Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53465
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 1, 2, 2, 2
1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

Introduction

משטחי Nanostructured משכו תשומת לב רבה לאחרונה בשל היישומים הפוטנציאליים השונים שלהם, כוללים דפוסים, תרבית תאים, ניקוי, ומיתוג שטח. לדוגמא, משטחים הידרופובי בהשראת ננו-המבנה של עלה הלוטוס ומשטחי תגובה אחרים מסוגלים להגיב לגירויים חיצוניים 1-4.

הסרט לאנגמיור הוא אחד פולימר ציפויים למד נרחב ביותר. סרט לאנגמיור נוצר על ידי הטלת מולקולות amphiphilic על ממשק אוויר-מים 5-8. הסרט אז יכול להיות מועבר על גבי משטח מוצק על ידי ספיחה פיזית או כימי, ואת קונפורמציה המולקולרית על משטח מוצק ניתן לשלוט בשיטות העברה אנכיות ואופקיות 9-12. הצפיפות של הסרט לאנגמיור ניתן לווסת בדיוק על ידי דחיסת ממשק מים-אוויר. לאחרונה, שיטה זו גם הוכחה כיעילה עבור בודת structur ים-האי nanoscaledes ידי ניצול קופולימרים לחסום amphiphilic. ננו הם הניחו מורכב מליבה של מגזרים הידרופובי פגז של מגזרים הידרופילי 13-17. בנוסף, מספר ננו על משטח מוסדר על ידי שליטה על השטח לכל מולקולה (א מ ') של קופולימר הבלוק על הממשק.

התמקדנו מקורית, גישת הנדסת רקמות פיגום ללא ייחודית, הנדסת תא גיליון, באמצעות משטח תרבות טמפרטורה-תגובה. הטכנולוגיה שפותחה יושמה לטיפולים ומבריאים איברים שונים 18. משטח תרבות טמפרטורה המגיבה היה מפוברק על ידי השתלת פולי (-isopropylacrylamide N) (PIPAAm), מולקולת תגובה בטמפרטורה, על גבי משטח 19-27. PIPAAm ולהציג קופולימרים שלה טמפרטורת פתרון קריטית נמוך (LCST) בתקשורת מימית בטמפרטורות ליד 32 מעלות צלזיוס. משטח התרבות גם הציג משתנ טמפרטורה המגיבים על בין הידרופוביות hydrophilicity. בגיל 37 ° C, פני השטח המורכבים PIPAAm הפכו הידרופובי, ותאים המצורפת בקלות התרבו על פני השטח כמו גם על קלקר בתרבית רקמה קונבנציונלי. כאשר הטמפרטורה ירדה ל -20 מעלות צלזיוס, פני השטח הפכו הידרופילי, ותאי מנותקים ספונטניים מפני השטח. לכן, תאים ומחוברות תרבותיים על פני השטח יכולים להיות בצור כמו גיליון שלם על ידי שינוי הטמפרטורה. תכונות הידבקות ניתוק התא אלה הוצגו גם על ידי משטח מפוברק על ידי ציפוי הסרט לאנגמיור להפגנה מעבדה 26, 27. סרט לאנגמיור של קופולימרים לחסום מורכב פוליסטירן (P (St)) ו PIPAAm (St-IPAAm) היה מפוברק. הסרט לאנגמיור עם מ 'מסוים ניתן להעביר אופקית כדי מצע זכוכית שונה hydrophobically. בנוסף, הידבקות תא על וניתוק מפני השטח המוכן בתגובת הטמפרטורה הוערכו.

_content "> כאן אנו מתארים פרוטוקולים עבור הייצור של סרט לאנגמיור nanostructured מורכב קופולימרים לחסום amphiphilic התרמו-תגובה על מצע זכוכית. השיטה שלנו עשויה לספק טכניקת ייצור יעילה nanofilms האורגני בתחומים שונים של מדע משטח עשוי להקל יותר שליטה אפקטיבית של הידבקות תא על וניתוק ספונטני ממשטח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של -poly לחסום Polystyrene- (-isopropylacrylamide N) על ידי העברת שרשרת שני שלבים הפיך תוספת הפיצול (רפסודה) הרדיקלי פילמור

