayakları ve aşağı oturtunuz ve) rakibini kapmak için çalışır. Ardından, (ilk karşılaşma ile ilk hamle arasındaki aralığı) hamle için gecikme puan.
- Kavga sırasında karşılaşır ve lunges toplam sayısını sayın.
Not: İstenirse, bir de kanat tehdit, boks, eskrim, çekilme ya da örneğin ilk hamle öncesinde karşılaşmaların numaraları gibi diğer davranış kalıpları skor olabilir. - Egemenlik (ilk karşılaşma ve bir gıda fincan kıç kapalı üst üste üç kez inziva uçmak zamanı arasındaki zaman kurulması zamanını Puaner) lunges alma. Sinek Not kazanan ve hangi mücadele kaybeden.
- Bir "Kaybeden" Effect hesaplanması
- Önceki kaybedenler 2. kavgalar (kaybedersiniz Kaybedenler: LL) kaybettiği kavgalar sayısını bölün kavgalar toplam sayısına göre ve 100 elde yüzdesi "kaybeden" etkisini temsil ile çarpmak:
[(# LL uçar) / (# Toplam kavga)] x 100 - "Kaybeden" etkisi% 50 beklenen değerden istatistiksel olarak farklı olup olmadığını karşılaştırmak için Ki-kare testi kullanın.
- Önceki kaybedenler 2. kavgalar (kaybedersiniz Kaybedenler: LL) kaybettiği kavgalar sayısını bölün kavgalar toplam sayısına göre ve 100 elde yüzdesi "kaybeden" etkisini temsil ile çarpmak:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm davranışsal odasının tasarımı ve saldırganlığı ve "kaybeden" etkisi oluşumunu ölçmek yukarıda açıklanan protokol aşağıdaki davranışsal deneyler tipik bir dizi analizini sunmaktadır. Ayrıca, bu aygıt kullanılarak ölçülebilir diğer davranışları örnekleridir resimli.
Şekil 6, yeni bir tertibatın şematik bir temsilini göstermektedir. Cihaz üç silindirik kuyu oluşmaktadır (boyutun: 22.86 mm çapında, 17 mm yükseklik) mücadele odaları bulunmaktadır. Iki parçalı kapak üstünde mücadele odaları kapatır ve iki eşit bölüme odalarına böler ince opak plastik bölücü ekleme verir. Üç delik (15.88 mm çap) ile duvarlar sürgülü düzeneğin her tarafında, onların izolasyon şişeleri doğrudan olumsuz geotaxis tarafından savaş odalarına sineklerin yüklenmesini sağlar. Sinekler mücadele odaları girdikten sonra, sürgülü duvarlar kullanımı vardırd tüm odaları yanlarını kapatacak şekilde. Bu noktada, iki sinekler mücadele arenalarda içinde ancak bölücüler nedeniyle müdahale edemezsiniz. Bu kaldırarak, sinekler etkileşime ücretsiz ve daha sonraki davranış kalıplarını gözlenen ve kaydedilebilir.
Saldırganlık deneyleri: 38 kavgalar vahşi tip CS erkek çiftleri arasında yapıldı. Sinekler gıda bardak üzerinde iken farklı davranış parametreleri attı ve kavgalar dinamikleri (Tablo 1) analiz edildi. 24 karşılaşmalar (sinekler arasında kısa toplantılar), 54 lunges (yüksek yoğunluklu savaşın bir göstergesi) ortalama genellikle 2. karşılaşma sırasında verilen 1 hamle ile, 20 dakika süre boyunca gözlendi. Ortalama olarak, 1. karşılaşma, 1. hamle ve egemenlik kurma kayıt süresi başladıktan sonra 2, 4 ve 8 dk görüldü. Çoğu durumda, kavgaları son 12 dakika yüksek yoğunluklu Enco tekrar eden sekansları,alt hayvanların hakimiyetini ya da her hayvanın itaatkâr durumunu takviye, yaklaşan saldırıya uğrayan ve geri çekilen ile Unters.
