Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis som modellorganisme for Assessing Interaksjon av anaerobe bakterier med vertsceller

Published: December 17, 2015 doi: 10.3791/53408
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

Abstract

Anaerobe bakterier langt flere enn aerobe i mange menneskelige nisjer som tarmen, munn og vagina. Videre anaerobe infeksjoner er vanlige og ofte av urbefolkningen. Evnen til noen anaerobe patogener til å invadere menneskeceller gir dem adaptive tiltak for å unnslippe medfødt immunitet så vel som å modulere vertscelle oppførsel. Imidlertid, slik at de anaerobe bakterier som er aktive i løpet av eksperimentell undersøkelse av de hendelser kan by på utfordringer. Porphyromonas gingivalis, en Gram-negative anaerobe, er i stand til å invadere en rekke eukaryote ikke-fagocyttiske celler. Denne artikkelen beskriver hvordan du lykkes kultur og vurdere muligheten for P. gingivalis til å invadere menneske umbilikalvene endotelceller (HUVECs). To protokoller ble utviklet: en for å måle bakterier som med hell kan invadere og overleve i verten, og den andre for å visualisere bakterier i samspill med vertsceller. Disse teknikkene nødvendiggjøre bruk av en anaeRobic kammer å levere P. gingivalis med et anaerobt miljø for optimal vekst.

Den første protokollen er basert på den antibiotiske beskyttelsesbestemmelse, som i stor grad benyttes for å studere invasjon av vertsceller av bakterier. Imidlertid er det antibiotiske beskyttelsesbestemmelse begrenset; bare intracellulære bakterier som er dyrkbare etter behandling med antibiotika og vertscellelyse blir målt. For å vurdere alle bakterier i samspill med vertsceller, både levende og døde, har vi utviklet en protokoll som bruker fluorescerende mikroskopi for å undersøke host-patogen interaksjon. Bakterier blir fluorescensmerket med 2 ', 7'-bis (2-karboksyetyl) -5- (og-6) -carboxyfluorescein acetoksymetylester (BCECF-AM) og anvendt for å infisere eukaryote celler under anaerobe betingelser. Etter fiksering med paraformaldehyd og permeabilization med 0,2% Triton X-100, blir vertsceller merket med TRITC phalloidin og DAPI å merke celle cytoskjelettet og kjernen, henholdsvis. Multiple imaGES tatt på ulike knutepunkter (Z-stack) anskaffes for temporal-romlig visualisering av bakterier. Metoder brukt i denne studien kan anvendes på enhver dyrkbar anaerob og en hvilken som helst eukaryot celle type.

Introduction

Anaerobe bakterier kolonisere nesten alle overflater av det menneskelige legeme. Selv dominerende i floraen av tarm og urin traktater hvor oksygenkonsentrasjonen er lav, de også eksisterer på et høyt nivå på huden, munn, nese og svelg en. Anaerobe bakterier er en vanlig årsak til endogene infeksjoner og er ofte isolert fra syke områder. Men på grunn av sin natur kresen, kan anaerober være vanskelig å isolere og kultur. Studier med anaerobe bakterier må gjøres under spesielle forhold. Moderne anaerob-kultur teknikker tillate forskere å etterligne de anaerobe innstillingene som kreves for å studere mange anaerob laboratoriestammer eller kliniske isolater 2,3.

Patogene anaerobe bakterier har utviklet et dynamisk forhold og co-evolusjon med vertscellene der de bor. De fleste anaerobe er utsatt for å drepe av vertens immunrespons før de når infectilige nivåer. Imidlertid har enkelte sykdomsfremkallende bakterier utviklet mekanismer for å flykte fra eller undergrave vertens immunrespons. De oppnår dette målet gjennom mekanismer som for eksempel unndragelse av immun anerkjennelse, nøytralisering av immun meklere, endring av celle-mediert immunitet, invasjon av vertsceller, og endring av immunsignale 4. Porphyromonas gingivalis, en Gram-negative anaerobe innblandet i både muntlig og ekstra- sykdommer, er et eksempel på et sterkt innrettet bakteriell patogen stand til å forårsake patogene forandringer i verten 5-7.

Lommer av biofilm plakk påløpt i dype sprekker dannet mellom tennene og tannkjøttet slimhinnevev kan havnen anaerobe bakterier som er beskyttet mot atmosfærisk oksygen 8. Disse lommer tjener som en nisje for forskjellige anaerobe patogener, som for eksempel P. gingivalis 9. P. gingivalis er en hjørnestein patogen som er i stand til oppussinging munn mikrobielle samfunn på en måte som fremmer utvikling og progresjon av periodontale sykdommer 10. Den produserer et stort antall virulensfaktorer som er aktive mot et bredt spekter av verts proteiner og gir mekanismer for unndragelse av vertens forsvar 11. Det er også i stand til å invadere epitel, endoteliale, fibroblastiske, og periodontale ligamentceller in vitro og in vivo 12 til 14 15. Ved effektivt å invadere vertsceller, P. gingivalis kan unnslippe vert immunitet. Effektiv invasjon av vertsceller som ikke bare gjør det mulig for bakterien å unnslippe vertens forsvar, men også tjener som et reservoar for senere re-infeksjon så vel som endrer vertscellen. Studier av de molekylære mekanismene som er involvert i adhesjon og internalisering av bakterien ved vertsceller er nødvendig. Forskning i flere laboratorier er fokusert på å forstå de molekylære hendelser assosiert med internalisering av P. gingivalis av vertscelleneså vel som de mekanismer som brukes til å undertrykke og kapre immunresponsen og overleve de fiendtlige vertens forsvarsmekanismer.

