Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Abstract

Anaerobe Bakterien weit zahlenmäßig überlegen Aerobier in vielen menschlichen Nischen wie dem Darm, Mund und Vagina. Darüber hinaus sind anaerobe Infektionen häufig und oft indigener Herkunft. Die Fähigkeit einiger anaerobe Erreger an menschliche Zellen einzudringen gibt ihnen adaptive Maßnahmen zur angeborenen Immunität zu entfliehen sowie Wirtszelle Verhalten zu modulieren. Jedoch sicherzustellen, dass die anaeroben Bakterien sind im experimentellen Untersuchung der Ereignisse kann Herausforderungen mit sich bringen zu Hause sind. Porphyromonas gingivalis, ein Gram-negative anaerobe, ist in der Lage eine Vielzahl von eindringenden eukaryotischen Nicht-Fresszellen. Dieser Artikel beschreibt, wie man erfolgreich Kultur und Beurteilung der Fähigkeit von P. gingivalis die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) einzudringen. Zwei Protokolle wurden entwickelt: ein, um Bakterien, die erfolgreich eindringen kann und zu überleben, in dem Wirt, und der andere, um Bakterien Interaktion mit Wirtszellen sichtbar zu messen. Diese Techniken erfordern die Verwendung eines anaeRobic Kammer P. liefern gingivalis mit einer anaeroben Umgebung für ein optimales Wachstum.

Das erste Protokoll ist auf der antibiotischen Schutz-Assay, die weitgehend verwendet wird, um die Invasion von Wirtszellen, die durch Bakterien Studie. Jedoch ist die Antibiotikum-Schutzassay beschränkt; nur intrazelluläre Bakterien, die nach Behandlung mit Antibiotika und Host-Zell-Lyse kultivierbar sind, werden gemessen. Um alle Bakterien, die Interaktion mit Wirtszellen, sowohl lebenden und toten beurteilen wir ein Protokoll, das Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktion untersuchen entwickelt. Bakterien fluoreszent mit 2 'bezeichnet, 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein-acetoxymethylester (BCECF-AM) und verwendet, um eukaryotische Zellen unter anaeroben Bedingungen zu infizieren. Folgende Fixierung mit Paraformaldehyd und Permeabilisierung mit 0,2% Triton X-100, werden Wirtszellen mit TRITC-Phalloidin und DAPI markiert, um den Zellkern und Cytoskelett beschriften sind. Mehrere images zu verschiedenen Schwerpunkten (Z-Stack) getroffen werden für zeitlich-räumliche Visualisierung von Bakterien erhalten. Verfahren in dieser Studie verwendet wird, kann auf jede kultivierbare anaerobe und jegliche eukaryotische Zelltyp angewendet werden.

Introduction

Anaerobe Bakterien besiedeln fast alle Oberflächen des menschlichen Körpers. Obwohl überwiegend in der Flora des Darm und Urogenitaltrakts, wo Sauerstoffkonzentrationen sind niedrig, es gibt sie auch in hohen Konzentrationen auf der Haut, Mund, Nase und Rachen ^1. Anaerobe Bakterien sind eine häufige Ursache von endogenen Infektionen und werden häufig von erkrankten Stellen isoliert. Jedoch aufgrund ihrer Natur anspruchsvolle Anaerobier können schwierig zu isolieren und Kultur. Studien mit anaeroben Bakterien sind unter eingeschränkten Bedingungen durchgeführt werden. Moderne anaeroben Kulturtechniken es den Forschern ermöglichen, um die anaerobe Einstellungen erforderlich, um viele anaerobe Laborstämmen oder klinischen Isolaten ^2,3 studieren zu imitieren.

Pathogenen anaeroben Bakterien haben eine dynamische Beziehung und Co-Evolution mit den Wirtszellen in dem sie wohnen entwickelt. Esten Anaerobier sind anfällig für das Töten von der Immunantwort des Wirts vor Erreichen infectischiedenen Ebenen. Allerdings haben einige pathogene Bakterien Mechanismen zu entkommen oder untergraben die Wirtsimmunantwort entwickelt. Sie erreichen dieses Ziel durch Mechanismen wie Umgehung der Immunerkennung, Neutralisation von Immunmediatoren, Veränderung der zellvermittelten Immunität, Invasion von Wirtszellen und Veränderung der Immunsignal ^4. Porphyromonas gingivalis, eine Gram-negative anaerobe sowohl mündlich als auch in Verbindung gebracht extraoralen Erkrankungen, ist ein Beispiel eines hoch angepasst bakterielles Pathogen Lage verursacht pathogenen Veränderungen im Aufnahme ^5-7.

Taschen der Biofilm Plaque in tiefen Spalten zwischen den Zähnen und Zahnfleischschleimhautgewebe gebildeten anaeroben Bakterien, die von Luftsauerstoff ⁸ geschützten Hafen abgegrenzt. Diese Zahnfleischtaschen dienen als Nische für verschiedene anaerobe Erreger wie P. gingivalis ^9. P. gingivalis ist eine Keystone-Erreger, der in der Lage ist, umgestaltening die mündliche mikrobiellen Gemeinschaft in einer Weise, die Entwicklung und Progression von Parodontalerkrankungen ¹⁰ zu fördern. Es erzeugt eine große Anzahl von Virulenzfaktoren, die aktiv sind gegen ein breites Spektrum von Wirtsproteinen und stellt Mechanismen für die Umgehung der Wirtsabwehr ^11. Es ist auch in der Lage eindringenden Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und Parodontalligament Zellen in vitro und in ^{vivo-12-14 15.} Durch die effiziente Invasion von Wirtszellen, P. gingivalis kann Wirtsimmunität zu entkommen. Effektive Invasion von Wirtszellen ermöglicht nicht nur das Bakterium, um Wirtsabwehr zu entkommen, sondern dient auch als Reservoir für künftige Re-Infektion als auch verändert die Wirtszelle. Untersuchungen der molekularen Mechanismen der Adhäsion und Internalisierung des Bakteriums durch Wirtszellen beteiligt sind, erforderlich ist. Forschung in mehreren Laboratorien wird auf das Verständnis der molekularen Vorgänge bei der Internalisierung von P. assoziiert konzentriert gingivalis durch die Wirtszellensowie die verwendet werden, um zu unterdrücken und zu entführen, die Immunantwort und zu überleben, die feindlichen Abwehrmechanismen Mechanismen.

