Introduction
牛奶是营养新生哺乳动物，对于婴儿生长发育1,2-提供能量和营养的唯一来源。而乳主要由细胞脂质和蛋白 1，它还包含了过多了调节后代生命早期发展，包括酶，碳水化合物，激素，抗体，生长因子，细胞因子，外来体，微泡，和小RNA这样的生物活性化合物的作为微小RNA 1,2。孕妇奶粉在建立后代免疫和肠道健康3中的基础性作用，再加上证据表明，母乳喂养的婴儿不易受疾病2，突出了识别与疾病过程的早期生活有关的牛奶成分和所涉及的分子机制的重要性在他们的行动。发育大鼠是一种流行调查的各种营养，生理效果模型，并在早期的化学干预-生命的发展4。因此，大鼠乳汁的分析可以提供新的洞察孕产妇和后代的健康。
目前的科学进步，现在提供了越来越多的深入调查，对健康和疾病的特定的牛奶成分的影响的机会。例如，牛奶细菌型材测序阐明在婴儿肠道5早期肠集群自己的角色，乳寡糖的质谱分析已通过母亲饮食6，和微小RNA的深度测序分泌提供的洞察的乳寡糖概况的改变母乳的脂肪球突出于基因转录，代谢和免疫功能7可能角色。
大鼠模型代表在产妇的研究8,9中最常用的模式生物之一。一个优点是其短怀孕期和哺乳期的，仅approximat伊利21天每一个;因此，从怀孕哺乳的开始的总时间表示短时间内在能够产生有价值的数据。大鼠的较大尺寸相比小鼠，在奶源的背景下，可提供相对于牛奶和易于奶源体积显著优势;牛奶产量的小鼠，例如，似乎是依赖于总体重以产生更多的奶10较重的小鼠。
在这里，提供了手动收集的牛奶哺乳大鼠的一般描述。此协议需要最少的设备，非侵入性的，廉价的，并且可以用于收集奶足够量用于进一步下游分析。简言之，大坝用异氟烷麻醉，放乳由催产素的刺激，以及牛奶通过牛奶手册表达收集到毛细管。最后，如牛奶两个主要组成部分是脂肪和蛋白质，简要DESCRIPTIOÑ 估计使用creamatocrit测量11和使用标准蛋白质测定总蛋白质浓度的定量乳脂肪含量的呈现。
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Protocol
该协议被批准卡尔加里动物保健委员会的大学和符合该指南实验动物的护理和使用 。
从后代1.独立坝
- 挤奶12之前至少5分钟分开她的后代的坝。
注：大坝可以挤奶可达5-6小时分离1,6,13后，但是分离的时间超过4小时，可能会改变乳成分14。而分离时间似乎没有影响奶源容积 12，它是表示，维持整个研究一致分离时间。乳成分在整个哺乳期15可能发生变化，因此，应努力保持奶源一致的一天。最大的牛奶生产建议将发生在哺乳期第14天12。 - 使用变暖室，确保幼崽能够保持适当的身体temperatu重新没有他们的母亲的存在的挤奶过程的持续时间。
注：在研究下面列出，挤奶在断奶，当水坝约22周龄的后代21日龄进行，因此也没有变暖室使用。
2.设置和准备
- 收集需要的挤奶过程的所有材料。
注：所有材料可在材料和设备表中找到。 - 放置一个加热垫板凳挤奶的地方将发生并覆盖垫在垫吸收板凳上。
- 设置麻醉系统。确保系统有足够的氧气，并开始前异氟醚。附加麻醉剂掩模将用于初始麻醉诱导到机器。放置，将用于对附近如果比初始麻醉剂掩模不同麻醉维持掩模。
- 附加将25g针1毫升注射器催产素注射用无菌技术。
- 打开加热垫使母体体温挤奶过程期间保持。注：监视所述加热垫的温度，以确保垫不会变得太热并且造成烫伤。或者，使用热源，诸如外科加热表，可以设置到特定的温度。
3.麻醉大坝使用异氟醚
- 打开氧气罐，并打开流量1升（1000毫升）每分钟。打开异氟醚的流动，并设定为5％。注意：避免直接吸入麻醉剂，防止麻醉剂蒸气积聚。
- 麻醉大坝。
- 如果需要切换到维修面具，把大坝平卧于吸收板凳垫。缺乏踏板反射确认麻醉。
- 降低的异氟烷至2-3％的流量为维持麻醉。持续监测大坝整个程序，以确保德不发生呼吸PRESSION。注意：一旦在麻醉状态下，坝的眼睛应该使用无菌的眼润滑剂，以防止眼睛变干或者成为划伤保护。
4.注射催产素
- 确保催产素（20 USP单位/毫升）还未到达其到期日期。催产素消毒的小瓶消毒酒精擦拭/酒精清洁垫。
- 催产素入注射器的使用无菌技术，制定2 IU（0.1毫升）。使用一个新的针头和注射器将挤奶每个坝。
注：催产素剂量范围通常为单个注射1至5 IU 1,6,12,16。或者，4国际单位/公斤体重的剂量可以使用12。 2 IU单剂量可如果挤奶困难遇到重复一次。 - 腹腔注射催产素。针插入与朝向头部的针指向腹部的右下象限，以一定的角度15-30°，约0.5厘米深。
- 向后拉柱塞，以确保在注射前的负压。如果任何流体（血液，尿液，肠内容物， 等）被吸入注射器，取出针，并尝试在注射用新的针头和注射器。如果没有流体被吸入注射催产素和立即丢弃针头和注射器成生物危害容器。
- 等待大约5-15分钟的催产素刺激放乳。
5.准备挤奶遗址
- 您可以选择其中的牛奶将被收集网站/奶嘴。乳可从任何奶嘴12被收集。
- 轻轻取出周围与剪挤奶奶头的毛皮，毛皮可能造成困难样品收集由于牛奶芯吸。温柔 - 围绕乳头的皮肤非常敏感，可能是干的，因此很容易受到划痕和泪水。
- 的奶嘴我灭菌不是必要的，但可选，清洁用温水将奶嘴的皮毛被删除后。因为多个站点可能需要的奶源至少准备两个站点。
注：如果牛奶分析包括微生物分析，乳头区，可能需要消毒用碘5。
6.奶源
- 轻轻挤压奶嘴的基础上，手动排出乳汁收集。
注：如果牛奶分析包括微生物分析，第一滴几滴牛奶应丢弃。 - 收集奶液滴进入毛细管时，填充所述毛细管。可以容纳体积较大（ 例如，50微升）缓解这一进程毛细管。
注意：如果难以收集奶遇到，催产素的第二剂量可以施用。推荐剂量不超过4 IU总和。 - 分配从毛细管的牛奶到由无菌的离心管动它被用来从乳头到微量离心管的侧吸取乳汁的管的端部 - 观察通过毛细作用被拉出的毛细管的牛奶。
注：“吹出”使用连接到1ml注射器18G的针头未吸入到管内的奶。 - 连续监视大坝疼痛或呼吸抑制的迹象，并相应地调整异氟醚的流动。
- 继续如在本节中所述，直到足够的牛奶已收集为所选奶分析收集奶。对于下面的creamatocrit和蛋白质浓度测定描述，收集0.25毫升牛奶。
注：使用不同的挤奶网站，如果放乳减慢或所选择的网站不排出乳汁充分。最多约2.5毫升每只动物乳汁可以收集17，或至多每奶头0.5毫升作者建议，根据麻醉总时间限制为约45-60分钟，邻ř挤奶的45分钟。 - 收集乳成microhematocrit管用于从新鲜牛奶样品creamatocrit测量，并密封与粘土密封剂管的端部。标注microhematocrit管坝ID和直立存放牛奶样品。
- 当挤奶完成后，关闭异氟烷和氧气的流量。从大坝取下面膜，继续监测大坝，直到清醒。建议如果没有充分意识到，大坝应在恢复期放在吸收板凳垫，而不是直接在笼子里的床上用品，防止被褥被吸入或恢复过程中刮伤大坝的眼睛。
注意：不要让水坝无人看管，直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨recumbancy。 - 如果没有进一步的分析是必需的，冻牛奶在-80℃。其他人已经提出，牛奶可以在-20℃18被储存长达3小时，在4℃或5个月。
7. Creamatocrit测量
- 通过计算乳creamatocrit（奶油的乳样品中的百分比）19估计在牛奶中的脂肪含量。
注：测量与人乳已显示，无论是新鲜或冷冻牛奶可以用于一个creamatocrit测量，然而鲜奶更高度相关（r = 0.92与R = 0.90）与脂浓度11。使用新鲜或冷冻牛奶creamatocrit测量应保持一致的整个研究中，作为解冻牛奶都与一个小的下降creamatocrit相关值11。 - 对于鲜奶，收集乳汁从乳头到microhematocrit管的样品;填写至少¾满（约15-20微升）。另外，搅拌好后得出鲜牛奶从收集的样品放入毛细管。密封到底用粘土密封胶。
- 将毛细管插入比容离心器，用密封端指向外，保证了离心机是平衡的。
- 开始的血细胞比容旋转（120秒，13700 XG）。
注：旋转时间或速度可能因离心分离机所用的模式改变。 - 从离心机中取出管后的自旋是完整的，进行测量来计算creamatocrit。仔细观察样品的分离成奶油层和透明层。
- 测量和记录流体在管的总长度和的脂肪（霜）的长度使用卡尺或尺子层。
注：creamatocrit表示为奶样本19内的膏层的百分比，计算为（奶油层的长度/牛奶柱的总长度）×100（ 图1A）。计算从creamatocrit测量脂肪浓度和能量值如下：脂肪浓度（g / L）=（creamatocrit（％） - 0.59）/0.146（图1B）19;能量值（KC人/ L）= 290 +（66.8 * creamatocrit（％）（图1C）19。
8.蛋白质浓度测定
- 使用牛血清白蛋白作为蛋白标准，确定使用标准蛋白质测定，总乳蛋白质浓度如洛瑞蛋白质测定法6。
注：牛奶稀释可能需要的乳蛋白质测量落入测定法的标准曲线内。
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Representative Results
截至取Wistar水坝断奶描述的牛奶收集（约22周龄，体重350至400g），其消耗的控制（AIN-93G中，n = 5），高蛋白质（40％酪蛋白重量/重量，N = 5）或高益生纤维（21.6％重量/重量，1：1的比例的寡果糖和菊粉中，n = 4）的饮食整个怀孕和哺乳期。催产素剂量为2 IU。使用毛细管奶收集，并用血细胞比容喷丝确定creamatocrit（图1A），然后将其用于估计根据脂肪浓度和能量值一个管进行纺丝：脂肪浓度（g / L）=（creamatocrit（％ ）-0.59）/0.146（图1B）;能量值（千卡/ L）= 290 +（66.8 * creamatocrit（％）（图1C）19。乳蛋白质浓度使用Bio-Rad公司DC蛋白测定（图2）来确定。有在creamatocrit无差异（p = 0.674），脂肪含量（P = 0.674），能量值（P = 0.674），邻基于母亲膳食（单向ANOVA）R蛋白质浓度（p值= 0.127）。
图1.牛奶creamatocrit，脂肪含量和能量值 。牛奶样品，收集了从只Wistar水坝控制断奶（N = 5），高蛋白（N = 5），或高益生元纤维（N = 4）饮食整个怀孕和哺乳。 Creamatocrit测量（A）被用来计算乳脂含量（B）和能量值（C）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.总乳蛋白质浓度。牛奶样品收集编辑从只Wistar水坝控制断奶（N = 5），高蛋白（N = 5），或高益生元纤维（N = 4）饮食整个怀孕和哺乳。总蛋白浓度采用Bio-Rad公司的DC蛋白测定来决定。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
作者有没有利益冲突披露。所有的动物实验均按照批准廉政公署的协议进行的。
Acknowledgments
这个作品是通过从加拿大自然科学和工程研究委员会（RGPIN 238382-2011）和健康研究（MOP115076）的加拿大学院资助。希瑟·保罗是由加拿大自然科学和工程研究理事会研究生奖学金和艾伯塔创新的健康解决方案的奖学金支持。梅根·哈勒姆是由自然科学与工程研究理事会研究生奖学金，一个弗雷德里克·班廷和查尔斯最佳加拿大研究生奖学金，和亚省儿童医院研究所培训奖遗传学，儿童发展，健康的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Milking | |||
| 1 ml syringes | BD-Canada | 309602 | |
| 25 G needles | BD-Canada | 305122 | |
| 18 G needles | BD-Canada | 305196 | |
| 50 μl Microdispenser Capillary Tubes | Fisher Scientific | 21-169D | |
| Oxytocin (20 USP Units/ml) | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | Used on the order of a veterinarian |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Dukal | 853 | |
| Absorbent Bench Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket | Cincinnati Sub-Zero | 274 | |
| Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer | Benson Medical Industries Inc. | Subject to individual laboratory needs | |
| Animal Masks | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| Equipment - Creamatocrit | |||
| StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated) | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal Capillary Tube Sealant Tray | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
References
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