Abstract
Гидрогели можно рисунком на микро-масштабе с использованием микрожидкостных или micropatterning технологии, чтобы обеспечить в естественных условиях -подобных геометрию трехмерного (3D) тканей. Полученные 3D гидрогель на основе сотовой конструкции были введены в качестве альтернативы экспериментах на животных для продвинутых биологических исследований, фармакологических тестах при трансплантации органов и приложений. Хотя частицы гидрогеля на основе и волокна могут быть легко изготовлены, трудно манипулировать ими по восстановлению тканей. В этом видео мы опишем способ изготовления для micropatterned альгинат гидрогелей листов, вместе с их сборки, чтобы сформировать макро-масштабе системы 3D культуры клеток с управляемой сотовой микросреды. Использование тумана форму кальция желирующего агента, тонкие листы гидрогелевые легко получены с толщиной в диапазоне от 100 - 200 мкм, и с точными micropatterns. Клетки затем можно культивировать с геометрической руководством гидрогелевых листов вавтономные условия. Кроме того, гидрогель листы могут быть легко манипулировать с помощью микропипетки на конец вырезом наконечника, и могут быть собраны в многослойных структурах путем укладки их использовании рисунком полидиметилсилоксан (PDMS) кадра. Эти модульные гидрогелевые листы, которые могут быть изготовлены с использованием процесса, легкое иметь потенциальное применение в пробирке анализов лекарственных средств и биологических исследований, в том числе функциональных исследований микро- и макроструктуры и реконструкции ткани.
Introduction
Гидрогели особенно перспективным биоматериалов, и, как ожидается, будет важно в фундаментальной биологии, фармакологических анализов и медицины. 1 Biofabrication гидрогеля на основе клеточных конструкций было предложено сократить использование экспериментов на животных, 2,3 заменить для трансплантации тканей, 4 и улучшить клеточных анализах. 5,6 Водосодержащие (гидро-) вязкоупругие материалы (гели) позволяют большое количество клеток, которое необходимо инкапсулировать, и поддерживается в конструкции строительных лесов, чтобы контролировать клеточную микросреду 3D. В сочетании с руководством микрожидкостных или micropatterning технологий, геометри гидрогелевых конструкций можно точно контролировать на клеточном уровне. На сегодняшний день, разнообразие форм гидрогелей, в том числе частиц, 7 - 9 волокна, 10 - 12 и 13 листов, - 15 были использованы в качестве строительных блоков в восходящей утверждения предметовболит в изготовлении макроуровне многоклеточных архитектур.
Оба частицы гидрогеля на основе волокна и были легко и быстро изготавливаются для применения как микро-масштабе сотовой среде, с использованием струйных управления микрожидкостных устройств. Тем не менее, в качестве основных единиц инженерных тканей, он будет сложно изменить их и увеличить их объем, как макро-масштабных конструкций. 16 Это труднее достичь макро-масштабе конструкции, чем производить микронных основные модули. Листового единиц гидрогеля на основе конструкций могут быть использованы для увеличения объема каркасов с помощью простого процесса сборки. Последовательно, укладываются слоями гидрогеля листов обеспечивают не только объемный рост, а также геометрическую расширение в 3D-пространстве.
Ранее мы уже сообщали способ изготовления micropatterned гидрогелевые листы, 13 - 15 вместе с их сборки в мульти-LayERed сотовой архитектуры. Метод позволяет сложную micropatterning и модульную конструкцию сотовых конструкций с помощью укладки процессе многослойных структур. Через изготовления уложенных листов модульных гидрогелевых, которые micropatterned, 3D системе культуры клеток с регулируемой макромасштабной сотовой микроокружения может быть реализован. Этот протокол описывает видео простой, но эффективный способ изготовления, которые могут быть использованы для построения модульных листов гидрогель, основанный на печени человека клеточной линии карциномы HepG2 (). Мы демонстрируем здесь, простой манипуляции этих узорчатых модульных гидрогеля листов, и их сборку в многоуровневой структуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Micropatterned Пресс-формы и Гидрогели
- Получения желаемого микроскопических моделей с использованием SU-8 фоторезиста на поверхности кремниевой пластины с помощью стандартного двухступенчатого техники фотолитографии 15,17 для литья PDMS формы. В примере, показанном использует печени дольки, как сетчатый рисунок (рисунок 1).
- Взвесить PDMS и раствор средства отверждения при соотношении 1: 5 (т.е. 12,5 г PDMS и 2,5 г отвердителя).
- Смешайте 15 г раствора тщательно дегазировать пузырьков в вакуумной камере, а затем распространилась смешанный раствора на поверхности micropatterned кремниевой пластины равномерно в течение литья фольги блюдо.
- Поместите кремниевой пластины на нагретую пластину 65 ° С в течение 90 мин на плоской поверхности, чтобы вылечить PDMS.
- Удалить отвержденных PDMS из литейного блюдо и кремниевой пластины.
- Отрежьте края PDMS и поместить его на 100 мм диаметра чашки Петри сmicropatterned стороной вверх.
- Промыть micropatterned отвержденных PDMS на чашке Петри с использованием 70% этанола и дистиллированной воды для первичного стерилизации. Затем высушить их полностью в течение 10 мин в сушильном шкафу при 65 ° С.
- Растворите и смешайте O / N 3 г порошкообразного неионогенного ПАВ в 100 мл дистиллированной воды, создавая 3% (вес / объем) раствора для нанесения покрытия.
- Поместите micropatterned PDMS формы в плазме пылесоса и очистить их в течение 1 мин (85 Вт, 0,73 мбар), чтобы создать гидрофильную поверхность, чтобы облегчить добавление водных жидкостей. Затем покройте поверхность PDMS с 100 мл раствора ПАВ, по крайней мере 3 часа (Oro / N) с использованием лабораторного рокер.
- Промыть раствор ПАВ из форм PDMS и высушить их полностью в печи при 65 ° С в течение 10 мин. Затем стерилизовать каждый micropatterned формы под воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения в течение 30 мин.
2. Подготовка клеточной суспензии в гидрогеле предшественника
- Дляподготовки гидрогеля предшественника, растворить 0,1 г альгината натрия порошка в 10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), создавая 1% (вес / объем) альгинат предшественника. Для полного растворения порошка, инкубировать и смешать их O / N.
- Фильтр решение через 0,22 мкм фильтр, подключенный к 1 мл шприца.
- Культура клеток HepG2 у модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина на обычном блюдо культуры ткани до 70% - 80% слияния в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе при 37 ° С ,
- Промыть клетки один раз с помощью PBS, а затем Trypsinize их добавлением 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 4 мин в 5% CO 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Центрифуга клетки, полученные из культуральной чашке при 250 х г в течение 3 мин и ресуспендируют с помощью 1 мл PBS с последующим удалением супернатанта.
- Подсчитайте количество одиночных клеток, распределенных в PBS с использованием автоматизированной ячейкуСчетчик.
- После центрифугирования при 250 мкг в течение 3 мин и удалением PBS, добавить 1 мл 1% (вес / объем) раствора альгината натрия в оставшейся клеточного осадка и смешать их осторожно с помощью пипетки. Конечный плотности посева клеток должно быть 5 х 10 6 - 10 7 клеток / мл. Инкубируйте клеток / гидрогель суспензии в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С.
3. Загрузка и Сшивание Cell / гидрогеля Подвеска
- Растворить 1,47 г хлорида кальция обезвоживают в 100 мл DDH 2 O для получения сшивающего агента (т.е. 100 мМ CaCl 2 · 2H 2 O в DDH 2 O).
- Промойте внутреннюю часть увлажнителя с помощью ультразвукового преобразователя 70% этанола, и заполнить его с 200 мл сшивающего реагента. Увлажнитель широкий 110 мм, длиной 300 мм и глубиной 170 мм (т.е., 110 мм х 300 мм х 170 мм (Ш х В х Г)).
- Поместите micropatterned PDMSФормы в чистой плазмы и очистить их в течение 1 мин при 85 Вт, чтобы создать гидрофильную поверхность.
- Стабильно загрузки 7,2 мкл хорошо перемешанной клеток / гидрогель суспензии при краю micropattern в форме. В примере, показанном использует печени дольки, как сетчатый рисунок (рисунок 1). Объем суспензии зависит от топографической рисунком.
- Для достижения гелеобразование клеток / гидрогель суспензии, включить увлажнитель и убедитесь, что увлажнитель производит туман сшивающего реагента. Спрей сшивающий реагент в гидрогель предшественника в течение 5 мин, охватывающий топографическую поверхность пресс-формы PDMS в пределах 5 см.
Примечание: Расстояния дольше и короче, чем 5 см может привести к неполному и неравномерное гелеобразование, соответственно. Убедитесь, что увлажнитель имеет скорости распыления 250 мл / ч, производя 20 мл тумане сшивающего реагента в течение 5 мин. - После процесса сшивки, выключите увлажнитель и заполнить мес PDMSLDS с PBS.
4. Обращение Одноместный модульный гидрогеля листов
- Снять каждый закаленной гидрогеля лист из micropatterned форм с помощью пипетки PBS мягко вокруг гидрогеля листа с помощью пипетки 200 мкл.
- Возьмите каждый гидрогеля лист плавающей используя 1000 мкл пипетки конец концевой вырезать. Каждый печени дольки, как сетка гидрогеля лист имеет размеры 8 мм х 8,7 мм, и 100 - толщиной 200 мкм.
- Передача одного слоя гидрогеля листа в 1 мл DMEM в 12-луночный планшет и культивирования клеток в пробирке в плавающем способом с использованием гидрогель построить как единичный компонент в 12-луночный планшет в течение недели в 5 % СО 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Замените культуральной среды каждый день.
5. Ассамблея многослойные листы гидрогеля
- Повторите шаги 1.1 до 1.5, чтобы произвести PDMS кадр с размерами 18 мм х 18 мм х 4 мм (Ш хВ х Г), и который содержит 170 мкм высокого столба структуры на нижней поверхности. Использование 42 г смеси PDMS и отвердителя, с тем же соотношением, что и в шаге 1.2. Поместите специализированный поликарбоната плесень на кремниевой пластине для PDMS кадр создать интерьер кадр с размерами 8 мм х 9 мм х 2 мм (Ш х В х Г).
- Стерилизацию кадр PDMS и 180 мкм нейлоновый фильтр пор бумаги погруженный в дистиллированную воду и пинцетом в автоклаве в течение 15 мин при 121 ° С.
- Поместите стерилизовать PDMS рамы, на четверть куска нейлона фильтровальную бумагу (с диаметром 5 см) в 60-мм чашек Петри диаметром.
- Передача модульную гидрогеля лист в интерьере PDMS кадра с использованием 1 000 мкл пипетки конечного сократить. Гидрогель листов, используемых для сборки должны быть культивировали в течение по крайней мере день после того, как были сфабрикованы.
- Совместите край каждого модульного гидрогеля листа с использованием PDMS кадра пустой 200 мкл пипетки,
- Повторите шаги 5.4 и 5.5 с использованием модульных гидрогелевые листы, чтобы сформировать пачку 4 - 6 слоев.
- Удалить культуральной среды течет его через столб структур на дне PDMS кадра. Затем добавляют 2 мкл раствора альгината (2% вес / об) в углу многослойной конструкции.
- Спрей тумана сшивающий реагент в течение 30 сек на многослойной конструкции для крепления краев каждого слоя с теми другой. Использование 2 мл туман сшивающего реагента (при скорости распыления 250 мл / ч).
- Промойте многоуровневую конструкцию осторожно 400 мкл DMEM и снимите PDMS кадр с помощью пинцета.
- Снять многоуровневую конструкцию из фильтровальной бумаги, осторожно протирая клетки подъемника после добавления 4 мл DMEM.
- Перевести многослойной построить на 6-луночного планшета, содержащего 3 мл DMEM с помощью фильтровальной бумаги, и культуру клеток в пробирке в плавающей манере, с гидрогеля построить вмногомасштабный сотовой каркас А в 6-луночный планшет в течение недели в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Замените культуральной среды каждый день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы описали изготовление и манипуляции стоящая клеточные гидрогелевые листы. Как показано на рисунке 1, были изготовлены micropatterned PDMS формы, и клетки-содержащие гидрогель наносили на гидрофильной поверхности этих форм и сшитый с помощью увлажнителя для генерации аэрозольного тумана желирующий агент. После выхода из форм, HepG2 клетки культивировали в автономных гидрогелевые листы с различными узорами (рисунок 2). Таким образом, тонкие листы гидрогелевые условии 3D среде культуры. Кроме того, модульные гидрогелевые листы могут быть собраны наслоения листов с помощью микропипетки с концевой вырезать, и с помощью PDMS каркас, который позволяет 3D культуру клеток макро-масштабе (рисунок 3).
Рисунок 1. Поток ЧаRT Отображение изготовления гидрогеля лист и многослойные листы гидрогеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Автономный 3D Культура клеток в различных гидрогеля листы. Способ изготовления распыления сшивающего агента с поддержкой точного паттерна альгината гидрогеля на микроуровне. Кроме того, изготовленные гидрогелевые листы могут быть собраны из формы и манипулировать легко в автономных условиях. HepG2 клетки с рисунком и культивировали в плоский лист гидрогеля (A), гидрогелевые листы с гексагональной колонн (В), сетки (С), печени дольки, как сетки (D), массив отверстий (E), и Умножитье microcomb, как микроволокна (F). Масштабные бары следующим образом:. 500 мкм (А, D, F), 100 мкм (B, C), и 2 мм (Е) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Ассамблея Micropatterned гидрогеля листов для макро-масштабных Сотовые конструктов. Различные типы гидрогеля листа могут быть собраны с помощью слой за слоем укладки с выравниванием, в том числе сборки пяти гидрогеля листов, содержащих HepG2 клеток, окрашенных зеленой флуоресценции и NIH3T3 клеток окрашивали красной флуоресценции (А). Совокупность micropatterned гидрогеля листов с расширенной структуры трубопровода (B), при условии более высокой жизнеспособности клеток THAп, что не-узорной гидрогелевых листов (C) через 7 дней. Жизнеспособность оценивали путем окрашивания клеток HepG2 кальцеин-AM (живые клетки, показанные как зеленый) и этидиум гомодимера-1 (мертвых клеток, показанные красным). Масштабные бары:. 500 мкм (а) и 200 мкм (B, C), пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает простой способ изготовления модульных гидрогелевые листы, и собирая их, чтобы сформировать 3D клеточных каркасов.
Для построения четких узорчатые альгинатных структур в течение короткого времени, мы должны определить процесс сшивки, которые могут создать достаточно жесткие структуры, чтобы поддерживать сложные micropatterns из формы, а также поддерживать жизнеспособность и клеточный метаболизм. Мы разработали процесс сшивания, в том числе перехода золь-гель, для распыления сшивающего агента, используя увлажнитель в виде тумана. Без этого сшивающего процесса, микро-масштабные модели не может быть сформирована в виде тонкой гидрогеля построить с ограниченной глубины диффузионного (100 - 200 мкм), который обладает высокой диффузионной проницаемости для метаболитов и питательных веществ. Кроме того, по сравнению с существующими диффузии на основе методов, которые требуют 30 - 60 мин, 18 - 20 сшивающий тимне было относительно коротким (3 - 5 мин).
Кроме того, было также сложно манипулировать тонкие листы гидрогеля, которые были механически стабильным только в жидкой среде. Как показано на рисунке 1, тонкой структуры гидрогеля просто и стабильно обрабатываются и манипулировать, используя обычный концевой вырезать для перенесение между различными условий культивирования. Использование методов генерации и манипуляции, мы смогли обеспечить не только однослойного листа в плавающем образом для потенциального применения в анализах наркотиков, но и сложены структуры многослойной, с потенциальными приложений, как строительные леса для тканевой типа конструкций.
Многослойные сотовые архитектуры могут быть получены путем укладки модульного однослойные листы гидрогеля (рис 3а). Каждый модульный гидрогель лист может содержать различные типы клеток, и может подвергаться различным условиям культивирования. Эти многослойные конструкции, то может быть выборочно ASSEMкровь. Тем не менее, просто укладка гидрогелевые листы могут привести к некрозу клеток внутри собранной конструкции, когда общая глубина превышает глубину диффузионного ограниченный (рис 3C). Чтобы преодолеть эту проблему, было бы необходимо для выравнивания модели сетчатый, такие как печень долек, как сетки, когда гидрогелевые листы многослойные собраны. Поэтому мы требуют PDMS кадр с той же внутренней схеме, что граница гидрогеля листа для выравнивания сложенных гидрогелевые листы. Таким образом, выравненные micropatterns отверстий массива в собранном сетки гидрогелевых листов может быть использовано для формирования расширенных структур трубопроводов, содействовать более эффективному переноса питательных веществ для улучшения жизнеспособности клеток (фиг.3В).
Одним из ограничений этого метода является отсутствие клеточной матрицы взаимодействий в альгината гидрогеля. Альгинат не может обеспечить клеточной адгезии лиганды для естественных условиях в -подобных клетка-матрикс взаимодействий; 21 однако, это не отэ механические и геометрические эффекты как 3D-клеток инкапсуляции эшафот с межклеточных взаимодействий. Для первичных клеток и стволовых клеток, альгинат может быть использовано следующее изменение с RGD-содержащих пептидов, 21 или в сочетании с коллагеном или желатином. 14,18 Другим ограничением является то, что, как только клетка-встроенные листов гидрогелевые изготавливают с низкой плотностью клеток ниже 5 × 10 6 клеток / мл, строительство многоуровневой структуры может привести к слабым вложения между гидрогелевых листов, потому что только край структуры фиксируется использование дополнительного альгината. Однако слои могут быть сложены компактно как единое помост через дренажную структуры под PDMS кадра. Кроме того, более высокая плотность клеток в гидрогеле листов может распространяться на поверхности, так и внутри слоя после одного дня культуры, что помогло бы вложения между слоями, как показано на фигуре 3А.
Гидрогель лист ФабрикаМетодика ние и манипуляции, описанный здесь, может быть адаптирована к ин витро культуры систем и подобные ткани клеточных моделей, чтобы обеспечить в естественных условиях -подобных микроокружение для приложений, в том числе клеточных анализах и инженерных искусственных органов. Этот метод может быть применен к основе клеток анализов наркотиков и биологических исследований, которые требуют геометрически различных 3D сотовой микро- и macroenvironments, которые включают различные клетки или гидрогель типов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
- Hoffman, A. S.
- Lan, S., Starly, B. Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities. Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
- Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays. Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).
- Xu, Y., et al. A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions. Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).
- Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel. Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).
- Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks. Biomicrofluidics. 5 (3), 034117 (2011).
- Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules. Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).
- Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).
- Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures. 12 (1), 14-18 (2011).
- Lee, W., et al. Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction. Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).
- Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters. Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).
- Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip. Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).
- Choi, S., Park, J. K. Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels. Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).
- Lee, B. R., et al. In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids. Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).
- Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D.
- Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. Microfluidic scaffolds for tissue engineering. Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