"Kaybeden" etkisi deneyleri: bir "kaybeden" etkisi oluşumunu aramak için, 20 dakika süre 21 1. kavgalar yabani tip CS erkek çiftleri arasında yapılmıştır. Bölme kayar bölücü sonra sinekler ayırmak için yerleştirildi. 10 dakika sonra, 2. 20 dk kavgalar (a) Bir önceki kaybedenler ve tanıdık kazanan veya (b) Bir önceki kaybedenler ve yabancı kazananlar ve bu (Şekil 7) yukarıdaki gibi analiz edildi arasında yapılmıştır. Her iki durumda da, 20 önceki kaybedenler sağlam "kaybeden" etkisi gösteren, onların 2. kavgalar (% 95.5) kaybetti. Kavga sonuçları bulunmuştur iki kuyruklu Ki-kare analizi ve son derece anlamlı "kaybeden" etkisi ile 50-50 beklenen değeri karşılaştırıldı. Diğer davranış değişiklikleri bireylerin kaybetme gözlendi1 st arasında 2 "kaybeden" etkisi 5 oluşumunu eşlik savaşır nd.
Saldırganlık dışında davranışlar aparat okudu olabilir: göstermek için, kur ve hareket deneyleri (T mümkün 2) uygulandı. Kur için, erkek ve dişi sineklerin davranış odalarına negatif geotaxis ile yüklenmiş, bölücüler uzaklaştırılmış ve davranış kur şablonu elde edildi. 34 deney yapılmış ve mahkemeye gecikmeleri (1 karşılaşma ve 1 kur davranışı arasındaki zaman = 7 sn) ve (1 karşılaşma ve çiftleşme = 4 dakika arasında zaman) çiftleşmek için analiz edilmiştir. Sadece 2 erkek gözlem 15 dakika süresince copulating başarılı olamadı. Courtship Dinçlik Endeksi (1 kur davranış modelinde sonra 15 dakikalık bir süre boyunca kadın kur harcanan erkekleri zaman bölümü) 75% (Tablo 2) değerlendirilmiştir. Lokomosyon ya günahmetini uçan veya 10 sinekler grubu bölmelerine yerleştirildi ve 5 dakika boyunca orta hat geçişleri sayısı sayılmıştır. Gruplar halinde bireysel sinekler ortalama 45 kat / 5 dakika (Tablo 2) orta hat çapraz ederken Tek sinekler, 5 dakika boyunca ortalama 73 kez odasının orta hat geçer. Sinekler gruplar halinde olduğunda gözlemlenen Bu azalma sinek başına ve birbirleriyle etkileşim yerine topraklarını keşfetmeye harcadıkları zaman kullanılabilir indirgenmiş boşluk ile açıklanabilir.
Davranışsal odasının Şekil 6. şematik gösterimi. Aparatın (A) Yandan görünüm. Yeni cihaz üç ayrı bölümden oluşmaktadır: (a) odaları mücadele üç bireyleri içeren plastik bir blok; (b) her birinde üç delik (15,88 mm çapında), iki kayar duvarları; ve (c) üst üste iki parçalı kapağı. (B) Üstaparatın görünümü. Plastik bir blok: (a) boyutları 123,19 mm 36,83 mm'dir. Her bir söndürme bölmesi 22,86 mm bir çap ve 17 mm bir yüksekliğe sahiptir. Sinekler yüklenmesini sağlamak tarafında delikler 15.88 mm bir çapa sahip. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. sağlam "kaybeden" etkisi oluşumu. Önceki kaybedenler eşleştirilmiş edildiğinde görülmektedir savaşır nd 2 kaybetmek kaybedenler önemli bir "kaybeden" etkisi (yüzde (a) tanıdık kazananlar (n = 21, p *** <0.0001) veya (b) 2. kavga için yabancı kazananlar (n = 21, *** p <0.0001) (Lose ile: 95.5%, Win:.% 4.5, No berabere) Plkolaylaştırmak bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Davranış parametreler | Ünite | Süresi (sn) | n |
| Buluşmaları | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| 1 hamle öncesi karşılaşmaların sayısı | 2 ± 0.3 | 38 | |
| 1 karşılaşma zamanı | 145 ± 20 | 38 | |
| 1 hamle zamanı | 229 ± 26 | 38 | |
| Baskınlık Zaman | 475 ± 56 | 34 | |
| Gecikme hamle için | 87 ± 20 | 38 | |
| Egemenliğine Gecikme | 342 ± 51 | 34 |
Tablo 1:. Her parametre saldırganlık göstergeleri olarak attı için ± SEM erkek sineklerin çiftleri arasındaki agonistik etkileşimleri Dinamikleri ortalama değerler hesaplanır. Karşılaşır ve lunges toplam sayısı ve numarasıkarşılaşmaların 1 hamle attı önce. 1 karşılaşma, 1 hamle ve egemenlik ve gecikmeleri Times hamle ve egemenlik (n> 34) ± SEM sn sunulmaktadır.