Det er mange analyser som kan identifisere og karakterisere patogener som er i stand til å invadere vertsceller. Men in vitro studier med anaerobe patogener utgjøre mange eksperimentelle problemer for forskeren hovedsakelig fordi det er vanskelig å utføre studier som er avhengige av store instrumenter i fravær av oksygen. Dette blir forsterket av det faktum at eukaryote celler krever oksygen for å vokse, og må derfor fremstilles separat i vevskultur inkubatorer. En måte å unngå slike hindringer ville være å utføre studiene under atmosfærisk oksygen, men som ville gjøre veksten av anaerobe bakterier umulig. En annen metode ville være å bruke varmedrepte bakterier til å infisere og studere vert-celle-interaksjoner. Men forskjeller mellom varmedrepte og levedyktige bakterier som reduserer relevansen av host-patogen interactipå 16. Det er sentralt å studere levedyktige bakterier med uendret uttrykk i samspill med vertsceller; derfor, metoder for dyrkning av P. gingivalis i et anaerobt miljø er angitt. Dessuten er to enkle, kostnadseffektive protokoller vist for å vurdere evnen til P. gingivalis å bli internalisert av menneske navleveneendotel celler (HUVECs). Den første protokollen er basert på den populære antibiotika beskyttelsesbestemmelse. Selv om analysen er enkel, er betraktninger ved bruk av anaerobe mikroorganismer er gitt. Den andre protokollen krever bruk av en fluorescerende mikroskop for å visualisere og kommunisere internalisert P. gingivalis. Hver analyse har sine begrensninger og fordeler som vil bli diskutert å gi forskeren en disposisjon for å studere invasivitet av anaerobe bakterier. Selv om den nåværende manuskriptet studerer P. gingivalis og HUVECs, kan disse protokollene brukes til mange andre anaerobe bakterier, så velsom for andre typer av vertsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De følgende protokoller beskriver metoder for dyrkning og studere invasjonen av anaerobe arter, P. gingivalis; Imidlertid kan disse protokoller benyttes for et antall av anaerobe patogener. Selv HUVECs anvendes, kan denne protokoll brukes til andre eukaryote celler både immune og ikke-immune.

1. Anaerob Chamber bruk og vedlikehold

Merk: P. gingivalis er en anaerob følsom for normale nivåer av oksygen møtt i luften. En kontrollert anaerob miljø er avgjørende for dyrking av P. gingivalis.

  1. Her opprettholde en kunstig atmosfære betegnet som blandede anaerob gass (80% N2 10% H2, 10% CO 2) i en vinyl anaerobt kammer (figur 1A). Bruk en luftsluse (figur 1B) for å overføre elementer fra laboratoriemiljø til anaerob kammeret. Luftslusen driver manuelt, twis spyling med N2 gass før innføring av den blandede anaerobe gass.
  2. Bruke en fjernelse av hydrogensulfid-kolonne (figur 1C) for vedlikeholdsfrie fjerning av uønsket hydrogensulfid. Plasser en avfukter i kammeret for å fjerne H 2 O skapt av katalysatoren og for å unngå aerosoler som letter spredning av forurensning.
    Merk: Hydrogensulfid er en naturlig metabolsk biprodukt av mange anaerobe bakterier, og at en akkumulering er toksisk for bakterier og kan føre til skade på elektronikk og redusere levetiden for en katalysator.
  3. Bruke en vifte boksen for å sirkulere i kammeret atmosfære gjennom en palladium-katalysator, som fjerner oksygen, i nærvær av hydrogen (figur 1D).
    Merk: En resirkulerende atmosfærisk (HEPA) filter fjerner luftbårne forurensninger med en størrelse på 0,22 um eller større.
  4. Culture anaerobe bakterier i en 37 ° C inkubator som er plassert på innsiden av den anaerobekammeret. Bruk standard aseptisk teknikk når du arbeider inne i anaerob kammer.

Figur 1
Figur 1. Anaerob vinyl kammeret og dets komponenter. (A) en vinyl anaerobiske kammeret forsegles fullstendig fra atmosfærisk oksygen gir arbeidsområde for to personer på en gang (32 x 78 tommer). Den inneholder en inkubator innstilt på 37 ° C (tilbake i midten). (B) en luftsluse blir brukt for overføring av elementer fra laboratoriemiljø for det anaerobe kammeret. Bildet er en automatisk luftslusen drives gjennom en regulator som kan programmeres til automatisk å utføre vakuum og rensefremgangsmåter som trengs for å skape et anaerobt miljø. (C) En kolonne for fjerning av hydrogensulfid gir vedlikeholdsfri høy kapasitet fjerning av uønsket hydrogensulfid. (D) To katalysator fan boksene erlagt gjennom det anaerobe kammeret for å sirkulere atmosfæren gjennom kammerets palladium-katalysator, som i nærvær av hydrogen, fjerner oksygen. Den anaerobe Kammeret er satt opp i henhold til produsentens instruksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Utarbeidelse av anaerobe bakterier

Merk: P. gingivalis er aerotolerant og kan lagres i aerobe forhold, men det vil ikke vokse i nærvær av oksygen på et nivå høyere enn 6% 17,18. Et anaerobt kammer er nødvendig for riktig dyrking av P. gingivalis og andre anaerobe arter (figur 1). Riktig trening og utdanning på anaerob kammer bruk er nødvendig før du arbeider med microanaerobes 19.

  1. Stabilisere alle flytende medier og plater til anaerob Conditioner i minst 12 timer før eksperimentet for å fjerne gjenværende oksygen.
  2. Overfør P. gingivalis fra -80 ° C fryser til anaerob kammer, la tine.
  3. Streak P. gingivalis på Trypticase blodagarplater (TSA II med 5% saueblod). Pakk plater i parafilm og oppbevares ved 37 ° C i en anaerob inkubator for 4-7 dager.
  4. Vaksinere P. gingivalis i 3 ml hjerne-hjerte-infusjon (BHI) supplert med hemin og menadion, en anriket ikke-selektive flytende medier for isolering og kultur av anaerobe og krevende mikroorganismer, ved hjelp av sterile sløyfer.
    Merk: For langtidslagring, bland bakteriekulturer utarbeidet i BHI med glyserol eller DMSO (10-20% endelig konsentrasjon) og plasser i en -80 ° C fryser.
  5. Forbered en startkultur P. gingivalis ved å gjøre en 1:10 fortynning og tillater bakterier å vokse fram til midten av log fase.

Merk: Den optiske tetthet av bacriale suspensjonen bestemt, og bakteriekonsentrasjon for hver stamme som skal undersøkes er justert. For P. gingivalis en suspensjon ved OD 660 på 0,7 svarer til midt-log fase og ~ 7 x 10 8 celler / ml. Vekstbetingelser som er beskrevet i protokollen ovenfor er spesifikke for P. gingivalis og må kanskje tilpasses for andre bakteriestammer.

3. endotelcelle Culture

Merk: Kjøps samlet primær HUVECs og kultur i basal medium som inneholder vaskulær endotelial vekstfaktorer (VEGF) ved 37 ° C i 5% CO 2 i henhold til produsentens instruksjoner.

  1. Seed HUVECs i T-75 kolber på 2,5 x 10 5 celler / kolbe i 15 ml VEGF medier.
    Merk: Sjekk levedyktighet via en 1: 1 fortynning med 4,0% trypanblått. Celler med en kompromittert membran vil beholde trypanblått, vil friske celler med intakt membraner vises hvitt sett under en kikkert lysmikroskop. Count 100 celler, sikre at over 80% av cellene er levedyktige 20.
  2. Bytt media hver 2 dager med forvarmet frisk VEGF media til cellene når ~ 80% confluency.
  3. Vask cellene en gang med forvarmet PBS. Frigjøre cellene fra T75-kolbe ved inkubering med 2 ml trypsin-EDTA (0,25%) i 5 minutter etterfulgt av 2 ml trypsin-nøytraliserende oppløsning.
  4. Utlevering HUVECs suspendert i et 50 ml konisk rør. Vaske ut noen ekstra celler fra T-75 flasker med PBS og overføre til 50 ml koniske rør.
  5. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 10 min.
  6. Fjern supernatant, suspendere cellepelleten i 10 ml forvarmes VEGF medier.
  7. Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer eller lignende celle telling enhet.
  8. Beregne mengden av cellesuspensjonen til å legge til enten 6-brønns plate (400000 / brønn) eller 12-brønns plate med dekkglass (50000 / brønn). HUVECs vil være klar for eksperimentering neste dag.

4. Survival analysen Invasion / Interaksjon(Plating)

Merk: Når utfører denne analysen, fremstille to seks-brønns plater av endotelceller sådd med 400.000 celler / brønn. En plate vil bli brukt for å vurdere bakterier festet til og internalis av vertsceller. Den andre plate vil stå for intracellulære bakterier. Den 6-brønns plate gir mulighet for tre paralleller av to prøver som skal utføres i ett eksperiment. For en oversikt over denne protokollen henvises til overlevelse analyse flytdiagram (figur 2).

  1. Forbered anaerobe bakterier som beskrevet ovenfor (se kapittel 1) før de når midten log vekst (OD 660 0,5-0,7).
  2. Sentrifuger bakterier på 5000 xg i 10 min.
    Merk: Hvis sentrifuge er utenfor anaerob kammer, bære bakterieprøver i en tett lukket 15 ml tube, vikle cap med Parafilm for å hindre oksygenlekkasje.
  3. Plasser pelletert P. gingivalis tilbake i kammeret, kast supernatanten. Vask med PBS, pellets bakterier igjen før resuspending i VEGF megdia. Tilberede suspensjoner for alle bakteriestammer som skal testes ved OD 660 på 0,7, som svarer til midt-log fase (~ 7 x 10 8 celler / ml). Bakteriene er nå klar for infeksjon.
  4. Overføre seks-brønns plater som inneholder HUVECs fra vevsdyrkningsinkubator inn anaerob kammer. Fjern media og vask tre ganger med anaerob PBS. Tilsett 2 ml anaerob VEGF media til hver brønn og plasserer platene ved 37 ° C i en anaerob inkubator i 20 min for å ekvilibrere temperaturen for infeksjon.
    Merk: Plate bakterier på blodagarplater å sikre de som brukes for infeksjon er homogen og ikke forurenset på infeksjon.
  5. Infisere vertsceller med bakterier ved en multiplisitet for infeksjon (MOI bakterier: vert) på 100: 1.
    Merk: HUVEC celletallet blir bestemt ved å utføre en trypanblått eksklusjon test på en enkelt brønn før infeksjon. Bakteriecelleantall blir bestemt ved hjelp av optisk tetthet (for eksempel, OD på 0,5 = 5 x 10 8 celler / ml). Bacterial konsentrasjon reguleres til riktig MOI basert på HUVECs konsentrasjon 21.
  6. Plasser 6-brønns plater med infiserte HUVECs en anaerob inkubator og tillater bakterier å kommunisere med vertsceller i 30 min.
  7. Forbered saponin i BHI (1,0% w / v) i det anaerobe kammeret og filtrer gjennom et 0,2 um filter.
  8. Overlevelse av både festet og internalisert bakterier.
    1. Fjerne platene fra inkubatoren, aspirer media, vask tre ganger med PBS anaerob og tilsett 2 ml filtrert 1.0% saponin (fremstilt som beskrevet i trinn 4.8). Inkuber i 15 min for å tillate vertscellelyse.
    2. Skrap bunnen av hver brønn med celleskrape. Samle celleblanding fra hver brønn og lage en 1: 1 fortynning i BHI.
    3. Fortsett å lage seriefortynninger av prøven. Avhengig av bakteriearter og konsentrasjon, juster seriefortynninger. Start med 1: 100 eller 1: 1000 fortynninger.
    4. Plate 200 ul ønskede fortynning på blodagarplater. Wrap than platene i parafilm og plass i den anaerobe inkubator ved 37 ° C.
    5. Etter syv dagers inkubering ved 37 ° C, fjerne platene og telle kolonidannende enheter (CFU) ved hjelp av en lys boks til å telle koloniene manuelt.
      Merk: CFU er nummerert. For større mengder CFU, kan bildene bli tatt og programvare kan brukes til å legge til rette for telling av CFU.
  9. Survival of internalisert bakterier.
    1. Fjern platene fra inkubatoren. Vask tre ganger med PBS anaerob og tilsett 2 ml VEGF medium supplementert med antibiotika (300 ug / ml gentamicin og 400 ug / ml av metronidazol).
    2. Inkuber i 1 time. Sørg for å teste antibiotika slik at de er 100% effektiv på å drepe den ønskede bakteriestamme og sørg for at de ikke trenge vertsceller 22,23.
    3. Sug media, tilsett 2 ml filtrert 1,0% saponin. Inkuber i 15 min for å tillate vertscellelyse.
    4. Skrape bunnen av hver well med celleskrape. Samle celleblanding fra hver brønn og sørg for 1: 1 fortynning i BHI.
    5. Forbered serielle fortynninger av prøven (1: 100, 1: 1000).
    6. Plate 200 ul ønskede fortynning på blodagarplater. Pakk platene i parafilm og legg i anaerob kuvøse.
    7. Etter syv dager med inkubasjon ved 37 ° C fjerne platene og telle CFU.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk fremstilling av en protokoll som brukes for overlevelse av anaerobe bakterier med eukaryote celler. Begge analyser for totalt bakteriell overlevelse og overlevelse av internalisert bakterier kan utføres samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5. internalisering av bakterier i Host Cells (Fluorescent Mikros)

Merk: P. gingivalis er merket med 2 ', 7'-bis (2-karboksyetyl) -5- (og-6) -Carboxyfluorescein, acetoksymetylester (BCECF-AM). BCECF-AM er en ikke-fluorescerende membran-gjennomtrengelig fargestoff; konvertering til fluorescein BCECF via virkningen av intracellulære esteraser kan indikere celle levedyktighet. P. gingivalis er merket med BCECF-AM fargestoff, og deretter brukt til å infisere eukaryote celler. Etter infeksjon, blir cellene fiksert og merket med DAPI og TRITC-phalloidin. Den DAPI flekken brukes til å farge den eukaryote cellekjernen vil også merke bakteriell cellekjernen, som gir et mottiltak for å identifisere ikke-levedyktige bakterier som kan ikke metabolsk henge fast BCECF-AM. Vertsceller er markert med TRITC-phalloidin, en rød aktin fargestoff.