Es gibt viele Tests, die die Identifizierung und Charakterisierung von Krankheitserregern, die in der Lage ist eindringenden Wirtszellen sind. In vitro-Studien mit anaerobe Pathogene Jedoch stellen viele experimentelle Probleme für die Forscher vor allem, weil es schwierig ist, Untersuchungen mit sperrigen Instrumente in Abwesenheit von Sauerstoff zu bauen. Dies wird durch die Tatsache, dass eukaryotische Zellen benötigen Sauerstoff, zu wachsen und müssen somit separat in Gewebekultur-Inkubatoren hergestellt werden verstärkt. Ein Weg, um solche Hindernisse zu vermeiden, wäre es, die Untersuchungen unter atmosphärischem Sauerstoff durchzuführen, aber das würde das Wachstum von anaeroben Bakterien unmöglich machen. Ein weiteres Verfahren wäre die durch Wärme abgetöteten Bakterien zu verwenden, um zu infizieren und zu studieren Host-Zell-Interaktionen. Zwischen Hitze abgetöteten und lebensfähigen Bakterien, die die Relevanz der Wirt-Pathogen interacti verringern bestehen jedoch Unterschiede^am 16. Es ist von zentraler Bedeutung für lebensfähige Bakterien mit unveränderter Expression Interaktion mit Wirtszellen zu studieren; Daher sind Verfahren zur Züchtung von P. gingivalis in einer anaeroben Umgebung gegeben. Auch sind zwei einfache kosteneffektive Protokolle zur Bewertung der Fähigkeit von P. zeigten gingivalis durch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) internalisiert werden. Das erste Protokoll basiert auf dem beliebten Antibiotikum-Schutz-Assay basiert. Obwohl der Test ist einfach, sind Überlegungen bei der Verwendung von anaeroben Mikroorganismen gegeben. Das zweite Protokoll erfordert die Verwendung eines fluoreszierenden Scanning-Mikroskop zur Visualisierung Interaktion und verinnerlicht P. gingivalis. Jeder Test hat seine Grenzen und Vorteile, die diskutiert werden, den Forscher eine Gliederung für die Untersuchung der Invasivität von anaeroben Bakterien bereitzustellen. Obwohl die aktuelle Manuskript studiert P. gingivalis und HUVECs können diese Protokolle für viele andere anaerobe Bakterien ebenso verwendet werdenwie für andere Arten von Wirtszellen.

Protocol

Die folgenden Protokolle werden Methoden für die Kultivierung und Untersuchung der Invasion durch die anaerobe Arten, P. beschreiben gingivalis; jedoch können diese Protokolle für eine Reihe von anaeroben Pathogene verwendet werden. Obwohl HUVECs verwendet werden, kann dieses Protokoll für andere eukaryontische Zellen sowohl immune und nicht-immune verwendet werden.

1. anaeroben Kammer Betrieb und Wartung

Hinweis: P. gingivalis ist eine anaerobe empfindlich auf ein normales Niveau von Sauerstoff in der Luft auftreten. Eine kontrollierte anaerobe Umgebung ist für die Kultivierung von P. gingivalis.

1. Hier aufrechtzuerhalten eine gemischte anaerobe Gas (80% _N 2, _10% H 2, 10% _CO 2) in einem Vinyl anaeroben Kammer (1A) bezeichneten künstlichen Atmosphäre. Verwenden Sie eine Luftschleuse (1B) für die Übertragung von Artikeln aus der Laborumgebung zu der anaeroben Kammer. Die Luftschleuse betreibt manuell, twEis Spülung mit _N2-Gas vor der Einführung des gemischten anaeroben Gas.
2. Verwenden Sie einen Schwefelwasserstoff-Entfernungssäule (1C) für wartungsfreie Entfernung der unerwünschten Schwefelwasserstoff. Legen Sie einen Luftentfeuchter in der Kammer, um _H 2 O durch den Katalysator zu entfernen und Aerosole, die die Ausbreitung der Kontamination zu erleichtern vermeiden.
   Anmerkung: Schwefelwasserstoff ist ein natürliches Stoffwechselnebenprodukt vieler anaeroben Bakterien und ihre Akkumulation Bakterien toxisch und kann in einer Beschädigung des elektronischen Folge und eine Verringerung der Lebensdauer des Katalysators.
3. Verwenden Sie ein Fan-Box auf der Kammeratmosphäre durch eine Palladium-Katalysator, der Sauerstoff in Gegenwart von Wasserstoff (Abbildung 1D) entfernt zu zirkulieren.
   Hinweis: Ein Rezirkulieren Atmosphären (HEPA) Filter entfernt Verunreinigungen aus der Luft mit einer Grße von 0,22 um oder mehr.
4. Kultur anaeroben Bakterien in einem Inkubator bei 37ºC, die in der anaeroben befindetKammer. Verwenden Sie Standard-aseptischer Techniken beim Arbeiten im Inneren des anaeroben Kammer.