| Davranış parametreler | Süresi (sn) | Ünite | (%) | n |
| Kur davranışı | ||||
| Mahkemeye Gecikme | 7 ± 3 | 34 | ||
| Gecikme çiftleşmek için | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Courtship Vigor Endeksi | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Hareket | ||||
| Toplam orta hat haçlar (tek sinek) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Toplam orta hat haçlar (sinek grubu) | 45 ± 3 | 20 |
Tablo 2:. ± SEM kur davranışı ve hareket analizi ortalama değerlerin mahkeme ve (sn) çiftleşmek için gecikmeleri için hesaplanır. Bir kur gücü endeksierkek ve dişileri negatif geotaxis (n> 32) tarafından davranışsal odalarına yüklenen sonra gol oldu (zaman% olarak 1 kur ekranından sonra flört harcanan). Hareket, bir sinek ya da 10 sinekler grupları odalarına yerleştirilir zaman, 5 dakika boyunca (n = 48 ve 20), orta hat boyunca çaprazlamaların sayısı sayılarak değerlendirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saldırganlık çalışma için bir model organizma olarak güçlü genetik yöntemlerle Drosophila kullanarak modern çağın, güvenilir dövüş davranış sinekler 1,7 tek çiftleri elde edilebileceği roman deneysel arenalarda tanıtımıyla bir düzine yıl önce başladı 8,17,19. Bu arenalarda istenen kaynaklar (gıda fincan, potansiyel arkadaşları) ve kaybeden için bir boşluk içine çekilmeye uçar dahil. Bu arenalarda elde edilen sonuçlar meyve sineği kavga davranışları hakkında önceki bilgi eklendiğinde, Drosophila melanogaster sıkıca saldırganlık gibi karmaşık bir davranış incelenmesi için oldukça aranan bir model sistem olarak kurulmuş ve birçok laboratuvarda kullanılmaktadır. (A) gıda kaynakları, arkadaşları ya da topraklarının 14,15 savunması için erişim için rekabet sergi saldırganlık uçar;: Elde edilen sonuçlar ortaya özetlenebilir (b) kavgalar basmakalıp davranış kalıpları 1 sıralı dizi oluşur; (c)erkek ve dişi sinekler (bazı modeller bazı spesifik kadın ve bazı her iki cinste tarafından paylaşılan olan erkek özgü) 17 aynı cinsiyetten eşleşmeleri mücadele; (d) sadece erkek kavgalar yüksek yoğunluklu düzeyleri gidin ve sonucu net «kazanan» ve «kaybeden» ile hiyerarşik ilişkilerin oluşmasında 17 sinekler; sinekler erkek veya kadın 16 ve aminler ve peptidler dahil (f) Birden hormonal maddeler gibi kavga 7,8,19,20 uçar meyve saldırganlık etkileyen olsun (e) cinsiyet tayini hiyerarşinin sonuçsuz bir tek gen, belirler.
Burada, yeni bir yaklaşım deneyler sırasında sinekler işleme elimine edildiği saldırganlık meyve sineği çalışma için tarif edilmektedir. Tüm davranış ölçümleri davranışı ile ilgili yeni bir bilgi elde edilmiştir, 5,6 geliştirilmiştir gibi bu deney protokolünde önemli bir gelişme sunar ve öğrenme ve hafıza eşlik edenErkek sinek kavgalar büyük ölçüde artırıldı. Göstermek için, sadece iki önceki çalışmalarda bu model sistemi 3,4 olarak "kaybeden" etkileri oluşumunu bildirmiştir. Bunların her ikisi de, bu protokol açıklanan olanlardan daha büyük odaları sinek aspirasyon yoluyla içine ve mücadele arenalarda dışına transfer edildi, kullanıldı ve kavgalar arasında uzun mücadele süreleri ve aralık kez açık "kaybeden" etkileri üretmek için gerekli idi. Bizim yeni bir çalışma ortadan kaldırarak, deneysel protokol D. çiftleri arasındaki net baskınlık ilişkileri ele gösterdi melanogaster erkek sinekleri etkileşimin sadece 20 dakika sonra gözlemlenmiştir. Bu zaman miktarı 1. kavgalar sırasında her iki sinekler savaş stratejilerinde önemli değişikliklere neden ve güvenilir 2. kavgalarına güçlü "kaybeden" etkileri oluşumunu gözlemlemek için yeterlidir. Buna ek olarak, ilk kez, net kısa vadeli "kazanan" etkileri de 2 nd sırasında gözlendi5,6 savaşır.