  1. Autoclave Dekk. Tilsett aseptisk Dekk til 12-brønners plater før såing endotelceller ved 5 x 10 4 celler / brønn. (Utarbeidet dagen før forsøket)
  2. Forbered anaerobe bakterier vokst til mid-log fase (OD 660 = 0,5-0,7) som beskrevet i § 1.
  3. Vask bakterier 2x med anaerob PBS ved sentrifugering ved 5000 x g og suspendere pelleten i PBS ved 5-7 x 10 8 celler / ml.
  4. Tilsett 20 ul 0,2 mM BCECF-AM til 2 ml bakteriell suspensjon (5-7 x 10 8 celler / ml) til en sluttkonsentrasjon på BCECF-AM av 2 uM.
  5. Inkuber ved 37 ° C i 30 min i mørket.
  6. Overføringsplater med endotelceller sådd på 18 mm (tykkelse) 1,5 # sirkulær dekkglass fra vevskulturinkubator i det anaerobe kammeret. Vask med PBS og utveksling med anaerob VEGF media.
    Merk: Kontroller at HUVECs er sunt under et lysmikroskop. HUVECS bør være ~ 80% konfluent, bør morfologi være sammenlign produsentene.
  7. Sentrifuger merket bakterier på5000 xg i 10 min for å fjerne gjenværende BCECF-AM fargestoff. Suspendere i 2 ml anaerob VEGF media.
  8. Infisere vertsceller med merkede bakterier på MOI på 100: 1 (bakterier: host).
  9. Inkuber i anaerobisk kammer ved 37 ° C i 30 min.
  10. Etter infeksjon vaske cellene med PBS tre ganger og feste i nyfremstilt 4,0% paraformaldehyd i 10 min.
    Merk: Etter fikse celler, kan forsøket bli gjennomført utenfor anaerob kammeret.
  11. Vask Dekkglass med PBS tre ganger.
  12. Tilsett 1 ml 0,2% Triton X-100 i 10 min.
  13. Vask Dekkglass med PBS tre ganger.
  14. Tilsett 50 ul TRITC phalloidin (50 ug / ml) til dekkglass i 45 min.
  15. Vask Dekk tre ganger, fjerne fra 12-brønns plate og legg på et lysbilde med soft-sett monteringsmedium som inneholder DAPI. Forsegle sidene med neglelakk.
    Merk: Slides kan lagres for et par måneder i mørket. Unngå lyseksponering å hindre foto-bleking.
  16. Vis lysbilderved hjelp av en konfokalmikroskop.
    1. Her bruker en 34 kanal spektral system (32-kanals array detektor og to side PMT detektorer, pluss en overført lys detektor) konfigurert rundt en AxioObserver (invertert) står med en motorisert XY scenen. Systemet har fem lasere: blå diode (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), grønn diode (561 nm), red HeNe (633 nm) og en 440 nm pulset laser. Utstyre en fluorescens levetid Imaging system med 2 hybrid Gaasp detektorer (for FRET-FLIM).
    2. Detektere fluorescens fra DAPI og TRITC i en kanal med en dual-band filter med eksitasjonsbølgelengdene av 340-380 nm og 540-560 nm, og et utslipp filter på 435-485 nm og 570-590 nm hhv. Detektere fluorescens fra BCECF-AM bruker et filter med eksitasjonsbølgelengde på 440-500 nm og et utslipp filter på 510-590 nm.
      Merk: Kontroller for BCECF-AM bør gjøres på hver bakteriestamme blir undersøkt for å sikre forsvarlig merking av levedyktige bakterier. Først validere at nonviable bakterie er DAPI-positive og BCECF-negative. For det andre, at levende bakterier kan forbrenne BCECF-AM inn fluorescein BCECF. Variable konsentrasjoner av bakterier eller BCECF-AM fargestoff kan trenge å bli testet for optimal merking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokoller som er skissert ovenfor ble brukt i å studere vert-patogen interaksjon mellom P. gingivalis og endotelceller. P. gingivalis W83 og P. gingivalis V3150 bærer en sletting av PG0228 ble brukt i studien. Den PG0228 er forutsagt å kode for et protein som kan endre nivåene av RNA og proteiner, og som kan påvirke interaksjonen av P. gingivalis med vertsceller. For å undersøke effekten av PG0228 på P. gingivalis 's evne til å kommunisere med vertsceller, ble evnen til foreldre og mutante stammer til å samhandle med HUVECs sammenlignet. Overlevelses protokollen (figur 2) ble brukt til denne undersøkelsen. Dermed ble begge stammer vokst til logaritmisk fase som beskrevet i trinn 2. Begge stammer hatt lignende vekstkurver og dermed ingen vesentlige problemer med normalisering av celletall før infeksjon ble støtt. Etter syv dagers inkubasjon, ble CFU observert på en blodgar plater (figur 3). Flere fortynninger 01:10 (figur 3A), 1: 100 (figur 3C) og 1: 1 000 (figur 3B) ble sådd ut på blodagarplater. Som vist i figur 3A antall kolonier var for høy til å vurdere; koloniene var indiscernible fra hverandre og betegnet som "for mange til å telle" [TMTC]. Fortynningen i figur 3B var for lav som for få kolonier blir oppnådd. De fortynninger på 1: 100 som vist i figur 3C var ønskelig, da kolonier er synlige, og antall kolonier ble håndterlig å telle. Lignende resultater ble funnet med mutantstamme V3150 (figur 3D). Dermed CFU ble nummerert fra platene med en fortynningsfaktor på 1: 100.

Bruke antall CFU og fortynningsfaktoren, ble anslått antall levedyktige bakterier gjenvunnet for hver stamme beregnes. Dividere antall viable bakteriene utvinnes av det opprinnelige antall bakterier resulterer i et forhold defineres som invasjon effektivitet. I sammenligne invasjonen effektiviteten av begge stammer, overlevde vill type W83 innen HUVECs med høy effektivitet, mens stammer mangler PG0228 viste en signifikant reduksjon i overlevelse (figur 4).

For å verifisere videre at feilen skyldes overleve fremfor redusert internalisering av bakteriene, ble mikroskopi-analyse utført. HUVECs infisert med P. gingivalis ble sett under et mikroskop (figur 5). I dette eksemplet er en HUVEC presentert. For å bestemme antall intern bakterier flere bilder ble tatt på forskjellige brennvidder for å få en Z-stack som åpner for romlig-temporal identifisering av internalisert P. gingivalis. Også, i det minste 40 celler / eksperiment skal analyseres (for hver biologisk replikat) og antallet bakterier nummerert intern for hver mregn. Hvis antallet intern bakterier er den samme for hver stamme når sett under et mikroskop og deretter begge stammer invadere HUVECs like; har imidlertid mutant V3150 redusert evne til å overleve samtidig innenfor vertscellen som vist i det antibiotiske beskyttelsesbestemmelse.

Figur 3
Figur 3. Resultater fra en bakteriell overlevelse assay. Protokoll for overlevelse av intracellulære bakterier ble benyttet for å vurdere evnen til villtype P. gingivalis W83 og en mutant V3150 mangelfull i PG0228 å invadere og overleve innenfor HUVECs. Internalisert levedyktige bakterier er bestemt av visualisering av CFU etter inkubasjon av HUVECs- P. gingivalis blandingen på blodagarplatene i syv dager under anaerobe betingelser. Blodplatene er lagt på lyskasse som øker kontrasten og gir enklere telling av CFU. Forskjellige fortynninger var examined. HUVECs infisert med P. gingivalis W83 fortynning 1:10 (A), fortynning 1: 1000 (B), og fortynning på 1: 100 (C). HUVECs infisert med P. gingivalis V3150 fortynning. 1: 100 (D) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Sammenligning av en overlevelse mellom foreldre og mutante bakteriestammer. HUVECs ble infisert med villtype P. gingivalis W83 og en mutant V3150 mangelfull i PG0228. Protokoll for overlevelse som skissert i figur 2 ble fulgt. Eksperimentet ble utført tre ganger i tre paralleller, og middelverdien ± standardavvik er vist. Invasion effektivitet representerer levde / start bakterier.* Den mutant stamme har statistisk signifikant redusert overlevelse sammenlignet med villtype W83 belastning (P <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Eksempel på en mikroskopisk analyse av P. gingivalis internalisert av HUVECs. HUVECs ble infisert med BCECF-AM merket P. gingivalis i 30 minutter ved en MOI på 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Celler ble fikset med paraformaldehyde og merket med TRITC-phalloidin og DAPI. Bildet viser en enkelt HUVEC med kjernen (A) og F-aktin (B) farget blått og rødt, henholdsvis. Pilen viser P. gingivalis merket grønt (C). Et fusjonert image er produsert for å vise P. gingivalis invasjonen i HUVECs (D). Bilder ble produsert ved hjelp av scanning konfokalmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle de ovennevnte metoder kan brukes til å konstruere spesifikke analyser for å evaluere interaksjonen av anaerobe bakterier med eukaryote celler. Imidlertid er det flere hensyn å kunne utføre forsøkene. Først er de mikrobielle stammer som kan benyttes i en studie.

Det er avgjørende for sammenligning av to stammer med både overlevelse analysen, så vel som ved mikroskopi-analyse at de er på lignende vekstfaser og oppnå liknende cellekonsentrasjoner som eventuelle forskjeller i de ovennevnte kan påvirke invasjon effektivitet 13. Når vekstkurver skiller mellom to bakteriestammer, bør justeringer gjøres for å til slutt oppnå tilsvarende vekst mønstre som deler konsistente konsentrasjoner 21. I tillegg bør bakterier spres jevnt for å unngå celle aggregering. Videre er det viktig å velge antibiotika som effektivt eliminerer ekstracellulære bakterier. Dersom valgt antibiotika har skadelige virkninger på vertsceller, og deretteren alternativ antibiotika eller lytiske enzymer kan anvendes 24,25. Til slutt må stamme heterogenitet vurderes; Selv om en art kan bli identifisert til å invadere vertsceller, kan det være stor forskjell i pathogenicity fra en stamme til en annen, og 26 således en pilotstudie skal utføres for hver stamme som skal undersøkes.

