Abstract
水凝胶可以在使用微流体或微图案的技术,以提供在体内样的三维(3D)几何组织微观尺度进行图案化。所得三维水凝胶为基础的蜂窝结构已被引入作为替代动物实验为先进的生物研究,药理学试验和器官移植的应用程序。尽管水凝胶为基础的颗粒和纤维,可以容易地制造,这是很难操纵它们用于组织重建。在这种视频中,我们描述了一种制造方法,微图案化藻酸盐水凝胶片材,以及它们的组件,以形成一个宏观尺度三维细胞培养体系具有受控细胞微环境。 200微米,具有精确的微图案 - 采用钙胶凝剂薄雾形式,薄水凝胶片材易于与厚度在100〜生成。细胞然后可与水凝胶片材在几何指导培养独立的条件。此外,水凝胶片材可以容易地使用微量具有端切割尖端操纵,并且可以通过使用图案化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)帧堆叠它们组装成多层结构。这些模块化水凝胶片,其可以使用一个浅显工艺制造,具有的体外药物分析和生物学研究,包括微观和宏观结构和组织重建的功能研究潜在的应用。
Introduction
水凝胶是特别有前途的生物材料,并且预计将在基础生物学,药理学试验和医学重要1的水凝胶为基础的蜂窝构造的Biofabrication已经建议减少使用的动物实验中,2,3-取代移植组织,4和提高基于细胞的测定。5,6-含有水(加氢)的粘弹性材料(凝胶)允许进行封装和保持在支架结构,以控制3D细胞微环境的大量细胞。与微流体或微图案的技术的指导组合,该水凝胶结构的几何形状可以精确地在细胞比例控制。迄今为止,多种水凝胶的形状,包括颗粒,7 - 9纤维,10 - 12,片材,13 - 15已经被用作建筑物单元在自下而上的Appro酸痛到宏观规模的多细胞结构的制造。
既基于水凝胶的颗粒和纤维一直容易且迅速地制造为应用程序作为微尺度蜂窝环境中,使用微流体装置的流体控制。然而,如工程化组织的基本单位,它将是复杂的重新排列,并扩大其体积为宏观结构。16,是更难以实现宏观规模构建体相比,以产生微米级的基本模块。可用于水凝胶基的构建体的片状单元通过简单的组装过程来增加支架的体积。必然,水凝胶片材的堆叠层不仅提供一个容积增加,而且在一个三维空间中的几何延伸。
我们以前曾报道制造微图案化的水凝胶片材,13的方法- 15连同其组装成多捻ERED蜂窝架构。该技术使得复杂微图案和蜂窝结构的模块化设计通过多层结构的层叠过程。通过堆叠模块化水凝胶片,这是微图案的制造中,可以实现一个三维细胞培养系统具有受控的宏观尺度细胞微环境。此视频协议描述了一个简单而强大的制造方法,可用于构建模块化水凝胶片材,基于人肝癌细胞系(HepG2细胞)。我们证明本文简单操作这些图案化的模块化的水凝胶片材,和它们的组装成的多层结构。
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Protocol
1.制备微模式化模具和水凝胶的
- 通过标准的两步光刻技术15,17用于铸造PDMS模具生产使用的SU-8光致抗蚀剂的硅晶片的表面上所希望的微观图案。示出的例子使用一个肝小叶状网状图案( 图1)。
- 称出PDMS和固化剂溶液与1:5的比例(即,12.5克PDMS和2.5克固化剂)。
- 彻底混合15克的溶液,脱气气泡在真空室中,然后蔓延混合溶液到硅晶片的微图案化表面均匀内的箔铸造菜。
- 放置在硅晶片上65℃下加热板90分钟在一个平面上以固化的PDMS。
- 从铸造盘和硅晶片剥离固化的PDMS。
- 切的PDMS的边缘,并且将其放置到一个100毫米直径的培养皿所述微图案的一面朝上。
- 使用70%的乙醇和蒸馏水主灭菌培养皿洗涤微图案固化的PDMS。然后,完全进行10分钟干燥后在炉中在65℃。
- 溶解并混合的O / N 3克在100毫升蒸馏水的粉末状非离子表面活性,产生3%(重量/体积)涂布液。
- 放置微图案的PDMS模具在等离子体清洁器然后清洁处理1分钟(85瓦,0.73毫巴)以创建一个亲水性表面,以促进加入的含水液体。然后,外套与至少3小时(ORO / N)用实验室摇杆100 ml的表面活性剂溶液与PDMS的表面上。
- 洗从PDMS模具表面活性剂溶液并完全干燥后在炉中在65℃下进行10分钟。然后,灭菌每个微图案模具通过暴露于紫外线(UV)辐射30多分钟。
2.准备细胞悬浮在水凝胶前体
- 至制备水凝胶前体,溶解在10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)的0.1克藻酸钠粉末,形成1%(重量/体积)藻酸盐前体。完全溶解粉末,孵化,然后将它们O / N。
- 过滤通过连接至1ml注射器0.22微米过滤的溶液。
- 培养的HepG2细胞在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素上的常规组织培养皿直到70%Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) -在5%CO 2的湿润培养箱80%汇合,在37℃ 。
- 洗一次用PBS将细胞,然后加入1毫升0.05%的胰蛋白酶-EDTA 4分钟,在5%CO 2的湿润培养箱中在37℃trypsinize它们。离心机从培养皿收获在250×g离心3分钟,重悬,用1毫升的PBS之后除去上清液的细胞。
- 用自动细胞计数单个分布式细胞在PBS中的数计数器。
- 离心后,在250×g离心3分钟并去除的PBS,加入1毫升的1%(重量/体积)的藻酸钠溶液到其余的细胞沉淀,并使用移液混合它们平缓。细胞的最终接种密度应该是5×10 6 - 10 7细胞/毫升。孵育细胞/水凝胶悬浮液,在5%CO 2的加湿培养箱中在37℃。
3.装载和交联的细胞/水凝胶暂停
- 溶解1.47克氯化钙脱水在100毫升DDH 2 O的以生产交联试剂( 即 100毫米氯化钙2·2H 2 O在DDH 2 O的)。
- 冲洗使用70%的乙醇超声换能器加湿器的内部,并用200毫升的交联试剂的填充。加湿器为110毫米宽300毫米长和170毫米深( 即 110毫米×300毫米×170毫米(宽x高x深))。
- 放置微图案PDMS模具在等离子体清洁器然后清洁处理1分钟,在85瓦到创建一个亲水表面。
- 稳步加载7.2微升充分混合细胞/水凝胶悬浮液的在模具中的微图案的边缘。示出的例子使用一个肝小叶状网状图案( 图1)。悬浮液的体积取决于地形图案。
- 为了实现细胞/水凝胶悬浮液的凝胶化,打开加湿器,并验证该加湿器产生的交联试剂的雾。喷交联试剂到水凝胶前体为5分钟,覆盖范围为5厘米之内的PDMS模具的表面地形。
注意:距离更长和更短于5厘米可能导致不完整的和不均匀的凝胶化,分别。确保该加湿器具有250毫升/小时的喷雾速度,生产在5分钟; 20毫升的交联试剂的雾。 - 继交联过程中,关闭加湿器并填写PDMS莫LDS用PBS。
4.处理单模块化水凝胶表
- 通过用200微升枪头,轻轻吹打PBS周围的水凝胶片分离的微图案模具各硬化水凝胶片。
- 拿起使用最终裁员1000微升吸管尖端每个浮动含水凝胶片。每个肝小叶状网状凝胶片具有8毫米×8.7毫米的尺寸,并且在100 - 200微米厚。
- 使用水凝胶构造作为一个单元部件中的12孔板过了一个星期转移水凝胶片材的单层在1ml DMEM中在12孔板中,并培养所述细胞在体外以浮动方式,在5 %CO 2的加湿培养箱中在37℃。交换培养基隔日1次。
5.装配多层凝胶表
- 重复步骤1.1至1.5,以生产出18毫米×18毫米x 4 mm尺寸的PDMS一个框架(宽x高×深),并且含有170μm的高柱结构在其下表面。使用42克PDMS和固化剂的混合物的,具有相同的比例如在步骤1.2。放置在硅晶片上一个专门的聚碳酸酯模的PDMS框架来创建具有8毫米×9mm的×2 mm尺寸的内部框架(宽x高x深)。
- 消毒PDMS帧和180微米孔径的尼龙滤纸于121℃浸没在蒸馏水和镊子在高压釜中进行15分钟。
- 放置在一个60毫米直径的陪替氏培养皿的灭菌的PDMS帧到四分之一一张尼龙滤纸(直径5厘米)的。
- 传送一个模块化的水凝胶片成使用端切断1000微升枪头PDMS帧的内部。用于组装的水凝胶张应培养至少他们被制造后一天。
- 使用空200μl的移液管尖对准每个模块化的水凝胶片与PDMS框架的边缘。
- 6层 - 使用模块化的水凝胶片材,以形成一摞4重复步骤5.4和5.5。
- 通过在PDMS帧的底部流动它通过所述柱结构除去培养基。再加入2微升藻酸盐溶液(2%重量/体积)在多层构建体的一个角落。
- 喷交联试剂进行30秒的雾到多层构建体附加的每个层的边缘与另一。使用2毫升交联剂的雾(在250毫升/小时的喷雾速度)。
- 轻轻漂洗多层构建体用400μl的DMEM,并使用镊子除去PDMS帧。
- 通过与挺杆继加入4ml DMEM中的细胞轻轻擦拭分离从滤纸上的多层构建体。
- 转移的多层构造到6孔板装有3毫升DMEM中使用滤纸,及培养的细胞在体外以浮动方式,与水凝胶构建体在37℃下在6孔板在一个星期,在5%CO 2的加湿培养箱多尺度蜂窝脚手架。交换培养基隔日1次。
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Representative Results
我们已经描述了制造和操纵独立的细胞水凝胶表。 如图1中,我们制备微图案化的PDMS模具,和包含细胞的水凝胶上样到这些模具的亲水性表面和交联使用增湿以产生胶凝剂的气溶胶雾。以下从模具释放,HepG2细胞都在独立的凝胶片材具有各种图案(图2)中培养。因此,该薄水凝胶片提供了一种三维培养环境。此外,模块化的水凝胶片材可以通过层叠片材使用具有端切断尖端微量移,并使用PDMS帧,这使得3D宏观尺度细胞培养物( 图3)进行组装。
图1.流量 查RT显示水凝胶板和多层水凝胶片的制作。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 独立式三维细胞培养中的各种水凝胶表。喷雾启用藻酸盐水凝胶的精确图案形成在微观尺度交联剂的制造方法。此外,所制造的水凝胶片材可以从模具被收获并在独立的条件下很容易地操纵。 HepG2细胞图案化,并在一平的水凝胶片 (A)中培养,水凝胶片带六角支柱(B)目(C)中,肝小叶状目(D)中,孔的阵列(E)和含多处Ëmicrocomb般的微纤维(F)。该比例尺如下:500微米(A,D,F),100微米(B,C),和2毫米(E) 点击此处查看该图的放大版本。
图3. 装配各类水凝胶薄片的微模式水凝胶片为宏观尺度蜂窝构造。可以通过层-层堆叠与对准装配,包括含HepG2细胞5水凝胶片沾上绿色荧光和NIH3T3细胞的组件沾满了红色荧光(A)。微图案化的水凝胶片材具有扩展流水线结构(B)的一个组件提供更高的细胞活力塔n表示非图案化的水凝胶片材(C)的7天后的。的存活率,通过染色HepG2细胞用钙黄绿素-AM(显示为绿色的活细胞)和乙锭同型二聚体-1(示出为红色的死细胞)进行评估。比例尺:500微米(A)和 200微米(B,C) 点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议提供了一种制造模块化的水凝胶片,并把它们组装,以形成三维的细胞支架的一个简单方法。
为了构建在短时间内鲜明图案化藻酸盐的结构,我们应确定一个交联的过程,可以创造足够刚性的结构,以从模具保持复杂微图案,以及维持细胞活力和新陈代谢。我们已经开发出一种交联方法,包括溶胶 - 凝胶转变,喷使用以雾状形式的加湿器的交联试剂。如果没有这种交联过程中,微规模图案不能在薄水凝胶的形式产生构造与有限扩散深度(100 - 200微米),它具有高扩散渗透率到的代谢物和营养物质。 60分钟,18 - - 20交联剂钛此外,与现有的扩散为基础的方法,这需要30相比我是相对较短(3 - 5分钟)。
此外,也有人有挑战性操纵薄水凝胶片材,其中只有在液体介质是机械稳定的。 如图1所示,薄水凝胶结构简单且稳定地处理,并用一个端切断常规叶尖为不同培养条件之间transferal操纵。使用产生和操作技术,我们可以提供不仅在用于药物试验的潜在应用浮动方式单层片也堆叠的多层结构,具有潜在的应用作为支架用于组织样构建。
多层蜂窝架构可以通过堆叠模块化单层片材的水凝胶(图3A)来生成。每个模块化水凝胶片材可以包含不同类型的细胞,并且可以暴露于不同的培养条件。这些多层构建体然后可以选择性地ASSEM流血。然而,简单地堆叠水凝胶片可导致细胞坏死的组装结构内时的总深度超过限定扩散深度(图3C)。为了克服这个问题,有必要对齐微筛孔图案,如肝小叶状网格中,当多层片材的水凝胶被组装。因此,我们需要具有相同的内部图案的PDMS帧作为水凝胶片的边界对齐堆叠片材的水凝胶。因此,在组装好的网状水凝胶片对准孔阵列微图案可用于形成膨胀管道结构,有利于更有效的养分运输改善细胞生存力(图3B)。
这种技术的一个限制是不存在的藻酸盐水凝胶的细胞 - 基质相互作用的。藻酸盐不能提供细胞粘附的配体在体内样细胞-基质相互作用; 21然而,它确实关闭器的机械和几何效应作为三维细胞包封支架与细胞 - 细胞相互作用。对于原代细胞和干细胞,藻酸盐可用于以下的修改与含RGD的肽,21或与胶原或明胶组合。14,18另一个限制是,一旦细胞包埋凝胶片被制造为低于低细胞密度5×10 6个细胞/ ml,建筑的多层结构的可导致水凝胶片之间弱的附件,因为结构仅边缘被固定通过使用附加藻酸盐。然而,这些层可以紧凑地堆叠经由排水构造与PDMS帧下一个支架。此外,细胞在水凝胶片材的更高密度可以增殖的表面,以及一天培养后的层,这将有助于层之间的附件,如图3A内。
水凝胶片工房这里描述和灰和操作技术可适于体外培养系统和组织样细胞模型,以提供在体内样的微环境的应用,包括细胞分析和工程人工脏器。这种技术可以适用于基于细胞的药物测定和需要不同几何三维蜂窝微型和结合了各种细胞或水凝胶类型macroenvironments生物学研究。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
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