Bu protokolü kullanarak başarısı için, bazı kritik noktalara dikkat edilmesi gerekiyor. Neden ve biz geç pupa aşamasından itibaren sosyal izolasyon düzenlenmiştir 6-7 günlük erkek sinekler kullanmanızı öneririz sağlam agresif davranış kalıplarını gözlemlemek için. Genel olarak, sinekler kaynakların kullanılabilirliği (gıda, arkadaşları) üzerinden rekabet hazırız güçlü mücadele davranış ve egemenlik ilişkilerinin kurulmasını elde etmek için son derece arzu edilir. Bu protokol sırasında, sinekler CO 2 kullanarak anestezi sonrasında boyalı ve bizim son yayınlanan çalışmada, sinekler anestezi ciddi sonraki davranışları 5 engellediğini gösteren olarak o endişe olabilir. Bireylerin takip etmek önemli değilse anestezi önlemek için olası yolları hayvanları boya için olabilir. Boya gerekli ise hayvan deneyleri veya tanımlamak için alternatif yaklaşımlar için kullanılmadan önce, ancak, anestezi 48 saat kullanılmalıdırbireyler de 31 kullanılabilir. Güçlü "zavallı" ve "kazanan" etkilere yol için, sinekler kurmak ve ilk kavgalar sırasında baskınlık ilişkiyi sürdürmek çok önemlidir. Protokolde 25 ° C'de yabani tip CS suşu kullanılarak, burada sunulan, etkileşim 20 dakika açık "kazananlar" ve "kaybedenler" oluşturmak ve her iki bireylerin mücadele stratejilerinde değişiklik gözlemlemek için yeterlidir. 25 ° C ya da daha CS dışında genotiplerine farklı sıcaklıklarda yapılan deneylerde, ancak güçlü bir baskınlık ilişkisi kurulması için ortalama süre farklı olabilir. Bu duruma göre, söndürme süresi ön deney kümesini uygulayarak ayarlanmalıdır. Son olarak, sinekler çiftleri ilk çarpışmalardan sonra nasıl ayrılacağını mücadele sonuçları bellek koruma önemli olabilir. Bu düzeneğin hareketini azaltmak ve sipariş plastik bölücü tanıtımı sırasında nazik olmak, muhtemelen önemlidirHayvanların rahatsızlığı en aza indirmek için.
Aparat tasarım ve iki eşit bölmeye davranışsal odaları ayrılmasını sağlayan iki parçalı kapak, kolay ilk kavgalar sonra iki sinekler ayırmak ve 2. kavgalarına yeni rakipler tanıtmak olun. Deneysel protokol küçük ayarlamalar ile, Tablo 2 'de gösterildiği gibi de, aynı cihaz deney hayvanları için daha az stresli koşullar olmalıdır ne kur, lokomosyon ya da gerçekten çok meyve sineği davranışları incelemek için kullanılabilir. Prosedür Olası ileri iyileştirmeler aparatı içine termostatik kontrol (piezoelektrik eleman veya sıcaklık kontrollü akışkan dolaşmaya bir bobin) sıcaklığa duyarlı reaktiflerin kolay kullanım (shibire TS1, dTRPA1 kanalı) izin vermek çeşit tanıtmak olabilir.
Özetle, biz saldırganlık i çalışması için yeni bir strateji sunan yeni bir aparat taktığın meyve sineklerinin taşıma öncesinde, sırasında ve sonrasında deneyler elendi hangi uçar. Sinekler taşıma birkaç diğer ortak yollar karşılaştırıldığında tüm davranışsal tedbirler yeni aparatı ile geliştirilmiştir. Belki yapmak için daha genel bir açıklama esas laboratuvar ortamlarında tüm davranışsal deneyler deneyci hayvanları taşıma, toplayıp ya da diğer şekillerde dahil olmasıdır. Çabaları bu kullanım nazik olmaya rağmen, bu hayvanlar için stresli olması muhtemeldir. Bu mümkün olduğunda hayvanlar biraz daha normal koşullar altında gözlemlenen olabilir ki, bu işleme ortadan kaldırmak için yöntemler tasarlamak için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı EAK Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (GM099883 ve GM074675) hibe tarafından desteklenmiştir. (: Kontak Biz davranışsal aparat tasarımı için Harvard Tıp Okulu'nda bizim makine dükkandan halkına teşekkür http://mikesmachine.com).
Yazar katkıları: ST, BC davranışsal aparat tasarladı. ST tasarlanmış ve deneysel protokol optimize edilmiş. ST ve M.Ö. gerçekleştirilen ve deneyler analiz. ST, EAK ve M.Ö. kağıt yazdı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