Et annet kritisk punkt er å etablere en optimal inkubasjonstid og bakterieinokulum (multiplisitet av infeksjon [MOI] som er det antall bakterier som brukes til å infisere vertscelle) ved konstruksjon av protokoller. Kortere inkubasjonsperioder vil vurdere muligheten for bakterier å bli internalisert av vertsceller mens lengre tidspunkter kan være nødvendig for å fastslå bakteriell overlevelse samt intracellulær replikering 27. Som intracellulær overlevelse av bakterier kan bli påvirket av MOI som brukes, er det best å teste flere måneder for å sikre at ingen skade på cellen ble forårsaket som ville føre til celledød eller permeabilized membraner med tilgang til antibiotika avliving av intracellulære bakterier. Etter å etablere MOI og inkuberingstider trengs for å besvare konkrete spørsmålet blir stilt, er forsøket kjøre i henhold til protokollen; bør imidlertid flere serielle fortynninger av den eukaryote celle-bakterier lyse blanding foretas. Den optimale fortynningsfaktoren vil bli fastsatt på grunnlag av CFU observert. Fortynningsfaktorer som resulterer i plater med 50-200 CFU er optimale for å vurdere overlevelse effektivitet. Dersom antall kolonidannende enheter er for høy, koloniene er ikke skilles fra hverandre, og det blir vanskelig å manuelt telle hver koloni. Hvis CFU teller er for lav, små avvik drive ganger endring mellom stammene blir undersøkt samt produsere store standardavvik mellom replikater.

Et tredje kritisk punkt er å fremstille vertsceller som er sunne og klar til å samhandle med bakterier. I de ovennevnte protokoll vertsceller blir dyrket hver for seg ved hjelp av standard aseptiske techniques. Bruken av antibiotika og soppmidler i vev dyrking kan være lurt, spesielt for nybegynnere cellekultur biologer. Men før utførelse av overlevelse analyse, vertsceller bør dyrkes i antibiotika-fritt medium i minst 12 timer før overføring av cellene i det anaerobe kammeret. Når du er inne i kammeret, bør media byttes med anaerob antibiotika-frie medier som å ikke gripe inn i anaerobe bakterier i løpet av infeksjon. Hvis problemer eksisterer med festing av vertsceller til plastisk vevskulturplater eller dekkglass, kan det være tilrådelig å anvende et klebebelegg slik som poly-L-lysin eller gelatin. Dessuten kan teknikker for belegg vevskulturstudier retter med en naturlig produsert basalmembran-lignende ekstracellulære matrix (ECM) gi etterforskeren med mer in vivo lignende forhold 28,29. Lysing vertsceller krever en balansert vaskemiddel i stand til å åpne opp vertsceller uten å endre bakteriell levedyktighet. Selv saponin ikke vil ksyke bakterier, kan det hemme veksten av visse arter. Før våre studier effekten av saponin på P. gingivalis stammer som skal brukes for verts-patogen analyse ble bekreftet å ha noen effekt på deres vekst / overlevelse. Dersom bakterier er meget følsom overfor vaskemidler, inkludert saponin, kan gjentatte fryse-tine-sykluser eller destillert vann benyttes for å lysere vertsceller med liten skade på bakterier.

En fjerde kritisk punkt omfatter de hensyn som skal tas når du utfører mikroskopi eksperimenter. Det første er anvendelsen av et fluorescerende fargestoff for å merke bakterier som skal brukes for mikroskopi-protokollen. Mange av dagens metoder for merking av bakterier krever et primært antistoff eller vanlige bakterielle fargestoffer med betydelige begrensninger, for eksempel toksiske virkninger og utvasking av farvestoffet til omgivelsene og dermed gi høy bakgrunn. BCECF-AM er en membran-gjennomtrengelige fargestoff som vanligvis brukes som en fluorescerende indikator for intracellulær pH i både prokaryote og eukaryote 30-32. Den ble funnet å være effektiv ved merking av en rekke anaerobe bakterier i tidligere studier 33-35. BCECF-AM vil kun merke levedyktige bakterier i stand til forestring. Konverteringen til BCECF av intracellulære esteraser resulterer i en fluorescerende skjema som lekker ut av cellene langt saktere enn modersubstansen. Det er mange fluorescerende fargestoffer og fargeteknikker som kan benyttes for 36; men skisserer denne protokollen en enkel montering / farging teknikk som kan brukes med nesten alle mikroorganisme. I tillegg er andre fargestoffer (TRITC-phalloidin, og DAPI) som brukes til å klarere skille mellom grensene for eukaryote celler og utgjør bare bakterier som samhandler med vertsceller.

Fluorescerende fargestoffer er utsatt for foto-bleking og det finnes flere kommersielle antifades og monterings medier tilgjengelig som kan hindre svekkelse av fluorescenssignalet 37. Det er også valg mellom hard-set monterings media ennd soft-set seg. Mens den hardt satt seg kan føre til betydelige endringer i den ildfaste indeksen samt svinn og vevsskade 38 myke sett medier krever tetningsmidler, som neglelakk, for å sikre dekkglass. Så på grunn av variasjoner observert blant infiserte eukaryote celler; antall intern bakterier mellom cellene kan variere og dermed også flere eukaryote celler som skal brukes for analyse. I våre studier, er minst førti eukaryote celler vurdert og internalisert bakterier oppregnet per eksperiment 33,34. Til slutt, for å tydelig visualisere enkeltceller, eukaryote celler som brukes for infeksjon bør ikke vokst til samløpet. Mikroskopiske undersøkelser av Prevotella intermedia infeksjon med epitelceller viste preferanse for spesifikke regioner av vertscellemembran, og bakterier vil ikke holder seg til områder hvor epitelceller var i kontakt med hverandre og hadde ingen lamellipodia 39.

Den letterligning av mikroskopi kunne være dens lave gjennomstrømningen. Således, for store kvantitative data om invasive bakterier tilhører en flowcytometri kan også brukes 40. Denne fremgangsmåten innebærer bruk av fluorescerende merkede bakterier (som kan oppnås som beskrevet for bakterier for å bli brukt for mikroskopi), og gir mulighet for å studere flere prøver på et tidspunkt som kan være attraktivt for noen forskere.

Modifikasjoner i de to protokollene kan bli gjort for å identifisere måter med vertscelle opptak av bakterier. Vellykket bakteriell invasjon skjer i fem trinn: (1) vedlegg (2) oppføring / intern (3) trafficking (4) utholdenhet og (5) exit 41. Dermed under oppføring / intern, lokaliserer bakterien seg på verten og tilraner seg vertscelle for internalisering gjennom å endre signaloverføring. Selektive metabolske hemmere kan legges til vertsceller for å avgjøre endringer i signalering fører til vellykket invasjon. Tileksempel latrunculin, som hemmer polymerisasjon aktin, kan brukes til å studere hvordan cytoskjelettet omleiring påvirker internalisering av P. gingivalis. Antistoffer som er rettet mot celle-spesifikke reseptorer eller siRNA i stand til å slå ned visse gener kan også brukes for en bedre forståelse av vertscellesignale hendelser involvert i bakteriell internalisering. Mens alle metabolske hemmere bør ha minimal total effekt på vertsceller, bortsett fra den som blir undersøkt, er det viktig å sikre at inhibitor behandlingene ikke har en toksisk effekt på bakterier.

Framtidige studier vil se for å perfeksjonere noen av disse teknikkene, muligens oppnå en mer in vivo liknende tilstand. I dagens artikkel, er enten bakterier eller vertsceller utsatt for tøffe miljøer. Avhengig av organismen, cellelinje, og Målet med eksperimentet enkelte forskere kan foretrekke å utføre den ovenfor angitte protokollen i et CO2-inkubator. Men periodontal lesjons reflektere en anaerob mikromiljø i hvilket bakteriene kommuniserer med verten. En studie som undersøkte variasjoner i cellulær respons til å utfordre med orale bakterier under aerobe versus anaerobe forhold rapporterte at under redusert oksygenspenning (2% oksygen) bakterier, f.eks Tannerella Forsythia, P. gingivalis, og P. intermedia fremkalte høyere nivåer av IL-8 og TNFa forhold til aerobe forhold 42. Muligheten av eukaryote celler til å overleve under anaerobe betingelser ble også bekreftet ved studier som undersøkte evnen av humane stamceller, human dental follikkel stamceller, humane gingivale fibroblaster, gingival carcinoma celler og humane orale epitelceller 43,44,45. Våre studier ved hjelp av WST-1-celle-proliferasjonsanalyse viste at HUVECs kan overleve i opptil 48 timer under anoksiske betingelser. Det ble besluttet å infisere cellene i anaerob kammer fordi P. gingivalis er følsom for atmospheric oksygennivåer, mens HUVECs kan overleve lengre perioder under anaerobe forhold. Fremtidig forskning vil undersøke gjennomføringen av mikro-fluidic cellekultur enheter som gir oksygen til en overflate av et enkelt lag (som en arterie) og anaerobe forhold i den andre 46. På denne måten vilkår vil ikke bli ofret for enten bakterier eller vert på infeksjon. I sammendrag, er beskrevet er noen enkle protokoller som kan brukes til å undersøke vert-patogen interaksjon for anaerobe bakterier. Disse protokollene har også blitt brukt til å vurdere effekten av bakterielle internalins, proteiner som fremmer bakteriell invasjon 40, samt surrogat ikke-invasive bakterier uttrykker et protein overdragelse invasiv eiendom på bakteriene 47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B Coy Laboratory Products Model 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood BBL 221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool LifeLine Technology FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit LifeLine Technology LL-0003
TrypKit LifeLine LL-0013
Saponin Riedel-de Haen 16109
Gentamicin Sulfate Salt Sigma-Aldrich G-1264
Metronidazole Sigma-Aldrich M-3761
BCECF-AM LifeTechnologies B1150
TRITC Phalloidin  Sigma-Aldrich P1951
18 mm Circular Coverslips Electron Microscopy Sciences 72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).

Tags

Infeksjon anaerobe bakterier, Invasjon overlevelse vert-patogen interaksjon intracellulære bakterier vedlegg
<em>Porphyromonas gingivalis</em> som modellorganisme for Assessing Interaksjon av anaerobe bakterier med vertsceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wunsch, C. M., Lewis, J. P.… More

Wunsch, C. M., Lewis, J. P. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (106), e53408, doi:10.3791/53408 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter