Abstract
ヒドロゲルは 、インビボ様の三次元（3D）組織形状を提供するために、マイクロ流体や微細化技術を使用してマイクロスケールでパターン化することができます。結果の3Dハイドロゲルベースの細胞構築物は、高度な生物学的研究、薬理学的アッセイおよび臓器移植アプリケーションのための動物実験の代替として導入されています。ヒドロゲルをベースとする粒子および繊維は、容易に製造することができるが、組織の再構築のためにそれらを操作することは困難です。この動画では、制御された細胞の微小環境とマクロスケール3D細胞培養系を形成するために、それらのアセンブリと共に、微細アルギネートヒドロゲルシートの製造方法を説明します。 200μmで、かつ正確な微細パターンを有する - カルシウムゲル化剤のミストの形を用いて、薄いハイドロゲルシートは容易に100の範囲の厚さで生成されます。次いで、細胞をヒドロゲルシートの幾何学的な指導を培養することができます自立型条件。また、ヒドロゲルシートは、容易にエンドカットチップでマイクロピペットを使用して操作することができ、パターン化ポリジメチルシロキサン（PDMS）フレームを使用してそれらを積層した多層構造に組み立てることができます。容易なプロセスを用いて製造することができ、これらのモジュラーヒドロゲルシートは、ミクロおよびマクロ構造および組織再構築の機能試験を含むインビトロ薬物アッセイおよび生物学的研究の潜在的な用途を有します。
Introduction
ヒドロゲルは、特に、生体材料を約束しており、基本的な生物学、薬理学的ア ッセイおよび医学において重要であることが期待される。ヒドロゲル系の細胞構築物の1 Biofabrication動物実験の使用を低減するために提案されている、2,3移植組織4を交換し、改善細胞ベースのアッセイ。5,6-含水（ハイドロ）粘弾性物質（ゲル）は、多数のセルが3D細胞の微小環境を制御するために、骨格構造中にカプセル化され、維持されることを可能にします。微小流体または微細技術のガイダンスと組み合わせて、ヒドロゲル構築物の形状は正確に細胞のスケールで制御することができます。現在までに、粒子、7を含むヒドロゲルの様々な形状、 - 9繊維、10から12とシートは、13から15 は、ボトムアップアプロに構築単位として使用されていますマクロスケール多細胞アーキテクチャの製作に痛みます。
ヒドロゲルをベースとする粒子および繊維の両方は、マイクロ流体デバイスを用いて流体を制御して、マイクロスケール細胞環境のような用途のために容易にかつ迅速に製造されています。しかし、操作された組織の基本単位として、それはそれらを再配置し、マクロスケール構造物としての容積を拡大するために複雑になる。16マイクロメートルサイズの基本モジュールを製造することよりも、これは、マクロスケールの構造体を達成することはより困難です。ヒドロゲルに基づく構築物のシート状のユニットは、簡単な組立工程を介して足場の容積を増加させることができます。結果的に、ヒドロゲルシートの積層は、体積の増加だけでなく、3D空間の幾何学的な拡張だけでなく、を提供します。
マルチレイにそのアセンブリと一緒に15 -我々は以前、13マイクロパターンハイドロゲルシートを製造する方法を報告していますセルラーアーキテクチャをered。技術は、多層構造の積層工程を経て、複雑な微細と細胞構造物のモジュラー設計を可能にします。微細化されている積層型モジュラーヒドロゲルシートの製造を介して、制御マクロスケールの細胞微小環境と3D細胞培養系を実現することができます。このビデオプロトコルは、ヒト肝癌細胞株（HepG2細胞）に基づくモジュラーヒドロゲルシートを構築するために使用することができるシンプルで強力な製造方法について説明します。我々は、多層構造の中に、本明細書にこれらの単純なパターニングモジュラーヒドロゲルシートの操作、及びそれらの組み立てを実証します。
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Protocol
マイクロパターン金型及びヒドロゲルの作製
- PDMSモールドを鋳造するための標準的な2段階のフォトリソグラフィ技術15,17を介して、シリコンウェハの表面上のSU-8フォトレジストを用いて所望のマイクロスケールのパターンを生成します。示された例は、肝小葉様メッシュパターン（ 図1）を使用します 。
- 1の比でPDMSと硬化剤溶液を秤量：5（ すなわち 、PDMS 12.5gのと硬化剤2.5 g）を得ました。
- 完全に溶液の15グラムを混合し、真空チャンバ内に気泡を脱ガスし、次に均一にフォイル鋳造皿内のシリコンウェーハのマイクロパターン化表面上に混合溶液を広げます。
- PDMSを硬化させるために、平らな面に90分間65℃で加熱したプレート上にシリコンウェーハを配置します。
- 鋳造皿やシリコンウエハから硬化PDMSを削除します。
- PDMSの端をカットし、100 mmの直径のペトリ皿の上に置きますマイクロパターンサイドアップ。
- 主な滅菌のために70％エタノールと蒸留水を用いてシャーレに微細化硬化PDMSを洗ってください。その後、65℃のオーブンで10分間完全に乾燥します。
- コーティング溶液（w / v）の3％を作成し、蒸留水100ml中で粉末化非イオン性界面活性剤のO / N 3グラムを溶解し、混合します。
- プラズマクリーナーにマイクロパターンPDMS金型を置き、1分（85 W、0.73ミリバール）水性液体の追加を容易にするために、親水性表面を作成するためにそれらをきれいにします。その後、実験室コートロッカーを使用して、少なくとも3時間（ORO / N）を100 mlの界面活性剤溶液とPDMSの表面。
- PDMS型から界面活性剤溶液を洗浄し、10分間65℃のオーブンで完全に乾燥させます。その後、30分かけて紫外線（UV）放射線に曝露することによって、各微細金型を滅菌します。
2.ヒドロゲル前駆体中の細胞懸濁液を準備
- に1％（w / v）のアルギン酸塩前駆体を生成する、ヒドロゲル前駆体を調製リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10ml中のアルギン酸ナトリウム粉末を0.1gを溶解します。完全に粉末を溶解するために、O / Nそれらをインキュベートし、混合します。
- 1ml注射器に接続された0.22μmのフィルターを通して溶液をフィルタリングします。
- 培養10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン、従来の組織培養皿で70％までを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHepG2細胞- 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で80％コンフルエンス。
- 一度PBSを用いて細胞を洗浄し、次いで37℃で5％CO 2加湿インキュベーター中で4分間、0.05％トリプシン-EDTAを1ml添加することによって、それらをトリプシン処理。遠心上清を除去した後、1mlのPBSを用いて3分間再懸濁し、250×gで培養皿から細胞を採取しました。
- 自動化された細胞を用いてPBS中で単分散細胞の数を数えますカウンタ。
- 3分およびPBSを除去するために250×gで遠心分離した後、（w / v）の1％の1 mLを加え、残りの細胞ペレットのアルギン酸ナトリウム溶液を、穏やかにピペッティングを使用して混合します。 10 7細胞/ ml -細胞の最終播種密度は5×10 6でなければなりません。 37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター中で、細胞/ヒドロゲルサスペンションをインキュベートします。
3.ロードとセル/ハイドロサスペンションの架橋
- 塩化カルシウム1.47 gを架橋試薬を生成するためのddH 2 O 100ml中に溶解する脱水（ すなわち 、100ミリモルのCaCl 2・2H 2 O中のddH 2 O）。
- 70％エタノールを用いた超音波トランスデューサと加湿器の内部をすすぎ、および架橋試薬200mlでそれを埋めます。加湿器は、110ミリメートル幅の広い300ミリメートル、長さ170ミリメートルの深さ（ すなわち 、110ミリメートル×300ミリメートル×170ミリメートル（幅×高さ×奥行））。
- マイクロパターンPDMSを配置プラズマクリーナーで金型や親水性表面を作成するために、85 Wで1分間のためにそれらをきれいにします。
- 着実に金型内の微細パターンのエッジでよく混合細胞/ヒドロゲル懸濁液の7.2μLをロードします。示された例は、肝小葉様メッシュパターン（ 図1）を使用します 。懸濁液の容量は、地形のパターンに依存します。
- 細胞/ヒドロゲル懸濁液のゲル化を達成するためには、加湿器をオンにし、加湿器は、架橋試薬のミストを生成することを確認します。 5cmの範囲内のPDMSモールドの地形表面を覆う、5分間のヒドロゲル前駆体上に架橋試薬を噴霧。
距離より長く、より短い5センチメートルはそれぞれ、不完全で、不均一なゲル化が生じる可能性があります。注意してください。加湿器は、5分で架橋試薬のミスト20mlのを生産、250ミリリットル/時間の噴霧速度を持っていることを確認してください。 - 架橋工程の後、加湿器の電源をオフにし、PDMS MOを埋めますPBSでLDS。
シングルモジュラーヒドロゲルシートの4取り扱い
- 200μlのピペットチップを使用して、ハイドロゲルシートの周りに優しくPBSをピペットを介しマイクロパターンを型から各硬化ヒドロゲルシートを外します。
- エンドカット千μlのピペット先端を使用して、各浮動ハイドロゲルシートをピックアップ。各肝小葉様メッシュハイドロゲルシートを8ミリメートル×8.7ミリメートルの寸法を有し、かつ100である - 厚さ200μm。
- ハイドロゲルを使用して浮いた状態でのin vitroでの細胞は5週で12ウェルプレート中のユニット部品として構成する12ウェルプレートに1mlのDMEMにハイドロゲルシートの単層を移し、文化37℃での％のCO 2の加湿インキュベーター。一日おきに培地を交換します。
5の組立多層ヒドロゲルシート
- 繰り返しが18ミリメートル×18ミリメートル×4mmの寸法のPDMSフレームを生成するために1.5から1.1ステップ（幅x下面には170μmの高い柱状構造を含むのHのx D）、および。ステップ1.2と同じ比率で、PDMSと硬化剤の混合物の42グラムを使用してください。 ×9ミリメートル×2ミリメートル（幅×高さ×奥行）8mmの寸法の内部フレームを作成するために、PDMSフレーム用シリコンウェーハ上に特殊なポリカーボネートの金型を置きます。
- 121℃で15分間オートクレーブに蒸留水とピンセットに沈め、PDMSフレームと180μmの細孔ナイロン濾紙を滅菌します。
- 60 mmの直径のペトリ皿中（直径5cmの）ナイロンフィルター紙片の四分の一に滅菌PDMSフレームを配置します。
- エンドカット千μlのピペットチップを使用して、PDMSフレームの内部にモジュラーハイドロゲルシートを転送します。組み立てに使用されるハイドロゲルシートは、それらが作製した後、少なくとも一日のために培養されるべきです。
- 空の200μlのピペットチップを使用して、PDMSフレームと各モジュール式のハイドロゲルシートの端を合わせます。
- 6層 - 繰り返し4のスタックを形成するために、モジュール式のヒドロゲルシートを使用して、5.4と5.5を繰り返します。
- PDMSフレームの一番下にある柱構造を介して流出することにより、培養液を除去します。そして、多層構造物の隅にアルギン酸塩溶液2μL（w / vの2％）を追加します。
- 別のものとそれぞれの層の端部を取り付けるために、多層構造体の上に30秒間架橋試薬のミストを噴霧します。 （250ミリリットル/時間の噴霧速度で）架橋剤のミストの2ミリリットルを使用してください。
- 400μlのDMEMで穏やかに多層構造物をすすぎ、ピンセットを使用して、PDMSのフレームを削除します。
- 優しくDMEMの4ミリリットルを添加した後、細胞リフターで拭いてろ紙から多層構造体を取り外します。
- ヒドロゲルと同様に構成する、3濾紙を使用して、DMEM mlの培養浮遊様式でインビトロで細胞を含む6ウェルプレートに、多層構築物を転写37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター中で一週間以上、6ウェルプレート中のマルチスケールの細胞の足場。一日おきに培地を交換します。
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Representative Results
我々は、製造や携帯ヒドロゲルシートを自立の操作を説明しています。 図1に示すように 、我々は、マイクロパターンPDMS金型を製作し、細胞を含むヒドロゲルは、ゲル化剤のエアロゾル化ミストを生成するための加湿器を使用して、これらの型の親水性表面上にロードされ、架橋されました。金型からの放出後に、HepG2細胞を様々なパターン（ 図2）でヒドロゲルシートを自立で培養しました。したがって、薄いヒドロゲルシートは、3D培養環境を提供しました。さらに、モジュラーヒドロゲルシートは、3Dマクロスケールの細胞培養（ 図3）を可能にする、末端切断先端を有するマイクロピペットを用いて、PDMSのフレームを使用してシートを積層して組み立てることができます。
図1. フローチャRTハイドロゲルシートおよびマルチレイヤヒドロゲルシートの作製を表示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
様々なハイドロゲルシート図 2.支えが3D細胞培養。マイクロスケールでのアルギン酸ハイドロゲルの正確なパターニングを可能に架橋試薬を噴霧する製造方法。また、製造されたヒドロゲルシートを鋳型から収穫することができ、自立した状態で簡単に操作。 HepG2細胞をパターン化し、平坦なヒドロゲルシート（A）で培養した、六角柱（B）、メッシュ（C）、肝小葉様メッシュ（D）、孔のアレイ（E）、及びmultipl有するヒドロゲルシートEのmicrocombのようなマイクロファイバー（F）。次のようにスケールバーは、次のとおりです。500ミクロン（A、D、F）、100ミクロン（B、C）、および2ミリメートル（E）は 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マクロスケール細胞構築のためのマイクロパターンヒドロゲルシートの 図3 のアセンブリ。ヒドロゲルシートの各種緑色蛍光およびNIH3T3細胞を染色したHepG2細胞を含む5ヒドロゲルシートのアセンブリを含む、アラインメントを用いてレイヤーバイレイヤースタックを介して組み立てることができ赤色蛍光（A）で染色しました。拡張パイプライン構造（B）を有する微細ヒドロゲルシートの組立体は、より高い細胞生存率THAを提供しました非パターン化されたヒドロゲルシート（C）のnは7日後。生存率は、カルセインAM（緑色として示されている生細胞）、エチジウムホモダイマー1（赤色で示され、死細胞）にHepG2細胞を染色することによって評価しました。スケールバー：500μmの（A）と 200ミクロン（B、C）は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、モジュラーヒドロゲルシートを作製し、3次元細胞の足場を形成するためにそれらを組み立てる単純な方法を提供します。
短時間で明確なパターン化アルギン酸塩構造を構築するために、我々は金型から複雑な微細パターンを維持するだけでなく、細胞の生存率および代謝を維持するのに十分な剛性構造を作成することができ、架橋プロセスを特定する必要があります。私たちは、霧状で加湿器を使用して、架橋試薬を噴霧するために、ゾル - ゲル転移を含む、架橋プロセスを開発しました。代謝物および栄養素の高い拡散透過性を有する - （200〜100μm程度）、この架橋プロセスがなければ、マイクロスケールのパターンが限られた拡散深さで構築薄いヒドロゲルの形態で生成することができませんでした。 60分、18 - - 20架橋TIまた、30を必要とする既存の拡散ベースの方法と比較（ - 5分3）私は比較的短かったです。
さらに、それはまた、唯一の液体培地中で機械的に安定した薄膜ヒドロゲルシートを操作するために挑戦しました。 図1に示すように 、薄いヒドロゲル構造が簡単かつ安定的に処理され、異なる培養条件間で譲渡するためのエンドカット従来のチップを使用して操作しました。生成および操作技術を用いて、我々は、組織様構築物のための足場としての潜在的な用途では、薬物のアッセイにおいて潜在的な用途だけでなく、積層多層構造に浮いた状態にするだけでなく、単層シートを提供することができます。
多層セルラアーキテクチャは、モジュール式の単層ヒドロゲルシート（ 図3A）を積層することによって生成することができます。各モジュラーヒドロゲルシートは、異なる細胞型を含んでいてもよいし、異なる培養条件に暴露することができます。これらの多層構造物は、次いで、選択されてもよいASSEM採血しました。合計深さが制限された拡散深さ（ 図3C）を超えた場合しかし、単にヒドロゲルシートを積層して組み立てられた構造体の内部の細胞壊死をもたらすことができます。この問題を克服するために、多層ハイドロゲルシートが組み立てられたとき、そのような肝小葉のようなメッシュとしてマイクロメッシュパターンを位置合わせする必要があります。したがって、我々は、積み重ねられたヒドロゲルシートを揃えるためにハイドロゲルシートの境界線と同じ内部パターンを持つPDMSフレームを必要とします。したがって、組み立てられたメッシュヒドロゲルシートに整列穴アレイの微細パターンは、改善された細胞生存率（ 図3B）のためのより効率的な栄養素の輸送を容易にする、拡張パイプライン構造を形成するために使用することができます。
この技術の1つの制限は、アルギン酸塩、ヒドロゲル中の細胞 - マトリックス相互作用の不在です。アルギン酸は 、in vivo様細胞-マトリックス相互作用のための細胞接着リガンドを提供することはできません。21しかし 、それはオフにし細胞間相互作用を持つ3D細胞封入足場のような機械的および幾何学的効果えー。初代細胞および幹細胞を、アルギネートは、RGD含有ペプチドによる修飾後に使用することができ、21またはコラーゲンまたはゼラチンと組み合わせた。14,18の別の制限は、細胞埋め込 みヒドロゲルシートは、以下の低細胞密度で製造された後、ということです構造体の唯一のエッジが追加のアルギン酸塩を使用して固定されているため、5×10 6細胞/ mlを、多層構造の構成は、ヒドロゲルシートの間に弱いアタッチメントを引き起こす可能性があります。しかし、これらの層は、PDMSのフレームの下に排水構造を介して、単一の足場としてコンパクトに積層することができます。また、ハイドロゲルシートのセルのより高い密度は 、図3（a）に示すように、層の間に、添付ファイルを助けることになる、1日間培養した後、層内だけでなく、表面に増殖することができます。
ハイドロゲルシートファブリカここで説明化および操作技術は、細胞アッセイおよびエンジニアリング人工臓器などのアプリケーションのためのインビボ様微小環境を提供するためにin vitro培養系および組織様細胞モデルに適合させることができます。この技術は、細胞ベースの薬物アッセイおよび幾何学的に異なる細胞の3Dマイクロおよび種々の細胞またはヒドロゲル型を組み込むmacroenvironmentsを必要とする生物学的研究に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
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