  1. ממיסים סטירן (153.6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) חומצה sulfanylpentanoic (ECT; 0.2 מילימול), ו 4,4'-Azobis (חומצה 4-cyanovaleric) (ACVA; 0.04 מילימול) ב 40 מ"ל של 1, 4-dioxane. להקפיא את הפתרון בחנקן נוזלי תחת ואקום במשך 15-20 דקות להסיר את המינים תגובתי להפשיר בהדרגה ב RT. ודא כי הפתרון הוא מופשר לחלוטין וחזרו זה מחזור degassing להקפיא משאבת הפשרה שלוש פעמים.
  2. השג את פוליסטירן (PST) (Mw: 13,500) כסוכן רפסודה מאקרו ידי פילמור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות באמבט שמן.
  3. סוכן רפסודה מאקרו המשקע PST עם 800 מ"ל של אתר ויבש vacuo.
  4. ממיסים מונומר IPAAm (4.32 מילימול), סוכן רפסודה מאקרו PST (0.022 mmol), ו ACVA (0.004 mmol) ב 4 מ"ל של 1,4-dioxane.
  5. לְהַסִירחמצן הפתרון על ידי מחזורי degassing להקפיא משאבת הפשרה כאמור בשלב 1.1.
  6. בצע פילמור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות באמבט שמן לאחר סילוק גזים. השג מולקולת St-IPAAm מסונתז (Mw: 32,800) באותו אופן כסוכן רפסודת מאקרו PST.

2. הכנת מצעי זכוכית השתנו silanized הידרופובי

  1. מצעי זכוכית Wash (24 מ"מ x 50 מ"מ) עם עודף של אצטון ואתנול sonicate במשך 5 דקות כדי להסיר מזהמים על פני השטח.
  2. ייבש את המצעים בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן השתמש פלזמה חמצן (400 W, 3 דקות) כדי להפעיל את פני השטח של מצעים ב RT.
  3. לטבול את מצעי טולואן המכיל 1% hexyltrimethoxysilane הלילה ב RT כדי silanize המצע.
  4. שטוף את מצעי silanized טולואן וטבלת אצטון במשך 30 דקות כדי להסיר סוכני unreacted.
  5. מצעים לחשל עבור שעה 2 ב 110 ° C כדי לשתק את הים ביסודיותurface.
  6. חותך את מצעי silanized ידי חתכי זכוכית 25 מ"מ x 24 מ"מ כדי להתאים את כלי תרבית תאים (גודל מנה: מ"מ φ35).

3. הכנה לאנגמיור סרטי Surface-הועבר סרטים

  1. מניחים את המכשיר הסרט לאנגמיור בארון כדי למנוע הצטברות של אבק.
  2. שטוף את השוקת לאנגמיור (גודל: 580 מ"מ x 145 מ"מ) ומחסומים עם מים ואתנול מזוקקים להסרת לכלוך.
  3. ייבש את השוקת ומחסומים ידי ניגוב במגבת lintless. ואז למלא את השוקת עם כ 110 מ"ל מים מזוקקים, ולהגדיר את המחסומים משני צידי השוקת. שים לב מים מזוקקים יש להוסיף מבלי לשפוך בשלבים הבאים 3.5 כדי 3.13.
  4. מחממי צלחת פלטינה Wilhelmy (היקף: 39.24 מ"מ) לניטור מתח הפנים עם מבער גז עד שההצלחה פונה אדומה ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים כדי להסיר מזהמים. להשעות את הצלחת Wilhelmy על חוט המחוברמכשיר משטח-מדידה בלחץ.
  5. אפס מכשיר משטח-מדידה בלחץ על פי הפרוטוקול של היצרן. דחיסת ממשק מים-אוויר על השוקת על ידי מחסומים על שני הצדדים של שוקת עד בממשק ומגיע לכ 50 ס"מ 2 ללא כל טיפות של פולימר.
  6. מזהמים קטנים לשאוב עד שלחץ השטח הוא כמעט 0 MN / m.
  7. מיקום מחדש את המחסומים משני הצדדים, ולהוסיף מים מזוקקים כדי לפצות על הירידה של מים מזוקקים משלב 3.6.
  8. ממיסים 5 מ"ג של המולקולה St-IPAAm מסונתז 5 מ"ל של פתרון פיתוח של כלורופורם.
    הערה: dichloromethane או טולואן יכול לשמש גם הממס.
  9. בעדינות טיפה 27 μl של סנט-IPAAm מומס כלורופורם על שוקת באמצעות microsyringe או micropipette.
  10. אחרי המתנה של 5 דקות, כדי לאפשר אידוי מוחלט של כלורופורם, להזיז את שני המחסומים אופקיים כדי לדחוס את molecu St-IPAAmle על הממשק. לשמור דחיסה קצב המחסומים ברמה של 0.5 מ"מ / sec ועד לאיזור היעד של 50 ס"מ 2 הוא הגיע.
    הערה: שיעור דחיסה מהיר גורם למומים בסרט לאנגמיור.
  11. מדדו את הלחץ לפני השטח (π) -A איזותרמות מ עם צלחת פלטינה Wilhelmy המצורפת למכשיר משטח-מדידה בלחץ במהלך הדחיסה על פי פרוטוקול של היצרן.
  12. לאחר שהגיע לגודל אזור היעד, לשמור על פני השטח במשך 5 דקות, כדי לאפשר מולקולות St-IPAAm להירגע; מולקולות לא להגיע לשיווי משקל מיד לאחר דחיסה.
  13. מעביר את הסרט לאנגמיור על מצע זכוכית שונה hydrophobically באמצעות מנגנון העברה למשך 5 דקות כדי לספוג את הסרט וחסון. תקן את מצע זכוכית הידרופובי במקביל במכשיר. חבר את ההתקן בשלב יישור ולעבור בניצב.
  14. הרם את המצע אופקי עם מנגנון ההעברה ויבש עבור 1 יום בתוך desiccator.

4. Culturing תאים וביצוע אופטימיזציה הידבקות תא וניתוק על פני השטח המועבר לאנגמיור סרטים

  1. כדי להכין השעיות תא, תאי האנדותל בעורק התרדמה שור תרבות (BAECs) כדי מפגש שליש ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ו -95% אוויר על קלקר בתרבית רקמה (TCPS) עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% עוברית בסרום שור (FBS) ו -100 U / פניצילין מ"ל.
  2. לאחר המפגש הוא הגיע, לטפל BAECs עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ו -95% אוויר.
  3. לבטל את טריפסין-EDTA על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% FBS, לאסוף את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 120 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant. Re- להשעות את התאים עם 10 מ"ל של DMEM.
  5. מניחים את משטחי St-IPAAm באור אולטרה סגול על ספסל נקי ומטהרים למשך 5 דקות.
  6. זרעי לסה"נ התאוששהLLS על St-IPAAm משטחים בריכוז של 1.0 x 10 4 תאים / 2 סנטימטרים נספרו על ידי hemocytometer פנוי ולבחון את התאים על המשטחים ידי מיקרוסקופ המצויד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ו -95% אוויר.
    הערה: לעקר משטחי St-IPAAm ידי אור אולטרה סגול מצויד ספסל נקי.
  7. זמן לשגות תמונות שיא של BAECs החסיד כ 24.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד עם הגדלה 10X. לאחר הידבקות BAEC, ניתוק שיא של BAECs מפני השטח St-IPAAm בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך כ -3.5 שעות.

5. תא ייצור גיליון על משטחי קולנוע-הועבר לאנגמיור

  1. BAECs תרבות המשמש באותו אופן שתואר בסעיף 4.
  2. זרעים סך של 1.0 x 10 5 תאים / 2 ס"מ על משטחים St-IPAAm דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. ומחוברות BAECs מנותקת באופן ספונטני על 20 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קופולימרים בלוק מורכב פוליסטירן ו poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) עם משקל מולקולרי ספציפי היו מסונתז על ידי פילמור רדיקלי רפסודה. ECT הוכן כסוכן בשרשרת העברת כמתואר Moad et al. 28. שני סנט-IPAAm מולקולות באורכים שרשרת PIPAAm שונים היו מסונתז, ואת פולימרים לחסום השיג התאפיינו 1 תהודה מגנטית גרעינית H (NMR) כרומטוגרפיה ג'ל חלחול (GPC). המשקלים המולקולריים של סנט-IPAAms היו 32,800 ו 67,900, עם חלוקת משקל מולקולרי צר (1.31 ו 1.50). הגיורים מונומר של סוכן רפסודה מאקרו פוליסטירן PIPAAm נמצאו 17.4% ויותר מ 85.0%. מסונתז St-IPAAms נקראו St-IPAAm170 וסנט-IPAAm480, בהתאמה.

סרטים לאנגמיור עם אזורים שונים לכל מולקולה (א מ ') היו מפוברקים לעברממשק אוויר-מים על ידי הטלת מולקולות St-IPAAm מומס בתמיסה כלורופורם (איור 1 א). אחרי שהוריד מולקולות St-IPAAm, לחץ השטח של ממשק המים-אוויר נקבע 0 MN / m וגדילה באופן רציף על ידי סגירת הממשק במהלך דחיסה עם החסמים (איור 1B). כל פגמים בסרטים לאנגמיור נוצר על ממשק אוויר-מים שאפשר להסיק האיזותרמה מ π-A. הסרט לאנגמיור St-IPAAm מוכן הועבר על מצע זכוכית שונה hydrophobically (משטח St-IPAAm) (תרשים 1C). המשטח-הועבר הסרט הוערך על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). איור 2 מראה תמונות טופוגרפיות AFM (1 x 1 מיקרומטר) של משטחים St-IPAAm170 וסנט-IPAAm480. ננו נצפה על משטחי St-IPAAm, בעוד מבנים כאלה היו רק לעתים רחוקות נצפו על פני המצע הידרופובי החשוף. הגודל והצורה של ננו היו dependen בחוםt על קלע זרק והרכב St-IPAAm. תמונות טופוגרפיות AFM אשרו כי הסרטים לאנגמיור ניתן להעביר בצורה הומוגנית על מצע הזכוכית השונה הידרופובי וכי מורפולוגיה המשטח יכולות להיות נשלטו על ידי ההרכב המולקולרי ו- A מ '.

היציבות של הסרט לאנגמיור St-IPAAm הוערכה על ידי שיקוף הכולל נחלש פורייה-transform ספקטרוסקופ אינפרא אדום (ATR / FT-IR). כמות PIPAAms על מצע זכוכית הידרופובי יכול להיות מוערך על ידי קו כיול המתקבל יחס עוצמת שיא של 1,000 -1 ס"מ נגזר זכוכית (Si-O) ו 1,650 -1 ס"מ נגזר PIPAAm (C = O). שורת הכיול חושבה מתוך סדרה של לסכומים ידועים של שחקני PIPAAm על הזכוכית הידרופובי. סכומי PIPAAm של סנט-IPAAm170 (10 ננומטר 2 / מולקולה) וסנט-IPAAm480 (40 ננומטר 2 / מולקולה) על פני המצע נמצאו 0.87 מיקרוגרם/ 2 ס"מ ו 0.63 מיקרוגרם / 2 ס"מ, בהתאמה. כמות PIPAAm על פני השטח לאחר שטיפה עם מים מזוקקים הייתה כמעט זהה לאלה על המשטחים ללא שטיפה. תוצאות אלו הצביעו על כך משטחי St-IPAAm המפוברקים היו יציבים במצב מים.

אנחנו הבאים בחנו את ההידבקות וניתוק של תאי האנדותל בעורק תרדמת שור (BAECs) על משטחי St-IPAAm. צילום זמן לשגות של BAECs חסיד והתנתקות על פני השטח St-IPAAm480 ב 40 2 / מולקולה ננומטר מוצג 1 אנימציה איור. חסיד BAECs על 37 מעלות צלזיוס שהופרדו במהירות משני St-IPAAm170 וסנט-IPAAm480 לאחר הפחתת הטמפרטורה ל 20 מעלות צלזיוס. מספר תאים חסיד על St-IPAAm170 וסנט-IPAAm480 ב 37 ° C היה 0.6 x 10 4 תאים / 2 ס"מ ו -0.9 x 10 4 תאים / 2 ס"מ, בהתאמה, המציין כי מספר תאים חסידהים היה מווסת על ידי רכב פני שטח St-IPAAm. גיליונות ניידים יכולים גם להיות התאוששו על ידי ניתוק BAECs תרבותי ומחוברות ממשטחי St-IPAAm אלה. גיליון התא התאושש היה דמיין כמבנה תא דו ממדים (איור 3). תאים הגיעו למפגש לאחר שלושה ימים בתרבות על St-IPAAm170 וסנט-IPAAm480 משטחים על 37 מעלות צלזיוס, ואת גיליון התא היה התאושש במהירות לאחר הפחתת הטמפרטורה מ -37 ° C עד 20 ° C. השפעת משקל מולקולרי ו- A מ 'של סנט-IPAAms על התאוששות גיליון התא מסוכמת בטבלה 1. הכדאיות של יריעות התא הוערכה על ידי מכתים כחול trypan לאחר ניתוק של גיליון BAECs. תאים שטופלו טריפסין-EDTA על מצע זכוכית ב 37 ºC שימשו כביקורת. יחסי תא מלח על St-IPAAm170, St-IPAAm480 ואת מצע זכוכית הידרופובי כביקורת חושבו להיות כ 11.0%, 7.7%, ו -11.7%, בהתאמה. תוצאות אלו הצביעו על כך ceכדאיות ll בקושי הושפעה הפחתת טמפרטורה.

איור 1
איור 1:. הכנת משטח לאנגמיור thermoresponsive-הועבר הסרט (א) -poly לחסום polystyrene- (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) פתרון כלורופורם ירדה קלות על ממשק אוויר-מים. לחץ המשטח נמדד במהלך דחיסה כדי לזהות פגמים כלשהם בסרט לאנגמיור. (ב) שני מחסומים שמשו כדי לדחוס את מולקולות St-IPAAm על הממשק עד אזור היעד של 50 סנטימטרים 2 הושגו. (ג) לאחר הדחיסה, מצע זכוכית כיסוי שונה hydrophobically הונח אופקי על הממשק עם שלב יישור למשך 5 דקות. המצע הוסר אופקי מיובש ליום 1. דמות זו שונתה מעט מהפרסום ידי סאקהאומה et al. 27

איור 2
איור 2:. במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) תמונות טופוגרפיות (1 x 1 מיקרומטר) של לאנגמיור-הועבר סרט משטחים (St-IPAAm שטח) פנל שמאל: משטחי Nanostructured של סנט-IPAAm170 עם A מ 10 ננומטר 2 / מולקולה. פנל ימני: משטחי Nanostructured של סנט-IPAAm480 עם A מ 40 2 / מולקולת ננומטר. תמונות AFM התקבלו קשה במצב באמצעות שלוחת סיליקון מסומם פוספט עם קבוע קפיץ של 3 N / m תדר תהודה של 70-90 קילו-רץ.

איור 3
איור 3: תמונה מקרוסקופית של גיליון התא התאושש על משטח הסרט הועבר לאנגמיור עם סנט-IPAAm480 או לכוס מ 'של 40 ננומטר

סרט 1
איור 1 אנימציה: . (קליק ימני להוריד) תמונות זמן לשגות של הידבקות וניתוק BAECs על משטח הסרט הועבר לאנגמיור עם סנט-IPAAm480 ו Am של 40 2 / מולקולה ננומטר. התמונות נאספו במרווחים של 2 דקות ואת התמונות שנאספו נמסרו כסרט במהירות 960x. הסרגל בסרט הוא 50 מיקרומטר.

St-IPAAm170 St-IPAAm480
3 [ננומטר 2 / מולקולה] 10 [ננומטר 2 / מולקולה] 40 [ננומטר 2 / מולקולה] 3 [ננומטר 2 / מולקולה] 10 [ננומטר 2 / מולקולה] 40 [ננומטר 2 / מולקולה]
הידבקות חלשה טוֹב התאושש כמעט הידבקות חלשה הידבקות חלשה טוֹב

טבלה 1:. תא האנדותל בעורק התרדמה שור (BAEC) התאוששות גיליון משטח הסרט הועבר לאנגמיור עם צפיפויות שונות ואורכים שרשרת PIPAAm "טוב" מייצג ce ללא פגעהתאוששות גיליון השני של השנה. "כמעט התאושש" פירושו שתאי יכול להיות confluently תרבותי תאים בתרבית הראו מעט או ללא ניתוק מהמשטח גם לאחר הפחתה בטמפרטורה. "הידבקות חלשה" פירושו שתאי לא היו בתרבית כדי המפגש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

משטח טמפרטורה המגיבה היה מפוברק בשיטה לאנגמיור-שייפר, ואת מאפייני פני השטח עבור הידבקות תא / ניתוק גיליון תא התאוששות היו אופטימיזציה. בעת השימוש בשיטה זו עבור הייצור של משטחים, כמה צעדים חיוניים. את ההרכב המולקולרי של מולקולות St-IPAAm יש השפעה רבה על מבנה השטח ואת היציבות של פני השטח, ובמשתמע, על הידבקות תא וניתוק. בפרט, מולקולות St-IPAAm צריכות חלוקת משקל מולקולרית צרה. בשיטה שלנו, שתי מולקולות St-IPAAm עם אורכי שרשרת PIPAAm שונים היו מסונתזות על ידי פילמור רפסודה, המאפשרות שליטה של ​​המשקל המולקולרי והפצת משקל מולקולרית.

צעדים יש לנקוט על מנת למנוע זיהום של ממשק מים-אוויר במהלך תקופת ההכנה של השטח St-IPAAm להימנע פגמים ננו. לפני הטלת מולקולות פולימר על הממשק, contaminants צריך להישאף עד שהלחץ השטח ומגיע לכ 0 MN / m. זיהום נוטה לצבור מסביב לקצוות של שוקת צלחת Wilhelmy. בגלל צלחת Wilhelmy הייתה כמה זיהום על פני השטח שלו, שהוא היה מרותק. כאשר צלחת נייר Wilhelmy משמשת, צעד השאיפה בממשק יש לחזור לפחות פעמים. עקומת האיזותרמה π-A מ 'גם תלוי בנוכחות של זיהום על ממשק מים-אוויר. אנו ממליצים כי עקומים של איזותרמות לקבל יותר מפעם אחת לפני הייצור של הסרט. בגלל זיהום של מצע זכוכית שונה הידרופובי יכול להתרחש גם, המצע צריך להיות מפוצץ בגז אוויר או חנקן טריים להסיר זיהום.

כדי לפברק משטחים הסרט הועבר לאנגמיור בעקביות (משטח St-IPAAm), במגזר הידרופובי של פולימר חשוב כי האינטראקציה הידרופובי בין הסרט לאנגמיור ואני זכוכית שונה הידרופובי זה הכוח המניע של התגובה. במחקר זה, משום קופולימר לחסום הורכב קלקר, אשר הוא הידרופובי מאוד, ו PIPAAm הידרופילי בטמפרטורת חדר, הסרט העביר ששקד ביציבות למצע אפילו בתנאי תרבות מים או תא. זה מצביע על כך קטעים הידרופובי לשחק תפקיד חשוב בודת משטח St-IPAAm חזק.

כדי לשלוט תא הידבקות וניתוק על משטח טמפרטורה-תגובה, הוא את ההרכב המולקולרי ואת השליטה המדויקת של צפיפות חשוב. בשיטה לאנגמיור-שייפר זה, באזור לכל מולקולה (א מ ') של פולימר מסונתז על ידי כמות נתונה של מולקולות ירד ובאזור היעד של ממשק אוויר-מים יכול להיות נשלט על ידי דחיסה. א 'מ' של הפלת מולקולות St-IPAAm יכול בתאוריה להיות מחושב על ידי המשוואה הבאה:

ד / 53,465 / 53465eq1.jpg "/>

כאשר A הוא האזור של הממשק, M w הוא המשקל המולקולרי של סנט-IPAAms, c הוא המספר של ריכוז הפתרון כלורופורם, N A הוא אבוגדרו, ו- V הוא ירד היקף פתרון הפולימר. מבני ים-האי ננו הם נצפו על משטחי St-IPAAm לאחר הייצור בגלל פולימרי amphiphilic טופס מבנים התארגן מעצמה על ממשק אוויר-מים, כמתואר במחקרים קודמים 13-17. הגודל והכמות של מבנים ננומטריים שנשלטו על ידי מ 'המשקל המולקולרי של סנט-IPAAms.

הידבקות וניתוק Cell הוערכו על משטחים מצופים PIPAAm מפוברקים על ידי שיטות שונות, כולל הקרנת אלומת אלקטרונים, פילמור רפסודה ביוזמת משטח ספין ציפוי 19-27. צפיפות בגלל, משקל מולקולרי, ומבנה PIPAAm להשפיע celהידבקות וניתוק l, טכניקות מדויקות עבור בודה משטח מצופה PIPAAm חשובים. בשיטה לאנגמיור-שייפר זו, צפיפות, ננו במשקל השטח מולקולרי יכול להיות נשלט כמתואר לעיל. הידבקות וניתוק Cell על משטחי St-IPAAm הושפעו באופן דרסטי על ידי רכב קלע זרק והסנאט-IPAAm מולקולרי שונים, וחלק תנאי St-IPAAm משטחי הידבקות תא וניתוק יכולים להיות מותאמים יותר. תוצאות אלו מצביעות כי שיטה זו יכולה לשלוט על האינטראקציה בין משטח תאי St-IPAAm.

לשחזור גיליון תא שלם reproducibly, העיצוב של פולימר amphiphilic הוא חשוב ביותר. כאשר פולימרים הידרופילי רק מיוצרים על משטח ידי שיטה לאנגמיור-שייפר, פולימרים מצופים נשטפים החוצה בקלות על ידי מים מזוקקים או בינוני תרבות. תוצאה זו עולה כי הפולימר הידרופובי החלש לא אמור לשמש עבור מחל גיליון תא reproducibly ב ספיד זהod משום שונה משטח פולימר היה יציב במצב המים. בשיטה שלנו, במגזר הידרופילי בתוך פולימר amphiphilic מאפשר ייצור חזק על משטח מבלי לשטוף את הידות בתמיסה מימית. בנוסף, מאז הסרט לאנגמיור הועבר ובמקביל על מצע זכוכית במחקר זה, מדורג-ננו מבני ים-האי נצפו על פני השטח. למרות המבנה של סרט לאנגמיור בצד הבזליים ידוע להיות שונה מזו בצד הפסגה, המבנה נקבע על ידי העברה במקבילה.

טיפול בתאי ורפואה רגנרטיבית כבר התמקדו את האפשרות של ריפוי חולים שאינם מגיבים לטיפולים אחרים. המעבדה שלנו פתחה גישת הנדסת רקמות מקורית, ייחודית ללא פיגום באמצעות הנדסת תא גיליון מפוברקת על משטח תרבות טמפרטורה מגיבה עם יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות. ניסויים קליניים כמה ביריעות סלולריות הם already לדרך הוכיחה תוצאות טובות במשך כמה סוגים של רקמות 29-31. למרות BAECs שימשו כמקור תא לפברק יריעות התא, מקורות תאים אחרים, כולל תאי גזע, יכול לשמש כדי לפברק גליונות על משטח St-IPAAm ידי אופטימיזציה של שילובים של קלע זרק ואת ההרכב המולקולרי של מולקולות St-IPAAm. טכנולוגיה הלא-קונבנציונלי זה תתרום לא רק ההפקה הקלה של משטחי nanostructured אלא גם אסטרטגיות תרבית תאי יסוד לשימוש ברפואת רגנרטיבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide Kohjin No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid) Wako Pure Chemicals 016-19332
Styrene Sigma-Aldrich S4972
1,3,5-trioxane Sigma-Aldrich T81108
1,4-Dioxane Wako Pure Chemicals 045-24491
DMEM Sigma  D6429
PBS Nakarai 11482-15
Streptomycin GIBCO BRL 15140-163
Penicillin GIBCO BRL 15140-122
Trypsin-EDTA Sigma T4174
FBS Japan Bioserum JBS-11501
BAECs Health Science Reserch Resources Bank JCRB0099
Cover Glasses Matsunami Glass Industry C024501
AFM NanoScope V Veeco
1H NMR INOVA 400 Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700 Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs  KSV Instruments KN 2002 KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
  2. Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
  3. Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
  4. Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
  5. Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
  6. Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
  7. Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
  8. Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
  9. Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
  10. Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
  11. Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
  12. Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
  13. Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
  14. Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
  15. Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
  16. Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
  17. Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
  18. Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering. Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).
  19. Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
  20. Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
  21. Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
  22. Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
  23. Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
  24. Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
  25. Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
  26. Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
  27. Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
  28. Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
  29. Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  30. Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
  31. Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).

Tags

Bioengineering גיליון 109 סרט לאנגמיור שיטה לאנגמיור-שייפר פילמור רדיקלי העברה בנוסף פיצול הפיך משטח nanostructured משטח thermoresponsive הידבקות תא ניתוק תא גיליון תא
הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakuma, M., Kumashiro, Y., Nakayama, … More

Sakuma, M., Kumashiro, Y., Nakayama, M., Tanaka, N., Haraguchi, Y., Umemura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (109), e53465, doi:10.3791/53465 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter