牙龈卟啉单作为模式生物的评价厌氧细菌的相互作用与宿主细胞

Abstract

厌氧菌的数量远远超过许多人的壁龛，如肠道，口腔和阴道需氧菌。此外，厌氧菌感染是常见的，经常土著血统的。的一些厌氧病原体侵入人体细胞的能力使它们适应措施逃避先天免疫以及调节宿主细胞中的行为。然而，确保厌氧细菌是试验研究的事件可能会带来的挑战过程中活。 牙龈卟啉 ，革兰氏阴性厌氧菌，能够侵入的各种真核非吞噬细胞的。本文概述了如何成功培养和评估P的能力牙龈侵入人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。两个协议被开发：一个用于测量细菌，可以成功地侵入和主机内生存，而其他的可视化的细菌与宿主细胞相互作用。这些技术需要使用一个ANAE的罗比克室提供P.牙龈与最佳生长厌氧环境。

所述第一协议是基于抗生素保护分析，这在很大程度上是用于研究的宿主细胞的入侵的细菌。然而，抗生素保护测定是有限的;仅胞内细菌是培养的下列抗生素治疗和宿主细胞裂解计量。为了评估与宿主细胞，无论是活的和死的相互作用所有的细菌，我们开发了使用荧光显微镜检查宿主 - 病原体相互作用的协议。细菌荧光标记与2'，7'-二（2-羧乙基）-5-（和-6） - 羧基乙酰甲酯（BCECF-AM）和用于感染的真核细胞在厌氧条件下。以下定影用多聚甲醛和透用0.2％的Triton X-100，宿主细胞被标以TRITC鬼笔环肽和DAPI分别以标记细胞骨架和细胞核。多IMA在不同的联络点（Z堆栈）采取GES是为细菌的时空可视化获得。在这项研究中使用的方法可以适用于任何可耕厌氧菌和任何真核细胞类型。

Introduction

厌氧细菌定殖于人的身体的几乎所有表面。虽然主要在肠道和泌尿生殖道，其中氧气浓度是低的植物，它们也存在着在高水平上的皮肤，口，鼻，喉和^1。厌氧细菌是内源性感染的常见原因，并且经常从患病部位分离。由于它们的性质挑剔然而，厌氧菌可能很难分离和培养。研究涉及厌氧菌一定限制条件下进行。现代厌氧培养技术使研究人员模仿学习许多厌氧菌实验室菌株，甚至临床分离^2,3所需的厌氧设置。

致病性厌氧菌已经开发出一种动态关系和共同进化与它们所在的宿主细胞。最厌氧菌易受到达infecti之前杀死被宿主的免疫反应OU的水平。然而，一些病原菌已经开发机制从逃脱或破坏宿主的免疫反应。他们实现这一目标，通过机制，如免疫识别，免疫介导的中和，改变细胞介导的免疫，侵入宿主细胞，并改变免疫信号⁴的逃避。 牙龈卟啉 ，革兰氏阴性厌氧菌参与了口头和口外疾病， 是一个高度适于细菌病原体能够引起在宿主^5-7致病变化的一个例子。

生物膜斑块口袋累积在牙齿和牙龈粘膜组织间形成能够携带受保护的大气中的氧气⁸厌氧菌深的裂缝。这些牙周袋作为利基关于各种厌氧病原体， 诸如铜绿牙龈 ⁹ P。牙龈是一个梯形的病原体，它能够改造的荷兰国际集团的口腔微生物群落的促进发展的牙周病^10和发展方式。它产生了大量的有效对抗宿主蛋白广谱并提供机制宿主防御¹¹的逃避毒力因子。它也能够侵入上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞，和牙周膜细胞体外 ^12-14中 和体内^15。通过有效地侵入宿主细胞中，P。牙龈可以逃避宿主免疫。有效侵入宿主细胞不仅允许细菌逃离宿主防御但也作为贮存以备将来再感染以及改变宿主细胞。需要由宿主细胞参与粘附和细菌的内化的分子机制的研究进展。研究几个实验室的重点是了解与体育的内在关联的分子事件牙龈由宿主细胞以及用于抑制并劫持免疫反应和生存的敌对宿主防御机制的机制。

有能够识别和表征的病原体，其能够侵入宿主细胞的许多测定法。 但是 ，在体外研究与厌氧病原体提出了许多实验问题，为研究者主要是因为它是难以执行依赖于在不存在氧的笨重仪器研究。这是由真核细胞所需要的氧气，以成长，因此必须在组织培养孵化器分别制备的事实复杂。避免这种障碍之一的方法是将大气中的氧气下进行研究，但是这将使厌氧细菌的生长是不可能的。另一种方法是使用热灭活的细菌感染和研究宿主 - 细胞相互作用。然而，不同的削弱宿主 - 病原体interacti的相关性热灭活和可行的细菌之间存在^16。这是中央对学习活菌与不变的表达与宿主细胞相互作用的;因此，方法培养P.在厌氧环境牙龈给出。此外，两个简单的成本效益的协议被证明为评估P的能力牙龈由人脐静脉内皮细胞（HUVECs）被内化。所述第一协议是基于流行的抗生素保护测定。虽然实验非常简单，利用厌氧微生物时的注意事项给出。第二协议要求使用荧光扫描显微镜的可视化和交互内在P.牙龈 。每个测定有其局限性和将要讨论，以提供研究者的轮廓为研究厌氧菌的侵袭优点。虽然目前的手稿研究P.牙龈和内皮细胞，这些协议可以用于许多其它厌氧细菌以及作为其他类型的宿主细胞。

Protocol

以下协议将描述由厌氧种，P.培养和研究入侵方法牙龈 ;然而，也可以用于大量的厌氧病原体这些协议。虽然内皮细胞的使用，该协议可以用于其他的真核细胞两者的免疫和非免疫。

1.厌氧室中使用与维护

注意 ： 牙龈是厌氧菌对氧的正常水平在环境空气中遇到敏感。受控的厌氧环境是体育的培养至关重要牙龈 。

1. 这里，维持指定为混合厌氧气体（80％的N _{2，10％H 2，10％}的CO 2）中的乙烯基厌氧室中（图1A）的人工气氛。从实验室环境转印各色的厌氧室中使用一个气闸（图1B）。气闸手动操作，TW冰吹扫用_的 N 2气体引入该混合厌氧气体之前。
2. 免维护除去不希望的硫化氢的使用硫化氢去除塔（图1C）。放置室内的除湿机，以除去_H 2 O的通过催化剂产生并避免气溶胶促进污染扩散。
   注意：硫化氢是许多厌氧细菌的天然代谢副产物和它的积累是有毒的细菌，并可能导致损害电子和降低的催化剂的寿命。
3. 使用一个风扇箱通过钯催化剂，从而消除在氢的存在下（图1D）氧气流通腔室的气氛。
   注：再循环空气（HEPA）过滤器去除空气中的污染物以0.22微米或更大的尺寸。
4. 培养厌氧细菌在37℃培养箱位于厌氧的内室。厌氧室内工作时，使用标准的无菌技术。

图1.厌氧乙烯基室及其组件。（A）的乙烯基厌氧室中从大气中的氧完全密封（32英寸×78英寸）提供工作空间的两个人的时间。它包含一个孵化器设置在37℃（背面中间部分）。 （B）中的气闸，用于物品从实验室环境转移至厌氧室中。图为是一个自动气闸通过可以被编程以自动执行以创建一个厌氧环境所需的真空和吹扫步骤的控制器操作。 （ 三）硫化氢去除列提供免维护高容量去除不需要的硫化氢。 （D）两个催化剂风扇框放在整个厌氧室的形式，通过钯催化剂，其中，在氢的存在，除去氧循环室的气氛。厌氧室设置按照厂家的说明。 请点击此处查看该图的放大版本。

2.准备厌氧菌

注：P。牙龈是耐氧和可以存储在有氧条件，但在比^6％17,18更高水平的氧的存在也不会增加。厌氧培养室是为适当地栽培P的牙龈和其他厌氧物种（ 图1）。适当的培训和教育，厌氧室中使用与microanaerobes ¹⁹工作之前需要。

1. 平衡所有的液体介质和板厌氧康迪特至少12小时之前，实验离子以除去残余的氧。
2. 转移P.从-80°C冰箱厌氧室牙龈 ，让解冻。
3. 条纹P.牙龈上胰蛋白酶大豆血琼脂平板（TSA II含5％绵羊血）。在厌氧培养箱包裹板在封口膜，并储存在37℃下4-7天。
4. 接种P.牙龈于3ml脑心脏浸液（BHI）肉汤补充有氯化血红素和甲萘醌，富集非选择性液体培养基中厌氧和苛养微生物的分离和培养，使用无菌环路。
   注意：对于长期储存，混合制得的BHI与甘油或DMSO（10〜20％最终浓度），并将其放置在-80℃冷冻的细菌培养。
5. 准备P的发酵剂培养物牙龈通过使1:10稀释，并允许细菌生长，直到对数中期。

注意：BAC的光密度terial悬浮液被确定并且该细菌浓度为每个应变要被检查被调整。对于P.牙龈的悬浮液以0.7对应OD ₆₆₀至对数中期和〜7×10 ⁸细胞/ ml。以上在协议中所述生长条件是特异性的P.牙龈和可能需要适合于其他细菌菌株。

3.内皮细胞培养

注意：购买在5％CO ₂合并含有血管内皮细胞生长因子（VEGF）的初级内皮细胞和培养在基础培养基在37℃下，根据制造商的说明。

1. 种子的HUVECs在T-75烧瓶以2.5×10 ^5个细胞/烧瓶在15毫升的VEGF介质。
   注：1稀释4.0％台盼蓝：通过1检查可行性。细胞有损害膜将保留台盼蓝，健康的细胞胎膜完整双目光学显​​微镜下观察时，将显示为白色。 COUN牛逼100个细胞，保证细胞超过80％是可行的^20。
2. 更换介质每2天预热的新鲜VEGF介质，直至细胞达到约80％汇合。
3. 用预热的PBS洗一次细胞。通过用2ml胰蛋白酶-EDTA（0.25％）中5分钟，随后2 ml胰蛋白酶中和溶液孵育解放从T75烧瓶的细胞。
4. 收集在50毫升离心管中悬浮血管内皮细胞。从T-75瓶用PBS洗出任何额外的细胞和转移到50毫升锥形管。
5. 离心细胞，在200×g离心10分钟。
6. 除去上清液，悬浮细胞沉淀在10毫升预热VEGF媒体。
7. 确定使用血球或相似的细胞计数装置细胞浓度。
8. 计算的细胞悬液量添加至任一6孔板（400,000 /孔）或12孔板用盖玻片（50,000 /孔）。内皮细胞将准备试验的第二天。

4.存活试验入侵/互动（电镀）

注意：当进行这种测定，准备接种在40万个细胞/孔的内皮细胞的两个6孔平板。一个板将被用来评估附着并宿主细胞内在化细菌。其他板块将占到胞内细菌。在6孔板允许在一个实验中要执行的两个样品的一式三份。对于此协议的概要请参考存活测定法流程图（ 图2）。

1. 制备如上所述（参见第1部分），直到他们达到中等对数生长（OD ₆₆₀ 0.5-0.7）厌氧菌。
2. 离心机菌在5000×g离心10分钟。
   注意：如果离心机是外厌氧室中，携带细菌样品在密封15ml试管，包住盖用封口膜以防止氧气泄漏。
3. 将沉淀P.牙龈回到室内，弃上清。用PBS重悬在VEGF我之前再次洗涤，沉淀细菌直径。制备悬浮液的所有细菌菌株以0.7对应于对数中期（〜7×10 ⁸细胞/ ml）OD ₆₆₀进行测试。细菌现在准备感染。
4. 转印6孔板含有内皮细胞从组织培养箱成厌氧室中。取出介质和洗三次厌氧PBS。加2ml厌氧VEGF介质到每个孔中，并将板于37℃在厌氧培养箱20分钟以平衡感染的温度。
   注意：血琼脂平板上平板的细菌，以确保用于感染的那些是均匀的和感染时不被污染。
5. 感染宿主细胞与细菌于感染复数（MOI菌：主机）100：1。
   注意：HUVEC细胞数目由感染之前，在单一井进行锥虫排斥试验测定。细菌细胞数目通过光密度测定（例如，外径为0.5 = ^5×10 8个细胞/ ml）。乙acterial浓度基于对HUVECs浓度²¹调整到适当的MOI。
6. 放置6孔板与受感染的HUVEC成厌氧培养箱和使细菌与宿主细胞相互作用30分钟。
7. 制备皂苷在BHI（1.0％重量/体积）里面的厌氧室中并通过0.2微米的过滤器进行过滤。
8. 生存附加和内在的细菌。
   1. 从培养箱，吸介质除去板，洗三次，厌氧PBS中，加2ml滤1.0％皂甙（如在步骤4.8中所述制备）。孵育15分钟，以允许宿主细胞裂解。
   2. 每刮底以及与细胞刮刀。收集从每个孔的细胞混合物，并以1：1稀释于BHI。
   3. 继续以使样品的系列稀释液。根据细菌种类和浓度，调整连续稀释。开始1：100和1：1000的稀释液。
   4. 板200微升血琼脂平板上所需的稀释。裹吨他板在封口膜和发生在厌氧培养箱在37℃。
   5. 七天的培养在37℃，取出板和计数使用光框手动计数菌落菌落形成单位（CFU的）。
      注：CFU的列举。对于较大数量的CFU的，图像可以被获取并且计算机软件可以被用来促进的CFUs的枚举。
9. 生存内在的细菌。
   1. 从培养箱中取出盘子。厌氧PBS洗三次，并加入2毫升的VEGF媒体用补充抗生素（庆大霉素300微克/毫升和甲硝唑的400微克/毫升）。
   2. 孵育1小时。一定要测试的抗生素，所以他们是100％有效杀灭所需的细菌菌株，并确保它们不会穿透宿主细胞^22,23。
   3. 吸媒体，加2ml过滤1.0％皂甙。孵育15分钟，以允许宿主细胞裂解。
   4. 刮每个逢底l在细胞刮刀。从每个孔收集细胞混合物，并1:1稀释在BHI。
   5. 制备样品（1：100，1：1000）的系列稀释液。
   6. 板200微升血琼脂平板上所需的稀释。裹在板封口膜和发生在厌氧培养箱。
   7. 七天后的潜伏期在37℃除去板和计数的CFU。

图2.用于厌氧菌与真核细胞生存的协议的示意图。这两个试验共细菌的生存和内细菌的生存可以在同一时间进行。 请点击此处查看该图的放大版本。

5.内在细菌进入主策LLS（荧光显微镜）

注：P。牙龈被标记2'，7'-双- （2-羧乙基）-5-（和-6） -羧基，乙酰氧基甲基酯（BCECF-AM）。 BCECF-AM是一个非荧光膜可渗透染料;其通过细胞内酯酶的作用转化为荧光素BCECF可以指示细胞活力。P.牙龈标有BCECF-AM染料，然后用于感染的真核细胞。以下感染，将细胞固定并用DAPI标记和TRITC鬼笔环肽。用于染色的真核细胞核的DAPI染色也将标签细菌细胞核，它提供了应对措施，以确定非活细菌不能代谢裂开的BCECF-AM。宿主细胞突出了TRITC - 鬼笔，一个红色的肌动蛋白染料。

1. 高压灭菌盖玻片。以^5×10 4个细胞接种内皮细胞/孔之前无菌添加到盖玻片的12孔板中。 （实验前准备天）
2. 制备如在第1节中所述生长至对数中期厌氧菌（OD ₆₆₀ = 0.5-0.7）。
3. 洗涤细菌通过离心分离在5000 xg离心并在5-7×10 ⁸个细胞/ ml悬浮沉淀在PBS中2倍厌氧PBS中。
4. 加入20微升0.2mM的BCECF-AM至2ml细菌悬浮液（5-7×10 ⁸个细胞/ ml）与BCECF-AM为2μm的最终浓度。
5. 在37℃下在黑暗中30分钟。
6. 转移板与接种18毫米（1.5＃厚度）圆形盖玻片从组织培养箱进入厌氧室中的内皮细胞。用PBS和厌氧VEGF媒体交换洗涤。
   注：验证内皮细胞是在光学显微镜下健康。脐静脉内皮细胞应该〜80％融合，形态应该是媲美的厂商。
7. 离心机标记的细菌在5000×g离心10分钟以去除残留的BCECF-AM染料。暂停在2ml厌氧VEGF介质。
8. 感染宿主细胞在100 MOI标记的细菌：1（细菌：主机）。
9. 孵育在厌氧室中在37℃下30分钟。
10. 感染后洗涤细胞，用PBS三次并固定在新鲜制备的4.0％多聚甲醛10分钟。
    注意：固定细胞后，实验可以在厌氧室外面进行。
11. 洗涤盖玻片用PBS三次。
12. 加入1毫升0.2％的Triton X-100的10分钟。
13. 洗涤盖玻片用PBS三次。
14. 添加50微升TRITC鬼笔环肽（50微克/毫升），以盖玻片45分钟。
15. 洗涤盖玻片三次，从12孔板和地方去除一个用含有DAPI的软组安装介质滑动。密封边用指甲油。
    注：幻灯片可以储存一两个月在黑暗中。避免光线照射，防止光漂白。
16. 查看幻灯片使用共焦显微镜。
    1. 在这里，使用围绕AxioObserver（倒）配置了一个34通道光谱系统（32通道阵列检测器和两个侧PMT探测器，再加上透射光检测器）站在电动XY阶段。该系统具有五个激光器：蓝色二极管（405纳米），多线氩（458，488，514纳米），绿色二极管（561纳米），红色氦氖（633纳米）和一个440nm的脉冲激光。装备一个荧光寿命成像系统2混合的GaAsP检测器（用于FRET - FLIM）。
    2. 使用的双频带滤波器，340-380纳米和540-560纳米，和435-485纳米和570-590纳米的分别发射滤光片的激发波长检测来自DAPI和TRITC荧光一个通道。使用具有440-500纳米的激发波长和510-590纳米的发射滤波器的滤波器检测从BCECF-AM荧光。
       注意：控制BCECF-AM应在每个菌株做正在研究，以确保活菌适当的标签。首先验证nonviab勒细菌是DAPI阳性和BCECF阴性。其次，确保活细菌能代谢BCECF-AM为荧光BCECF。可变浓度的细菌或BCECF-AM染料可能需要对最佳标记进行测试。

Representative Results

上述协议在研究P之间宿主-病原体相互作用中使用牙龈和内皮细胞。P.牙龈 W83和P.牙龈 V3150携带缺失PG0228的是在研究中使用。的PG0228被预测可能改变的RNA和蛋白质的水平的蛋白质，其可最终影响P的相互作用编码牙龈与宿主细胞。研究PG0228对体育的影响牙龈的与宿主细胞相互作用的能力，亲和突变株与内皮细胞相互作用的能力进行比较。生存协议（图2）施加到这项研究。因此，两种菌株生长至对数生长期如在步骤2中所概述两种菌株有相似的生长曲线，因此没有显著问题在感染前遇到的细胞数的正常化。在温育七天，CFU的上观察到的血液中的噶尔板（ 图3）。几个稀释度1点10分（图3A），1：100（图3C）和1：1000（图3B）接种血琼脂平板上。 正如图3A的菌落数过高评估;殖民地是从对方指定的无形的“不计其数”[TMTC。在图3B中的稀释度为如太少菌落获得过低。 1的稀释： 图 3C所示100是可取的，因为殖民地的辨别和菌落数分别为便于管理计数。类似的结果被发现的突变体菌株V3150（图3D）。因此，CFU的是从具有1稀释因子将板列举：100。

使用的CFUs的数目和稀释因子，回收每个菌株活菌的估计数目，计算。除以viabl的数目Ë细菌由细菌引起定义为入侵效率比初始数量恢复。在比较两种菌株的入侵效率，野生型W83内的HUVECs以高效率存活，而株缺乏PG0228呈显著降低存活率（ 图4）。

为了进一步验证该缺陷是由于生存，而不是细菌的减少内化，进行显微镜分析。内皮细胞感染P.牙龈在显微镜（图5）下观察。在这个例子中，1 HUVEC呈现。为了确定内化细菌的数量的多个图像拍摄在不同的焦距，以获得Z堆栈允许内化P的时空识别牙龈 。此外，至少40个细胞/实验应分析（对于每个生物复制）和枚举为每个ST内化的细菌数雨。如果在显微镜下观察时内化的细菌的数量是相同的每个应变然后两种菌株侵入的HUVECs相等;然而，突变V3150减少生存而如在抗生素保护测定看出在宿主细胞内的能力。

图3.结果从细菌存活测定。议定书为胞内细菌的存活是用来评估野生型P的能力牙龈 W83和PG0228突变V3150缺陷入侵和血管内皮细胞内生存。内在活细菌通过的CFUs的以下HUVECs- P的孵化可视化确定血琼脂平板上厌氧条件下7天牙龈混合物。血板位于灯箱，增加对比度和允许的CFU更容易计算。各种稀释液是前amined。内皮细胞感染P.牙龈 W83稀释1:10（A），稀释1：1000（B），和稀释1：100（C）。内皮细胞感染P.牙龈 V3150稀释1：100（D） 点击此处查看该图的放大版本。

父母和突变菌株内皮细胞之间，一个生存率图4.比较感染了野生型P.牙龈 W83和突变V3150缺乏PG0228。 如在图2中概述的协议为生存其次。实验进行三次以一式三份的平均值±标准偏差给出。入侵的效率表示成活/初始细菌。*相比，野生型菌株W83（P <0.05），突变株已经统计学显著存活率降低。 请点击此处查看该图的放大版本。

P的 显微镜分析图5.实施例 通过 牙龈 血管内皮细胞，血管内皮细胞内在感染了BCECF-AM标记P.牙龈 30分钟，在100的MOI：1（ 牙龈：HUVEC）。将细胞用低聚甲醛固定，并标有TRITC鬼笔环肽和DAPI。该图像示出了一个单一的HUVEC与核（A）和分别染成蓝色和红色，F-肌动蛋白（B）。箭头指示P.牙龈标记绿色（C）。合并后的IMAGE是生产表现出P.牙龈侵入血管内皮细胞（D）。图像用扫描共聚焦显微镜生产。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

所有上述方法可用于设计特异性试验，以评估厌氧菌与真核细胞的相互作用。然而，有几个方面的考虑，以成功地执行该实验。第一是在一个研究中所用的微生物菌株。

它是在两个菌株均存活测定法的比较以及由显微镜分析至关重要的是，它们是在类似的生长阶段和达到相似的细胞浓度如在上述的任何差异可以影响入侵效率^13。当生长曲线两株细菌对之间的不同，调整提出，要最终实现类似的增长模式共享一致的浓度^21。此外，细菌应分散均匀，避免细胞聚集。此外，关键是要选择的抗生素有效地消除细胞外细菌。如果选择的抗生素对宿主细胞中，然后有害作用一种替代抗生素或溶解酶可以使用^24,25。最后，应变异质性必须考虑;虽然一个物种可以被识别侵入宿主细胞，可以有在致病性主要差别从一个应变到另一个²⁶并且因此试点研究应该执行每个菌株进行审查。

第二个关键步骤是建立一个最佳孵育时间和细菌接种物（感染复数[MO​​I]，它是用于感染宿主细胞的细菌数量）设计的协议时。短的潜伏期将评估细菌的能力是由宿主细胞而较长的时间点，可能需要以确定细菌存活以及细胞内复制²⁷内化。细菌细胞内生存可能受到感染复数被使用，最好是测试多个的MOI，保证对细胞没有造成损害，这将导致细胞死亡或permeabilizED膜能够访问抗生素杀死细胞内的细菌。建立需要回答的具体问题的MOI和孵育时间被要求后，实验是根据协议运行;然而，真核细胞的细菌裂解混合物的几个系列稀释应。最佳稀释因子将根据观察到的CFU来确定。导致在板的50-200的CFUs稀释因素是最佳评估存活效率。如果CFU计数过高，菌落彼此不可分辨和变得难以手动计数每一集落。如果CFU计数太低，小的偏差夸大被检查菌株之间的倍数变化以及产生重复之间的大的标准偏差。

第三个关键的一点是要准备宿主细胞是健康的，并准备与细菌相互作用。另外，在上述协议宿主细胞培养分别使用标准无菌TEC的hniques。在组织培养中使用抗生素和抗真菌剂可以是可取的，尤其是对于初学者细胞培养生物学家。然而，在执行存活试验之前，宿主细胞应当在无抗生素的培养基转移细胞进入厌氧室之前培养至少12小时。一旦室内，媒体应该与无氧无抗生素媒体进行交换，以不感染期间对厌氧菌冲击。如果与附着宿主细胞对塑料组织培养板存在或盖玻片的问题也可能是可取的施加粘合剂涂层如聚L-赖氨酸或明胶。另外，对于涂料的组织培养皿与天然产生的基底膜样细胞外基质（ECM）技术可提供调查者有更多的在体内像条件^28,29。裂解宿主细胞需要一台能开放宿主细胞的平衡洗涤剂不改变细菌的生存能力。虽然皂素会不是k生病的细菌，它可能会抑制某些物种的生长。皂素之前我们的研究P上的效果牙龈菌株用于在宿主-病原体分析被证明对它们的生长/存活没有影响。如果细菌对洗涤剂，包括皂苷高度敏感，反复冻融或蒸馏水可用于裂解宿主细胞，损伤小细菌。

第四个临界点，包括进行显微镜实验时所采取的考虑。第一种是利用荧光染料来标记细菌用于显微镜协议。许多当前的标记方法对细菌需要一次抗体或习惯细菌染料与显著限制，如毒性作用和染料进入周围从而得到高背景的浸出。 BCECF-AM是膜渗透性染料通常用作细胞内pH中既原核生物和真核生物^30-32荧光指示剂。它被认为是在以往的研究^33-35标记的范围厌氧菌有效。 BCECF-AM只会标签能够酯化的活菌。转换细胞内酯酶导致荧光形式泄漏出来的细胞远远慢于它的母体化合物来BCECF。有许多荧光染料和可以使用的³⁶染色技术;然而，该协议概括了可以与几乎任何微生物可以使用一个简单的定影/染色技术。另外，其它的染料（TRITC鬼笔环肽，和DAPI）用于更清楚地分辨真核细胞和帐户的边界仅与宿主细胞相互作用的细菌。

荧光染料易受光致漂白和有几个商业antifades和安装介质可用的，可能会阻止减弱荧光信号³⁷的。也有安装介质的硬集之间的选择第二软设置的。而硬设置那些可能导致在耐火指数显著变化以及收缩和组织损伤³⁸软设置媒体需要密封剂，如指甲油，以固定盖玻片。然后，由于观察到的变化之间感染的真核细胞;应该用于分析内化的细菌细胞可能会发生变化，从而多个真核细胞之间的数目。在我们的研究中，至少四十真核细胞进行评估和内每个实验^33,34列举细菌。最后，为了清楚地显现单细胞，用于感染真核细胞不应该发展到汇合。 中间普氏菌感染上皮细胞的显微镜检查表明偏好宿主细胞膜的特定区域，而细菌不坚持网站，上皮细胞在相互接触，也没有伪足^39。

第l仿镜可能是其较低的吞吐量。因此，对于对细菌的侵入性的流式细胞仪大规模量化数据也可使用^40。此方法包括使用荧光标记的细菌（如对于细菌可以用于显微镜，可以完成），并允许用于研究多个样品在一时间，它可能是一些研究者吸引力。

修改这两个协议，可以向鉴定参与细菌宿主细胞摄取途径。成功的细菌入侵发生在五个阶段：（1）附件（2）项/内部（3）人口（4）持久性和^（5）41号出口。从而在输入/内化，所述细菌本身定位于宿主和通过修改的信号转导侵占用于内化的宿主细胞。选择性代谢抑制剂可以添加到宿主细胞，以确定改变的信令，导致成功入侵。对于例如latrunculin，抑制肌动蛋白聚合，可以用于研究如何骨架重排影响P的内化牙龈 。也可以使用为了更好地理解宿主细胞的信号传导参与细菌内化事件，靶细胞特异性受体或能够撞倒某些基因的siRNA的抗体。虽然所有代谢抑制剂应具有对宿主细胞最小的整体效果，除了所述一个被调查，它保证了抑制剂治疗不具有对细菌有毒的效果是很重要的。

未来的研究将会考虑完善其中的一些技术，可能获得更在体内一样的状态。在目前的制品，无论是细菌或宿主细胞暴露于恶劣环境。根据实验的生物体，细胞系，以及目标一些研究者可能更愿意执行上述协议_在 CO 2培养箱中培养。然而，牙周损伤小号反映厌氧微环境，其中细菌与宿主相互作用。一项研究，审查变化的细胞响应根据好氧与厌氧条件与口腔中的细菌质疑报道，在减压氧分压（2％的氧）的细菌， 例如， 福赛斯坦纳连翘 ，P。牙龈 和 P. 中间引起的IL-8和TNFα的更高水平相比需氧条件^42。真核细胞的厌氧条件下生存的能力也被研究，研究人类骨髓间充质干细胞，人牙囊干细胞，人牙龈成纤维细胞，牙龈癌的细胞，和人类口腔上皮细胞^43,44,45的能力证实。使用WST-1细胞增殖测定我们的研究表明，内皮细胞可以为缺氧条件下可达48小时存活。这一决定是感染细胞在厌氧室，因为P.牙龈是在敏感mospheric氧的水平，而内皮细胞可以在厌氧条件下存活较长时间。未来的研究将调查执行规定氧气的单层（如动脉）和厌氧条件的一个表面在另一⁴⁶微流体细胞培养设备。这样的条件也不会牺牲任何细菌或病毒感染后的主机。总之，描述的是，可用于检查对厌氧菌宿主 - 病原体相互作用的几个简单的协议。这些协议也被用来评估细菌internalins，蛋白质促进细菌侵袭^40，以及作为替代的非侵入性细菌表达的蛋白质上的细菌⁴⁷赋予侵袭性性的效果。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200