Abbildung 1. Anaerobe vinyl Kammer und seiner Komponenten. (A) einem Vinyl anaeroben Kammer vollständig vom Luftsauerstoff abgedichtet stellt Arbeitsplatz für zwei Personen zu einem Zeitpunkt (32 in x 78 in). Es enthält einen Brutschrank bei 37 ° C (hinten Mitte) eingestellt. (B) eine Luftschleuse für den Transfer von Artikeln aus der Laborumgebung zu der anaeroben Kammer eingesetzt. Pictured ist eine automatische Luftschleuse durch eine Steuerung, die so programmiert, dass das Vakuum und Säuberungsverfahren erforderlich, um eine anaerobe Umgebung zu erstellen automatisch durchführen kann betrieben. (C) Eine Entfernung von Schwefelwasserstoff Column bietet wartungsfreien Hochleistungs Entfernung unerwünschter Schwefelwasserstoff. (D) Zwei Katalysator-Fan-Boxen sindwährend des anaeroben Kammer angeordnet, um die Zirkulation der Raumatmosphäre durch Palladium-Katalysator, der in Gegenwart von Wasserstoff, Sauerstoff entfernt. Die anaeroben Kammer wird gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Herstellung von anaeroben Bakterien

Hinweis: P. gingivalis aerotolerant und kann unter aeroben Bedingungen gelagert werden, aber es wird nicht in Gegenwart von Sauerstoff wachsen auf einem höheren Niveau als 6% ^17,18. Einer anaeroben Kammer ist notwendig für die ordnungsgemäße Pflege der P. gingivalis und anderen anaeroben Spezies (Abbildung 1). Richtiges Training und Ausbildung auf anaeroben Kammer Gebrauch ist, bevor Sie mit microanaerobes ¹⁹ erforderlich.

1. Gleichgewicht kommen alle flüssigen Medien und Platten, um anaerobe conditIonen für mindestens 12 h vor dem Experiment um den restlichen Sauerstoff zu entfernen.
2. Bringen P. gingivalis von -80 ° C Gefrierschrank bis anaeroben Kammer, noch auftauen.
3. Streak P. gingivalis auf Trypticase-Soja Blutagarplatten (TSA II mit 5% Schafblut). Wickeln Sie Platten in Parafilm und lagern bei 37 ° C in einer anaeroben Inkubator für 4-7 Tage.
4. Impfen P. gingivalis in 3 ml Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Brühe, ergänzt mit Hämin und Menadion einem angereicherten nicht-selektiven flüssigen Medien für die Isolierung und Kultur von anaeroben und anspruchsvoller Mikroorganismen, mit sterilen Schleifen.
   Hinweis: Für die langfristige Lagerung, Mischung Bakterienkulturen in BHI mit Glycerin oder DMSO (10-20% Endkonzentration) und in einen -80 ° C Gefrierschrank vorbereitet.
5. Bereiten Sie eine Starterkultur von P. gingivalis, indem Sie eine 1:10 Verdünnung und damit Bakterien bis Mitte der log-Phase wachsen.

Anmerkung: Die optische Dichte des bacterial Suspension wird bestimmt, und die Bakterienkonzentration für jeden Stamm untersucht werden eingestellt. Für P. gingivalis eine Suspension bei einer OD ₆₆₀ von 0,7 entspricht der mittleren log-Phase und ~ 7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml. In dem Protokoll beschriebene Wachstumsbedingungen vorstehend spezifisch für P. gingivalis und eventuell auf andere Bakterienstämme angepasst werden.

3. Endothelzellkultur

Hinweis: Der Kauf gepoolt primäre HUVECs und Kultur in Basalmedium, enthaltend vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) bei 37 ° C in 5% _CO 2 nach Herstelleranweisungen.

1. Samen HUVECs in T-75-Flaschen mit 2,5 ^× 10 5 Zellen / Kolben in 15 ml VEGF Medien.
   Hinweis: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit über ein 1: 1-Verdünnung mit 4,0% Trypanblau. Zellen, die mit einem geschwächten Membran Trypanblau behalten, werden gesunde Zellen mit intakten Membranen weiß erscheinen, wenn sie unter einem binokularen Lichtmikroskop. CounT 100-Zellen, zu gewährleisten, dass über 80% der Zellen lebensfähig ^{sind 20.}
2. Ersetzen Medien alle 2 Tage mit vorgewärmter Frisch VEGF Medien, bis die Zellen zu erreichen ~ 80% Konfluenz.
3. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmten PBS. Befreien Zellen von der T75-Flasche durch Inkubation mit 2 ml Trypsin-EDTA (0,25%) für 5 Minuten, gefolgt von 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung.
4. Sammeln suspendiert HUVECs in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie keine zusätzlichen Zellen aus T-75-Kolben mit PBS und Transfer in 50 ml konischen Röhrchen.
5. Zentrifuge Zellen bei 200 g für 10 min.
6. Überstand entfernen, auszusetzen Zellpellet in 10 ml vorgewärmten VEGF Medien.
7. Bestimmen Sie, Zellkonzentration mit einer Zählkammer oder ähnliche Zellzählung Gerät.
8. Berechnen Menge an Zellsuspension, um entweder auf 6-Well-Platte (400.000 / well) oder 12-Well-Platte mit Deckgläsern hinzufügen (50.000 / Well). HUVECs werden bereit für Experimente am nächsten Tag.

4. Überlebensassay Invasion / Interaction(Überzug)

Anmerkung: Bei der Durchführung dieses Tests, bereiten zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Endothelzellen auf 400.000 Zellen / Well. Eine Platte wird verwendet, um Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Die andere Platte wird für intrazelluläre Bakterien ausmachen. Die 6-Lochplatte ermöglicht Triplikaten von zwei Proben in einem Experiment durchgeführt werden. Für einen Überblick über dieses Protokoll finden Sie in der Überlebensassay Flussdiagramm (Abbildung 2) zu entnehmen.

1. Bereiten anaerobe Bakterien, wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 1), bis sie Mitte der log-Wachstums (OD ₆₆₀ von 0,5 bis 0,7) zu erreichen.
2. Zentrifuge Bakterien bei 5.000 × g für 10 min.
   Hinweis: Wenn Zentrifuge außerhalb anaeroben Kammer führen Bakterienproben in einem dicht verschlossenen 15 ml-Tube, wickeln Sie die Kappe mit Parafilm zu Sauerstoff Auslaufen zu verhindern.
3. Zeigen pelletiert P. gingivalis zurück in der Kammer, Überstand verwerfen. Erneut mit PBS waschen, Pellet-Bakterien vor Resuspendieren in VEGF michdia. Vorbereitung Suspensionen für alle Bakterienstämme bei einer OD ₆₆₀ von 0,7, die bis zur mittleren log-Phase (~ 7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml) entspricht, getestet werden. Die Bakterien sind nun bereit für die Infektion.
4. Transfer 6-Well-Platten, die HUVECs von Gewebekultur-Inkubator in anaeroben Kammer. Entfernen Sie das Medium und dreimal mit anaeroben PBS. 2 ml der anaeroben VEGF Medien in jede Vertiefung und legen die Platten bei 37 ° C in der anaeroben Inkubator für 20 Minuten, um die Temperatur für eine Infektion zu äquilibrieren.
   Hinweis: Platte Bakterien auf Blutagarplatten, diejenigen für die Infektion verwendet, sicherzustellen, sind homogen und nicht nach Infektion kontaminiert.
5. Infizieren Wirtszellen mit Bakterien bei einer Multiplizität der Infektion (MOI Bakterien: Host) von 100: 1.
   Anmerkung: HUVEC-Zellzahl durch Ausführen einer Trypanblau-Ausschlusstests an einem einzigen Bohrloch vor der Infektion bestimmt. Bakterienzellzahl wird über die optische Dichte bestimmt (beispielsweise von 0,5 OD = 5 x ¹⁰ 8 Zellen / ml). Bacterial Konzentration auf richtige MOI basierend auf HUVECs Konzentration ²¹ eingestellt.
6. Legen Sie 6-Well-Platten mit infizierten HUVECs in anaeroben Inkubator und lassen Bakterien mit Wirtszellen für 30 Minuten zu interagieren.
7. Vorbereitung Saponin in BHI (1,0% w / v) in der anaeroben Kammer und filtriert durch einen 0,2 um Filter.
8. Überleben beider befestigt und verinnerlicht Bakterien.
   1. Platten entfernen aus dem Inkubator, absaugen Medien, waschen dreimal mit anaeroben PBS und 2 ml gefiltert 1,0% Saponin (hergestellt wie in Schritt 4.8 beschrieben). Inkubieren Sie für 15 Minuten, um Host-Zell-Lyse zu ermöglichen.
   2. Kratzen Boden jeder Vertiefung mit Zellschaber. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und eine 1: 1-Verdünnung in BHI.
   3. Fahren Sie mit seriellen Verdünnungen der Probe zu machen. Je nach Bakterienart und Konzentration, passen Verdünnungsreihen. Beginnen Sie mit 1: 100 oder 1: 1000 Verdünnungen.
   4. Platte 200 ul gewünschte Verdünnung auf Blutagarplatten. Wrap ter Platten in Parafilm und in der anaeroben Inkubator bei 37 ° C.
   5. Nach sieben Tagen Inkubation bei 37 ° C, entfernen Sie die Platten und zählen koloniebildenden Einheiten (KBE) mit der Lichtbox manuell zählen Kolonien.
      Hinweis: KBE aufgezählt werden. Für größere Mengen an CFUs können Bilder aufgenommen werden, und Computersoftware kann verwendet werden, um die Zählung von CFUs erleichtern.
9. Survival of verinnerlicht Bakterien.
   1. Platten entfernen aus dem Inkubator. Dreimal Waschen mit anaeroben PBS und 2 ml VEGF Medien, ergänzt mit Antibiotikum (300 ug / ml Gentamicin und 400 ug / ml von Metronidazol).
   2. Inkubation für 1 Std. Achten Sie darauf, die Antibiotika zu testen, so dass sie zu 100% effektiv bei der die gewünschte Bakterienstamm zu töten und stellen Sie sicher, dass sie Wirtszellen ^22,23 nicht durchdringen.
   3. Absaugen Medien, 2 ml gefiltertes 1,0% Saponin. Inkubieren Sie für 15 Minuten, um Host-Zell-Lyse zu ermöglichen.
   4. Kratzen Sie unten auf jeder well mit Zellschaber. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und stellen Sie 1: 1-Verdünnung in BHI.
   5. Bereiten Sie Verdünnungen der Probe (1: 100, 1: 1.000).
   6. Platte 200 ul gewünschte Verdünnung auf Blutagarplatten. Wickeln Sie Platten in Parafilm und in anaeroben Inkubator.
   7. Nach sieben Tagen Inkubation bei 37 ° C Platten zu entfernen und zu zählen KBE.

Abbildung 2. Schematische Darstellung eines Protokolls für das Überleben von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen verwendet. Beide Assays für insgesamt bakterielle Überleben und das Überleben von verinnerlicht Bakterien können zur gleichen Zeit durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Internalisierung von Bakterien in Wirts Cells (Fluoreszenz-Mikroskopie)

Hinweis: P. gingivalis ist mit 2 'bezeichnet, 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM ist ein nicht-fluoreszierendes membranpermeablen Farbstoff; ihre Umwandlung in Fluorescein BCECF über die Wirkung der intrazellulären Esterasen kann angeben Zellviabilität. P. gingivalis mit BCECF-AM-Farbstoff markiert und dann verwendet, um eukaryontische Zellen zu infizieren. Nach der Infektion werden die Zellen fixiert und mit DAPI und TRITC-Phalloidin markiert. Die DAPI-Färbung verwendet, um die eukaryotische Zellkern Fleck wird auch beschriften bakteriellen Zellkern, der eine Gegenmaßnahme, um nicht lebensfähige Bakterien, die nicht können metabolisch spalten BCECF-AM zu identifizieren bietet. Wirtszellen werden mit TRITC-Phalloidin rotem Aktin Farbstoff markiert.

1. Autoklaven Deckgläser. Aseptisch Deck zu 12-Well-Platten hinzuzufügen vor der Aussaat Endothelzellen bei 5 × ¹⁰ 4 Zellen / Vertiefung. (Vorbereitet Tag vor Versuch)
2. Bereiten anaeroben Bakterien bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet (OD ₆₆₀ = 0,5-0,7), wie in Kapitel 1 beschrieben.
3. Wasch Bakterien 2x mit anaerober PBS durch Zentrifugation bei 5.000 × g und Suspensions Pellet in PBS bei 5-7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml.
4. Werden 20 ul 0,2 mM BCECF-AM bis 2 ml Bakteriensuspension (5-7 x ¹⁰ 8 Zellen / ml) zu einer Endkonzentration von BCECF-AM von 2 uM.
5. Inkubieren bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
6. Übertragungsplatten mit Endothelzellen auf 18 mm (# 1.5 Dicke) kreisförmigen Deckgläser von Gewebekultur-Inkubator ausgesät in den anaeroben Kammer. Mit PBS und Austausch mit anaeroben VEGF Medien waschen.
   Hinweis: Überprüfen Sie, ob HUVECs werden unter einem Lichtmikroskop gesund. HUVECs sollte ~ 80% konfluent waren, sollten vergleichbare Morphologie für die Hersteller sein.
7. Centrifuge markierten Bakterien an5.000 × g für 10 min, um restliche BCECF-AM Farbstoff zu entfernen. Suspend in 2 ml anaeroben VEGF Medien.
8. Infizieren Wirtszellen mit markierten Bakterien bei einer MOI von 100: 1 (Bakterien: Host).
9. Inkubieren in anaeroben Kammer bei 37 ° C für 30 min.
10. Nach der Infektion Wasch Zellen mit PBS dreimal und in frisch hergestellten 4,0% Para fix für 10 min.
    Hinweis: Nach der Fixierung von Zellen, kann Experiment außerhalb der anaeroben Kammer durchgeführt werden.
11. Waschdeckgläser mit PBS dreimal.
12. 1 ml 0,2% Triton X-100 für 10 min.
13. Waschdeckgläser mit PBS dreimal.
14. Dann werden 50 ul des TRITC-Phalloidin (50 ug / ml) auf Deckgläsern für 45 min.
15. Wash Deckgläser dreimal, von der 12-Well-Platte und setzen Sie auf einem Objektträger mit Soft-Set Eindeckmedium enthält DAPI. Dichten Sie die Seiten mit Nagellack.
    Hinweis: Die Objektträger können für ein paar Monate im Dunkeln gelagert werden. Vermeiden Sie Belichtung zur Photobleaching zu verhindern.
16. Blick gleitetmit einem konfokalen Mikroskop.
    1. Hier verwenden Sie ein 34-Kanal spektrale System (32-Kanal-Array-Detektor und zwei Seiten PMT-Detektoren, sowie eine Durchlichtdetektor) um eine AxioObserver (invertiert) konfiguriert, stehen mit einem motorisierten XY-Tisch. Das System verfügt über fünf Laser: blau-Diode (405 nm), mit mehreren Leitungen Argon (458, 488, 514 nm), grüne Diode (561 nm), roten HeNe (633 nm) und einem 440 nm gepulsten Laser. Anlegen eines Fluorescence Lifetime Imaging-System mit 2-Hybrid GaAsP Detektoren (für FRET-FLIM).
    2. Detektieren die Fluoreszenz von DAPI und TRITC in einem Kanal unter Verwendung eines Dual-Band-Filter mit Anregungswellenlängen von 340-380 nm und 540-560 nm und einem Emissionsfilter von 435 bis 485 nm und von 570 bis 590 nm. Detektieren die Fluoreszenz von BCECF-AM unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 440 bis 500 nm und einem Emissionsfilter von 510 bis 590 nm.
       Hinweis: Steuerungen für BCECF-AM sollte auf jedem Bakterienstamm durchgeführt werden untersucht, um die ordnungsgemäße Kennzeichnung der lebensfähigen Bakterien zu gewährleisten. Zuerst überprüfen, dass nonviable Bakterien sind DAPI-positive und BCECF-negativ. Zweitens, sicherzustellen, dass lebende Bakterien können BCECF-AM in Fluorescein BCECF verstoffwechseln. Variable Konzentrationen der Bakterien oder BCECF-AM Farbstoff eventuell auf optimaler Kennzeichnung geprüft werden.

Representative Results

Protokolle oben umrissen wurden bei der Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktion zwischen P. verwendet gingivalis und Endothelzellen. P. gingivalis W83 und P. gingivalis V3150, welches eine Deletion des PG0228 wurden in der Studie verwendet. Das PG0228 vorhergesagt wird, ein Protein, das die Pegel der RNA und Proteinen verändern können, was sich letztlich auf eine Wechselwirkung von P. kodieren gingivalis mit Wirtszellen. Um die Wirkung der PG0228 auf P. untersuchen gingivalis Fähigkeit, mit Wirtszellen zu interagieren, die Fähigkeit der parentalen und mutanten Stämmen mit HUVECs in Wechselwirkung verglichen. Das Überleben Protokoll (Abbildung 2) wurde in dieser Studie verwendet. Somit wurden beide Stämme zur logarithmischen Phase gezüchtet, wie in Schritt 2 beschrieben Beide Stämme hatten ähnliche Wachstumskurven und somit keine wesentlichen Probleme mit Normalisierung der Zellzahlen wurden vor der Infektion wurde gefunden. Folgenden sieben Tagen Inkubation wurden CFUs auf das Blut ein beobachtetGAR Platten (Figur 3). Mehreren Verdünnungen 1.10 (3A), 1: 100 (3C) und 1: 1000 (3B) wurden auf Blut-Agar-Platten plattiert. Wie in 3A gesehen die Anzahl der Kolonien zu hoch waren, um zu beurteilen; die Kolonien indiscernible voneinander und bezeichnet als "zu viele zu zählen" [TMTC]. Die Verdünnung in 3B zu niedrig als zu wenige Kolonien erhalten werden. Die Verdünnungen von 1: 100, wie in 3C gezeigt, war wünschenswert, da die Kolonien erkennbar sind und die Anzahl der Kolonien waren kontrollierbar zu zählen. Ähnliche Ergebnisse wurden für den Mutantenstamm V3150 (3D) gefunden. Damit der CFUs wurden von den Platten mit dem Verdünnungsfaktor von 1 aufgezählt: 100 beträgt.

Verwendung der Anzahl der CFUs und den Verdünnungsfaktor wurde die geschätzte Anzahl von lebensfähigen Bakterien, die für jeden Stamm gewonnen berechnet. Dividieren der Anzahl der viable-Bakterien durch die anfängliche Anzahl der Bakterien zu einer definiert als die Invasion Wirkungsgrad zurückgewonnen. Beim Vergleich der Invasion Effizienzen beider Stämme, Wildtyp W83 überlebt in HUVECs mit hohem Wirkungsgrad, während Stämme fehlen PG0228 zeigten eine signifikante Reduktion der Überlebensrate (Abbildung 4).

Um weiter zu verifizieren, dass der Mangel auf Überleben, anstatt reduziert Internalisierung der Bakterien war, wurde die Mikroskopie-Analyse durchgeführt. HUVECs mit P. infiziert gingivalis wurden unter einem Mikroskop (Figur 5) betrachtet wird. In diesem Beispiel ist ein HUVEC dargestellt. Um die Anzahl der Bakterien zu bestimmen internalisiert mehrere Bilder wurden bei unterschiedlichen Brennweiten aufgenommen, um eine Z-Stapel so dass für räumlich-zeitliche Identifizierung internalisiert P. erhalten gingivalis. Auch mindestens 40 Zellen / Experiment sollte untersucht werden (für jede biologische Replikat) und die Anzahl der verinnerlicht Bakterien für jede st aufgezähltRegen. Wenn die Anzahl der internalisierte Bakterien ist die gleiche für jeden Stamm, wenn er unter einem Mikroskop betrachtet werden beide Stämme eindringen HUVECs gleichermaßen; Allerdings hat die Mutante V3150 Fähigkeit, während innerhalb der Wirtszelle, wie in dem Antibiotikum-Schutzassay gesehen überleben reduziert.

Abbildung 3. Die Ergebnisse einer bakteriellen Überlebensassay. Protokoll für die Überlebensrate von intrazellulären Bakterien wurde verwendet, um die Fähigkeit von Wildtyp P. bewerten gingivalis W83 und eine Mutante V3150 Mangel an PG0228 zu erobern und überleben in HUVECs. Verinnerlicht lebensfähigen Bakterien werden durch Visualisierung der KBE nach der Inkubation von HUVECs- P. ermittelt gingivalis Mischung auf Blutagarplatten sieben Tage lang unter anaeroben Bedingungen. Blutplatten auf Licht-Box, die Kontrast erhöht und erleichtert das Zählen der CFU platziert. Verschiedene Verdünnungen wurden exProben beurteilt. HUVECs mit P. infiziert gingivalis W83 Verdünnungs 1.10 (A), Verdünnung 1: 1000 (B), und Verdünnung von 1: 100 (C). HUVECs mit P. infiziert gingivalis V3150 Verdünnung 1:. 100 (D) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Vergleich eines Überlebensraten zwischen Eltern und mutierte Bakterienstämme. HUVECs wurden mit Wildtyp P. infiziert gingivalis W83 und eine Mutante V3150 Mangel an PG0228. Protokoll für das Überleben, wie in Figur 2 dargestellt wurde, wurde gefolgt. Experiment wurde dreimal dreifach durchgeführt und die Durchschnittswerte ± Standardabweichungen dargestellt. Invasion Effizienz stellt lebt / anfänglichen Bakterien.* Die mutierten Stamm wurde statistisch signifikant reduzierte Überlebensrate im Vergleich zu dem Wildtyp W83 Stamm (P <0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5. Beispiel einer mikroskopischen Analyse P. gingivalis durch HUVECs. HUVECs verinnerlicht wurden mit BCECF-AM infiziert markiert P. gingivalis für 30 min bei einer MOI von 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Zellen wurden mit Paraformaldehyd fixiert und mit TRITC-Phalloidin und DAPI markiert. Das Bild zeigt einen einzelnen HUVEC mit dem Kern (A) und F-Aktin (B) gefärbt blau und rot sind. Der Pfeil zeigt P. gingivalis markierte grüne (C). Eine fusionierte image erzeugt wird, um P. zeigen gingivalis Invasion in HUVECs (D). Die Bilder wurden mit Scan Konfokalmikroskop produziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Alle oben genannten Verfahren können verwendet werden, um spezifische Assays, um die Wechselwirkung von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen beurteilen zu entwerfen. Jedoch gibt es einige Überlegungen, die Versuche erfolgreich durchzuführen. Zuerst gibt es die Mikrobenstämme in einer Studie verwendet werden.

Es ist von entscheidender Bedeutung bei dem Vergleich von zwei Stämmen sowohl mit dem Überlebens-Assay sowie durch Mikroskopie-Analyse, daß sie sich in einer ähnlichen Wachstumsphasen und erreichen ähnliche Zellkonzentrationen etwaige Unterschiede in der oben genannten können Invasion Effizienz ¹³ beeinflussen. Als Wachstumskurven unterscheiden zwischen zwei Bakterienstämmen, sollten Anpassungen vorgenommen, um letztendlich zu erreichen ähnliche Wachstumsmuster teilen konsequente Konzentration ²¹ werden. Außerdem sollten Bakterien gleichmßig dispergiert werden, um die Zellaggregation zu verhindern. Weiterhin ist es kritisch, Antibiotika, die extrazelluläre Bakterien wirksam beseitigen auszuwählen. Wenn gewählten Antibiotikum hat nachteilige Auswirkungen auf Wirtszellen, dannein anderes Antibiotikum oder lytischen Enzymen verwendet werden ^24,25. Schließlich müssen Dehnungs Heterogenität berücksichtigt werden; obwohl eine Spezies identifiziert werden, um Wirtszellen eindringen werden, kann es große Unterschiede in der Pathogenität von einem Stamm zu einem anderen ²⁶ und damit eine Pilotstudie durchgeführt, sollte für jeden Stamm zu untersuchenden werden.

Ein zweiter kritischer Schritt ist es, eine optimale Inkubationszeit und bakterielle Inokulum beim Entwurf der Protokolle (Multiplizität der Infektion [MOI], die der Anzahl von Bakterien verwendet werden, um Wirtszellen zu infizieren, ist) herzustellen. Kürzere Inkubationszeiten wird bewerten die Fähigkeit der Bakterien, die von Wirtszellen internalisiert während längere Zeitpunkten benötigt werden, um überlebenden Bakterien als auch intrazelluläre Replikation ²⁷ bestimmen. Als intrazelluläre Überleben der Bakterien könnten durch die MOI betroffen sein, die verwendet wird, ist es am besten, um mehrere MOIs testen, um sicherzustellen, dass keine Schäden an Zellen verursacht wurde, die zum Zelltod oder permeabiliz führen würdeed Membranen mit Zugang zu Antibiotika-Tötung von intrazellulären Bakterien. Nach der Gründung MOI und Inkubationszeiten notwendig, um die spezifische Frage zu beantworten die Frage, wird der Versuch nach dem Protokoll laufen; jedoch sollten mehrere serielle Verdünnungen des eukaryotischen zell Bakterien Lysemischung werden. Das optimale Verdünnungsfaktor wird auf Basis beobachtet CFU bestimmt werden. Verdünnungsfaktoren, die in Platten mit 50-200 KBE führen sind optimal für die Beurteilung der Überlebens Effizienz. Wenn der CFU Zahl zu hoch ist, sind Kolonien indiscernible voneinander und es wird schwierig, jede Kolonie von Hand zählen. Wenn der CFU Zahl zu niedrig ist, übertreiben kleine Abweichungen die Falte Wechsel zwischen Stämmen untersucht sowie produzieren große Standardabweichungen zwischen Wiederholungen.

Eine dritte wichtige Punkt ist, um Wirtszellen, die gesund und bereit, mit Bakterien interagieren vorzubereiten. In dem obigen Protokoll Wirtszellen werden kultiviert, separat mit der üblichen aseptischen techniques. Der Einsatz von Antibiotika und Antimykotika in Gewebekulturen kann es ratsam sein, vor allem für Anfänger Zellkulturbiologen. Jedoch vor der Durchführung der Überlebens-Assay, Wirtszellen sollten in Antibiotika-freien Medium für mindestens 12 h vor der Übertragung der Zellen in die anaerobe Kammer kultiviert werden. Einmal in der Kammer sollte Medien mit anaeroben antibiotikafreiem Medium ausgetauscht werden, um während der Infektion nicht auf anaerobe Bakterien auftreffen. Falls Probleme mit dem Anbringen der Wirtszellen, um Kunststoff-Gewebekulturplatten oder Deckgläser kann es empfehlenswert sein, um eine Haftbeschichtung, wie Poly-L-Lysin oder Gelatine anzuwenden. Auch können Techniken zur Beschichtung von Gewebekulturschalen mit einem natürlich produzierten Basalmembran-ähnlichen extrazellulären Matrix (ECM) den Prüfer mit in vivo ähnlichen Bedingungen ^28,29 bereitzustellen. Lyse von Wirtszellen erfordert eine ausgewogene Reinigungsmittel in der Lage, Erschließung Wirtszellen ohne Änderung Lebensfähigkeit der Bakterien. Obwohl Saponin nicht kill Bakterien, kann es das Wachstum einiger Arten hemmen. Vor unserer Studien die Wirkung von Saponin auf P. gingivalis-Stämmen für den Host-Pathogen-Analyse verwendet wurde, überprüft, um keinen Einfluß auf ihr Wachstum / Überleben. Wenn Bakterien sind sehr empfindlich gegen Detergenzien, einschließlich Saponin, kann wiederholt Einfrieren und Auftauen oder destilliertes Wasser verwendet werden, um Wirtszellen mit wenig Schaden, um Bakterien zu lysieren werden.

Eine vierte kritischen Punkt enthält die Überlegungen bei der Durchführung der Mikroskopie Experimente ergriffen werden. Erstens ist die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs, um Bakterien für die Mikroskopie-Protokoll verwendet werden, zu kennzeichnen. Viele aktuelle Markierungsverfahren für Bakterien erfordern einen primären Antikörper oder übliche Bakterien Farbstoffen mit erheblichen Einschränkungen, wie toxische Effekte und ein Auslaugen des Farbstoffs in Umgebung wodurch hohe Hintergrund. BCECF-AM ist ein membrangängigen Farbstoff häufig als Fluoreszenzindikator der intrazellulären pH-Wert in sowohl Prokaryonten und Eukaryonten ^30-32 verwendet. Es erwies sich als wirksam bei der Benennung eines Bereichs von anaeroben Bakterien in früheren Studien ^33-35 sein. BCECF-AM nur beschriften lebensfähigen Bakterien in der Lage Veresterung. Die Umstellung auf die durch intrazelluläre Esterasen Ergebnisse in einer Leuchtstoffform, die viel langsamer aus den Zellen austritt als die Stammverbindung BCECF. Es gibt viele Fluoreszenzfarbstoffe und Färbetechniken, die verwendet werden können, ^36; jedoch beschreibt dieses Protokoll eine einfache Befestigung / Färbetechnik, die mit fast jeder Mikroorganismus verwendet werden kann. Außerdem können andere Farbstoffe (TRITC-Phalloidin und DAPI) werden verwendet, um die Grenzen der eukaryotischen Zellen und Konto besseren Unterscheidung nur Bakterien, die mit Wirtszellen zu interagieren.

Fluoreszenzfarbstoffe sind anfällig für Photobleaching und es gibt mehrere kommerzielle antifades und Montage Medien zur Verfügung, die Schwächung des Fluoreszenzsignals ³⁷ verhindern kann. Es gibt auch Entscheidungen zwischen schwer set Montage Medien einnd Soft-Set Einsen. Während die Fest gesetzt diejenigen zu erheblichen Veränderungen im Brechungsindex als auch Schrumpfung und Gewebeschäden ³⁸ ergeben sich die Soft-Einstellung Medien erfordern Dichtstoffe, wie Nagellack, um das Deckglas zu sichern. Dann wegen der Veränderungen zwischen infizierten eukaryotischen Zellen beobachtet; zur Analyse sollte die Anzahl der internalisierte Bakterien zwischen den Zellen variieren kann und somit mehrere eukaryontische Zellen verwendet werden. In unseren Studien sind mindestens vierzig eukaryotischen Zellen beurteilt und internalisierte Bakterien gezählt pro Experiment ^33,34. Schließlich, um Einzelzellen deutlich sichtbar zu machen, eukaryotischen Zellen für die Infektion verwendet werden, sollten nicht auf Konfluenz gezüchtet werden. Mikroskopische Untersuchungen Prevotella inter Infektion mit Epithelzellen zeigten Präferenz für spezifische Regionen der Wirtszellmembran und die Bakterien nicht zu Stellen, an denen epitheliale Zellen wurden in Kontakt miteinander und hatten keine Lamellipodia ³⁹ haftet.

Die lNachahmung der Mikroskopie konnte seinen geringen Durchsatz zu sein. Somit für die Großmengenangaben auf die invasive Eigenschaft von Bakterien einer Durchflußzytometrie kann ebenfalls verwendet ⁴⁰ werden. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Bakterien (dadurch gelöst, daß als für Bakterien für die Mikroskopie eingesetzt werden beschrieben wird) und ermöglicht das Studium von mehreren Proben in einer Zeit, die attraktiv für einige Forscher sein kann.

Änderungen der beiden Protokolle werden können, um Wege in Wirtszelle Aufnahme von Bakterien beteiligt zu identifizieren. Erfolgreiche bakterielle Invasion erfolgt in fünf Stufen: (1) Befestigung (2) Eintrag / Internalisierung (3) Menschenhandel (4) Persistenz und (5), ^Ausfahrt 41. So bei der Eingabe / Internalisierung, lokalisiert sich das Bakterium auf dem Host und usurpiert die Wirtszelle für die Internalisierung durch Modifizieren Signaltransduktion. Selektive Stoffwechselinhibitoren zugesetzt werden, um Zellen auf Änderungen bei der Signalisierung, die zu erfolgreichen Invasion bestimmen hosten. FürBeispiel Latrunculin, die Aktin-Polymerisation hemmt, kann verwendet werden, zu untersuchen, wie Zytoskelett Umlagerung Internalisierung von P. beeinflusst werden gingivalis. Antikörper, die zellspezifischen Rezeptoren oder siRNA in der Lage umzuwerfen bestimmter Zielgene können auch für ein besseres Verständnis der Wirtszelle Signalwege in bakteriellen Internalisierung beteiligt sind, verwendet werden. Während alle Stoffwechselinhibitoren sollte minimal Gesamteffekt auf Wirtszellen, außer dem einen haben untersucht, ist es wichtig, die Inhibitor-Behandlungen sorgen für eine toxische Wirkung auf Bakterien nicht haben.

Zukünftige Studien würde schauen, um einige dieser Techniken zu perfektionieren, möglicherweise erreichen eine weitere in-vivo-ähnlichen Zustand. In der aktuellen Artikels, werden entweder Bakterien oder Wirtszellen, um rauen Umgebungen ausgesetzt sind. Nach dem Organismus, der Zelllinie, und das Ziel des Versuchs haben einige Forscher bevorzugen dem obigen Protokoll in _einem CO 2 -Inkubator durchzuführen. Allerdings parodontalen Läsions während eines anaeroben Mikroumgebung, in der die Bakterien in Wechselwirkung mit dem Host. Eine Studie, die Variationen in der zellulären Antwort auf die mündliche Bakterien unter aeroben gegenüber anaeroben Bedingungen herausfordern sucht berichtet, dass unter vermindertem Sauerstoffspannung (2% Sauerstoff) Bakterien, zB, Tannerella forsythia, P. gingivalis und P. inter ausgelöst höhere Spiegel von IL-8 und TNF & alpha; gegenüber aeroben Bedingungen ^42. Die Fähigkeit der eukaryotischen Zellen, unter anaeroben Bedingungen zu überleben wurde auch durch Studien, die die Fähigkeit von humanen mesenchymalen Stammzellen, human Zahnfollikels Stammzellen menschliche gingivale Fibroblasten gingivalen Karzinom-Zellen und menschlichen oralen Epithelzellen ^43,44,45 sucht bestätigt. Unsere Untersuchungen mit WST-1 Zell-Proliferations-Assays zeigten, dass HUVECs kann für bis zu 48 Stunden unter anoxischen Bedingungen zu überleben. Die Entscheidung wurde getroffen, um die Zellen in der anaeroben Kammer, weil P. infizieren gingivalis ist empfindlich gegenüber anatmosphärischen Sauerstoffniveaus, während HUVECs können längere Zeiträume unter anaeroben Bedingungen zu überleben. Forschung in Zukunft Umsetzung mikrofluidischer Zellkulturvorrichtungen, die Sauerstoff zu versorgen, um eine Oberfläche einer Monoschicht (wie einer Arterie) und anaerobe Bedingungen in der anderen ⁴⁶ zu untersuchen. Auf diese Weise Bedingungen werden weder für Bakterien oder Host nach Infektion geopfert werden. Zusammengefasst beschrieben sind ein paar einfache Protokolle, die verwendet werden können, um Wirt-Pathogen-Interaktionen für anaerobe Bakterien zu untersuchen. Diese Protokolle sind auch verwendet worden, um die Wirkung von bakteriellen Intern Proteine ​​fördern bakterielle Invasion ⁴⁰ sowie Surrogat nicht invasiven Bakterien ein Protein, das invasive Eigenschaft auf die Bakterien ⁴⁷ exprimieren beurteilen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200