Summary
Att mäta effekterna av miljögifter på fisk beteende är ofta subjektiv och utmanande särskilt när det handlar om subletala endpoints. Vi beskriver metoder inklusive videoteknik för att kvantifiera simbeteende av de tidiga levnadsstadierna vit stör (Acipenser transmontanus) under och efter 96 tim akut exponering för olika koncentrationer av koppar.
Introduction
Att förstå hur förorenings exponering kan påverka beteendet är ibland mycket utmanande och subjektivt. Beteende är normalt definieras som en serie av uppenbara, observer, aktiviteter hela kroppen som verkar genom det centrala nervsystemet och gör det möjligt för en organism att överleva, växa och föröka sig. Beteendeförändringar till följd av exponering för ett giftämne är bland de mest känsliga indikatorer på miljöstress ofta mellan 10-100 gånger känsligare jämfört med överlevnads en. De flesta av dessa studier undersökta simning aktivitet, ventilation och födosöksbeteende fisk 2,3,4. Simning aktivitet är den mest använda subletal slutpunkt för att bestämma en beteendeförändring som svar på en förorening i toxicitetstester 5. Simning variabler är frekvensen och varaktigheten av rörelse, hastighet och tillryggalagd sträcka, frekvens och vinkel varv, ställning i vattnet och mönstret av simning. Simning aktivitet ären effektiv åtgärd av simbeteende vid bedömningen av känslighet för ett toxiskt medel baserat på de kriterier som föreslås i kapitel 9 av Rand 6 i boken Fundamentals of Aquatic Toxicology.
Detta dokument presenterar en toxikologisk studie som ett exempel på hur toxicitet koppar till tidiga liv steg vit stör (Acipenser transmontanus) i olika skeden av tidiga utvecklingen i vatten enbart exponeringar i förhållande till Sturgeon simbeteende utvärderades och illustrerar metoder för att kvantifiera simning beteende.
I tidigare studier, negativa beteendemässiga reaktioner var tydliga med tidig debut under de första dagarna av akuta och kroniska exponeringar mot koppar och blev alltmer allvarlig överexponering varaktighet och koncentration 7,8,9. Magnituden och tidpunkten för uppkomsten av dessa beteendesvar sannolikt tillräckliga för att begränsa den långsiktiga överlevnaden och således är av intresse med tanke på de konsekvenser för recruitment misslyckande 10. För att korrekt tolka betydelsen av denna känslighet för metall och förfaranden exponerings utvecklades för att kvantifiera tidsförloppet och graden av beteende försämringar i förhållande till kopparkoncentrationer.
Testprotokoll för beteende funktion och utveckling fastställdes genom att analysera overhead video prover av stör i exponeringskammare. Videoprovexemplar kvalitativ bedömning av utveckling och funktion hos koppar behandlingar hela exponeringstiden. Beteende och husrum sökande aktivitet utvärderades under exponering för vattenbaserade kopparkoncentrationer för att bestämma tid för att åstadkomma och att karakterisera den temporala sekvensen för nedskrivning som påverkar skydd sökande, letargi, simning samordning, jämvikt, och andning. Dessutom har videoinspelningar gjorda av stör subsamplas från varje replikera i syfte att kvantitativt dokumentera spontan simning aktivitet. Dessa effektmått inkluderade åtgärder längd eller den tid flytta, simning hastighet och tillryggalagd sträcka 5,11 med hjälp av en kommersiellt tillgänglig digital bildanalys programpaket. Denna programvara definierar konturerna av varje bild inom ett synfält och från denna, definierar centroiden för varje bild. Mjukvaran kan sedan spåra positionen för varje tyngd i en bildruta för bildruta följd att bestämma rörelsebanor.
Denna studie uppfyllt alla tillämpliga delar av de slutliga arbetsdjurskyddslagen föreskrifter (9 CFR) och med alla institutionella riktlinjer för human behandling av testorganismerna under kultur och experiment. Vid uppsägning av studien var all fisk avlivas i enlighet med lämpliga riktlinjer som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén för US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.
Protocol
1. Ställ späd för Larv Sturgeon Exponering för Vattenkopparhalterna
- Ställ in exponering med hjälp av en genomflödessystem, såsom en modifierad Mount och Brungs 12 utspädningssystemet följande riktlinjer enligt ASTM International 13,14,15.
- Välj 25 mikrogram / L som den höga kopparkoncentrationen baserat på tidigare testresultat där effekter observerades runt 4-6 mikrogram / L. Använd reagenskvalitet koppar II-sulfat pentahydrat (> 98% renhet) och blanda upp en teststamlösning.
OBS: Exempel koncentrationsserie för exponeringarna är 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,0625, och 0 mikrogram / L. Med användning av 50% serieutspädningar som börjar med 25 | ig / l som den höga koncentrationen kommer att rikta ett intervall av koncentrationer som observerats för att orsaka beteendefunktion. - Förbered provstamlösning i en mätkolv 48 timmar före inledningen av exponeringen och inställd på att leverera till spika spädblandningskammaren med hjälp av enautomatiserad spruta dispenser.
- Använda ett kalkylblad mall för att fastställa vikten av kemikalien som skall läggas till en L avjoniserat vatten som kommer att resultera i 25 | ig / l kopparkoncentrationen, när utspädningsblandningskammare är preparerade med en ml av teststamlösning.
OBS: Figur 1 visar ett exempel på ett kalkylblad mall för kemisk mäldberedningen för utspädningstoxicitetstest. - Väg upp 195 mg av reagenskvalitet koppar II sulfat pentahydrat med hjälp av en analytisk balans och häll i en 1 L mätkolv och blanda med ett L avjoniserat vatten för en stamkoncentration av 48,65 mg / L.
- Placera suget från den automatiserade spruta dispenser i teststamlösningen och ställ in spiken volym till 1 ml och slå späd på genom att slå på strömbrytaren och låt cykel under 48 timmar låt det utjämna till motsvarande kopparkoncentrationen före lagring stör.
- Bifoga en in-line 4-vägs flödesdelare
- Ställ späd att cykla var 30 min med hjälp av automatiserade timer och att leverera 250 ml test vatten med varje cykel, vilket resulterar i 12 volym tillägg per dag för varje replikera testkammare.
- Väljer exponeringstestkamrar som baseras på storleken av den stör för att upprätthålla acceptabel laddningshastighet som är <10 g fisk våtvikt / L i varje kammare vid varje given tidpunkt. Till exempel, för att genomföra exponeringar med 30 dags efter kläckning (DPH) vit stör (genomsnittlig vikt i gram 0,17 g) använder 12 x21,5 cm 2 glasburkar med en 4 cm hål i sidan. Täcka denna sida med en 30 mikron mesh sikt av rostfritt stål för att tillåta genomflöde av testvattnet. Volymen av testvattnet i exponerings burkarna är ett L.
- Med användning av en 50 ml plastspruta ta två likadana 50 ml vattenprov vid varje koncentration för totalt 12 prov och fördela testvattnet i 100 ml glasbägare och mäta upplöst syre (DO), temperatur, ledningsförmåga, pH, alkalinitet, hårdhet, totalt ammoniak, stora katjoner, stora anjoner och löst organiskt kol med hjälp av kommersiell standardutrustning och följa tillverkarens instruktioner.
OBS: prov tas vid början och slutet av exponeringen. - Att samla delprov för kemisk analys, använd en 25 ml plastspruta, rita upp ca 24 ml provvatten från exponeringskammare med hjälp av en sipper halm fäst i sprutan i stället för en nål.
- Ta bort halmen sipper från syringe och placera en polypropylen filterpatron bostäder en 0,45 um porstorlek, polyetersulfon membran på plastspruta.
- Tryck 4 ml testvatten genom filtret och kassera.
- Dispensera de återstående 20 ml testvatten genom filtret till ett syra rengjorda polyetylenflaska och surgör till 1% volym / volym med hög renhet, 16 M salpetersyra under lagring av upp till 3 månader.
OBS: Prover för kemisk analys bör tas vid början, mitten och slutet av exponering för att bekräfta kopparkoncentrationer. - Utför kemisk analys med hjälp av induktivt kopplad plasma masspektrometri efter US Environmental Protection Agency Metod 6020a 17
- Efter att ha tagit alla vattenprover och späd är cykling, lager 10 (slumpmässigt, slumpmässigt) stör i varje replikera testkammare. Samla stör från odlingstanken där de är inhysta med en liten nät utan slip nät. Placera stör i en liten Bucket med kultur vatten. Totalt 240 fisk behövs för att starta exponeringen.
- Inte mata fiskarna under exponeringen.
OBS: Se figur 1 för en visuell inställning av späd layout. - Läs testet varje dag under hela exponeringen och spela fiskdöd och övervaka simning beteende.
OBS: Andra ändpunkter för att leta efter letargi, förlust av balans, förändringar i andning, förändringar i pigmentering, ställning fisk i vattenmassan, gömmer aktivitet och andra avvikelser som kan identifieras visuellt.
OBS: Läs testet vid samma tidpunkt varje dag för konsekvens. - Mät och kvantifiera simning aktivitet (tid fisk tillbringade flytta, hastighet och avståndet flyttas) med hjälp av en kommersiellt tillgänglig digital spårningsprogram program.
2. Observationer och mortalitetsräkningar under exponering
- Inspektera varje test chbärnsten och notera dödlighet och observationer av onormalt beteende med hjälp av en beteende checklista (tabell 1) på datablad ungefär samtidigt dagligen under 96 timmar exponering, företrädesvis på morgonen.
OBS: Beteenden som är slående, okaraktäristiskt, subjektivt, kvalitativt annorlunda från kontrollerna anses onormal. Optimalt observatören är omedveten om de behandlingar.
OBS: Förlusten av jämvikt definieras som oförmåga av fisk för att bibehålla en upprätt position inom vattenmassan och orörlighet definieras som oförmåga fisken att flytta eller simma inte stack. Andra störningar såsom letargi, hyperaktivitet, ökningar eller minskningar i andning, färgförändringar, darrningar, kramper, uppsvälld buk, ställning i vattenmassan och andra ovanliga simning mönster bör också registreras på databladet.
OBS: Se till Video 1 för exempel på onormalbeteende. - Spela in och ta bort döda stör dagligen.
- Med hjälp av en handhållen löst syre (DO) meter med sond mäta löst syre in situ och spela vattentemperaturen i två kopior av varje exponeringskoncentration och spela in på databladet.
3. Filminspelningen Swimming Aktivitet
- Fånga videoinformation prov med användning av en handhållen videokamera monterad på ett stativ placerat direkt overhead av testkammaren för att dokumentera beteendeavvikelser.
- För att kvantifiera simning aktivitet, skära en bit av PVC-rör 13 cm i diameter och 13 cm hög för att använda som test arena (Figur 1). Placera PVC-rör i späd inom varje motsvarande kopparkoncentrationen exponeringstankar. Använd området inom PVC-rör som test arena som är stor nog för stör att simma fritt.
- Vid slutet av den 96 h exponering, slumpvis subprov 5 överlevande stör från varje koppar concentration för att mäta för simning aktivitet och placera dem i till testarenan med en liten mesh nät.
OBS: I de högre testkoncentrationer där stör dödlighet var förhärskande, bör eventuella kvarvarande överlevande stör användas för att mäta simning aktivitet och i vissa fall kan vara mindre än fem. - Efter att ha placerat fisken i till testarenan, tillåter fisken att acklimatisera sig under en period av 30 min.
OBS: Lyckad kräver felfri analys av videon en bild med hög kontrast av fisken mot en bakgrund med ett minimum av struktur som kan skymma eller dölja bilden av fisk. Bilden av fisken måste vara i bra fokus och måste vara fri från ytan bländning eller utan snedvridningar på grund av rinnande vatten så att utspädningssystemet måste vara avstängd. - Efter 30 min, vrid videokamera på och inställd på REC för att spela in simning aktivitet under en period av 2 min.
- Avliva fisken efter att ha tagit de videoinspelningar att avgöra varamänskliga beteenden som appliceras.
- Placera stör i en koncentrerad lösning av tricaine metansulfonat (MS222) vatten i minst 10 min för att medge upphörande av opercular rörelse.
ANMÄRKNING: En koncentration av minst 250 mg / L rekommenderas och kan vara mycket högre för vissa arter. - Placera euthanized stör i en plast zip-lock påse och placera i frysen för bortskaffande vid ett senare tillfälle. Stäng av videokameran och överföra alla videofiler till en dator för efterbearbetning med digital mjukvara.
4. Åtgärder för simning aktivitet från videouppspelning
- Lokalisera databladet och video datafiler för experimentet som skall analyseras. Konvertera videofiler till ett kompatibelt format den digitala analysprogrammet kan hantera.
- Ladda upp alla filer som skall bearbetas till programvara. Öppen mjukvara genom att klicka på ikonen. Klicka på "Ny standard experiment" under "Skapa ett nytt experiment" option på huvudskärmen.
- Ange namn för experiment i "Nytt experiment" i dialogrutan som visas på skärmen. Välj plats experiment filen skall sparas. Klicka på "OK". Välj "experiment Inställningar" under "Setup" .Choose "Från videofil" under "Videokälla".
- Välj "1" för "Antal arenor". Välj "3" för "Antal försökspersoner per arena". Välj "Center-point detection" under "Band funktioner". Välj önskade enheter.
- Välj "Trial lista" under "Inställningar". Klicka på "Lägg" överst på skärmen. Välj "Alfabetisk ordning" under "Sortera" alternativet "Lägg" i dialogrutan som visas på skärmen. Klicka på "Bläddra". Navigera till mappen där videofiler finns.
- Markera alla videofiler. Klicka på "Öppna". Klicka på "Lägg till variabel" överst på skärmen. Ange "Koncentration" i "Etikett "låda. Enter" kopparkoncentrationen i mikrogram / L "i" Beskrivning "rutan.
- Välj "Numerical" från rullgardinsmenyn för "Typ". Klicka på "fördefinierade värden" låda. Välj "Definiera enskilda värden" i den "fördefiniera numeriska värden" i dialogrutan som visas.
- Mata in "0", "3", "6", "13", "25", och "50" i "fördefinierat värde" utrymme. Klicka på "Lägg till >>" mellan varje nummer tillägg. Avmarkera "Tillåt andra värden" alternativet. Klicka på "OK".
- Välj "Trial" från rullgardinsmenyn i "Scope" rutan. Ange lämplig koncentration för varje försök i rutorna. Klicka på "Lägg till variabel" överst på skärmen. Ange "replikera" i "Etikett" låda. Ange "Replikera antal" i "Beskrivning" rutan. Välj "Numerical" från rullgardinsmenyn för "Typ".
- Klicka på "Pomdefinieras värden "box. Välj" definiera individuella värden "i den" fördefiniera numeriska värden "i dialogrutan. Ange" 1 "," 2 "," 3 "och" 4 "i" fördefinierat värde "utrymme. Klicka på" Lägg till >> "mellan varje nummer tillägg. Avmarkera" Tillåt andra värden "option.Click" OK ".
- Välj "Trial" från rullgardinsmenyn i "Scope" rutan. Ange lämplig replikera nummer för varje försök i rutorna. Välj "Arena Settings" under "Setup" fliken överst på skärmen. Namn första inställningen "Försök 1". Klicka på "Grab bakgrundsbild" alternativ från "Arena inställningar (Trial 1)" i dialogrutan.
- Klicka på "Bläddra" på "Grab bakgrundsbild" i dialogrutan. Leta upp videofiler för försök 1 och klicka på "Öppna". Klicka på "Grab" alternativ i "Grab bakgrundsbild" i dialogrutan efter video visas. Klicka på den vita cirkeln ikonen nära toppen av skärmen under "Arena Inställningar".
- Manipulera cirkel som visas så att hela badplatsen är innesluten i cirkeln. Hatch märken visas där arenaområdet definieras. Klicka på "Kalibrering Scale" ikonen nära toppen av skärmen under "Arena Settings". Vänsterklicka på en kant av arenan. Håll och dra musen över till motsatta änden av arenan. Släpp vänsterklicka.
- Ange "10,5" i "riktiga världen avståndet" rutan i "Calibration Distance" dialogruta som visas. Klicka på "OK". Om det är nödvändigt, justera kalibreringslinje så att den sträcker sig över hela diameter cirkulär arena.
- Klicka på "Validera Arena Inställningar" alternativet "Arena inställningar (Trial 1)" dialogrutan. Åtgärda eventuella frågor om inställningarna inte är validerade. Högerklicka på "Arena Settings" under "Setup" alternativ från "Experiment Explorer" i verktygsfältet till vänster på skärmen och välj "Nytt" från menyn.
- Upprepa steg från 4,11 till 4,15 tills arenan inställningar have skapats för varje försök. Var noga med att välja rätt videofilen för varje försök. Välj "Detection Settings" under "Setup" alternativ från "Experiment Explorer" i verktygsfältet till vänster på skärmen.
- Välj "Dynamic subtraktion" från rullgardinsmenyn under "Method" i "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta som appears.Choose olika fyllningsfärger för varje ämne under "Ämne Identification" i "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialog låda.
- Välj "Välj Video" och lokalisera video för Trial 1.Click "Öppna" .Välj "5,9941" från "Sample rate" rutan under "Video" i "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta. Klicka på "Inställningar" för "Referensbild" alternativ under "Detection" i "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta.
- Klicka på "Starta lärande (C)4; alternativ i "Reference Image" dialog box.Wait för program för att lära referensbild. När bilden i "Reference Image" dialogruta visas utan djur, klicka på "Använd dynamisk referensbild" under "Förvärvs inställningar" i dialogrutan.
- Klicka på "Close". Välj "Mörkare" från rullgardinsmenyn för "Motivet är" under "Detection" i "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta. Ställ mindre antal till "33" och större antal till "153" för "Dark kontrast" under "Detection" "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta.
- Klicka på "Spara ändringar" längst ner till höger på "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta. Klicka på play-knappen på "Playback Control" dialogruta och bekräftar att programvaran har spåra djur i motsats till skuggor eller skräp. Justera siffrorna för "Dark contrast "vid behov.
- När spårning är lämpligt, klicka på "Spara ändringar" längst ner till höger på "Detection inställningar: Detection inställningar en" dialogruta. Välj "Förvärv" under "Setup" alternativ från "Experiment Explorer" i verktygsfältet till vänster på skärmen.
- Klicka på "Spår nästa planerade rättegång" i "Förvärvs Settings" dialogrutan. Bekräfta den korrekta prov, video och arena inställningen visas under "Inställningar" i "Förvärvs Settings" dialogrutan.
- Kontrollera "Detection bestämmer hastigheten" alternativ i "Förvärv Control" dialogrutan. Klicka på knappen med den gröna cirkeln innesluten i en vit ruta för att påbörja förvärvsprocessen. Upprepa steg från 4,22 till 4,23 tills alla försök har spårats.
- Klicka på "Data Profiler" under "Analysis" alternativ från "Experiment Explorer" i verktygsfältet till vänster om screen.Choose "Time" under "Nesting" option i "Komponenter" i verktygsfältet. Justera "Till" till "0:02:00" under "Välj spår tidsintervall" rubrik i "Time" dialogrutan. Klicka på "OK".
- Dra "Nest" rutan mellan "Start" rutan och "Resultat 1" rutan i "Data Profiler" område på höger sida av skärmen. Klicka på "Analysis Profile" under "Analysis" alternativ från "Experiment Explorer" i verktygsfältet till vänster på skärmen. Klicka på "Velocity" under "avstånd och tid" rubrik i "beroende variablerna" verktygsfält som visas.
- Klicka på "Lägg till" på "Velocity" dialogrutan. Klicka på "Avstånd flyttas" under "avstånd och tid" rubrik i "Beroende variabler" i verktygsfältet. Klicka på "Lägg till" på "Avstånd flyttas" dialogrutan. Klicka på "Movement" under "individens beteende" rubrik i "beroende variablerna" toolbar.
- Justera "medelvärdesintervall" till "1" under "Outlier filter" rubrik i "rörelsen" dialogrutan. Justera "Starta hastighet" till "2,00" och "Stopp hastighet" till "1,75" under "Threshold" rubrik i "rörelsen" dialogrutan.
- Kontrollera båda rutorna för "Flytta" och "inte röra sig" under "Beräkning statistik för" rubrik i "rörelsen" dialogrutan. Klicka på "Add" längst ner på den "Movement" dialogrutan. Klicka på "Analys Output" under "Resultat" i den "Experiment Explorer" i verktygsfältet till vänster på skärmen. Klicka på "Beräkna" överst på skärmen.
- När beroende variabler beräknas, klicka på "Export" överst på skärmen. Välj destinationsmapp i "Export Analysis Output" dialogrutan. Välj "Excel" från "File type" rullgardinsmenyn i "Export Analysis output "dialogrutan. Klicka på" OK ".
- Klicka på "Spara Experiment" under "File" längst upp på skärmen. Överbrygga den digitala mjukvara. Importera data till ett kalkylark och analysera användning av en kommersiell statistiskt analysprogram.
Representative Results
Manuellt bearbeta visuella observationer visade procent abnormiteter ökade med ökande kopparkoncentration efter bara 72 timmar av exponering inletts med två dagen efter lucka (DPH) stör (Figur 2). Videoprov dokumenterade extrem påverkan av koppar exponering stör simbeteende (Video 2) och hjälp vid fastställandet beteende försämring som följd. I ett annat exempel, stör vid 30 DPH visat känslig för koppar exponering med en 96 hr genomsnittlig dödlig effekt koncentration (LC50) av 40,3 mikrogram / L baserat på endast dödlighet. Men när subletala beteendeändpunkterna förlust av balans och immobilisering ingår tillsammans med dödlighet känslighets ökar med uppskattningsvis 96 timmar medianeffektkoncentrationen (EC50) som sträcker sig från 2,4 till 5,0 mikrogram / L. Videodokumentation fångade dessa subletala effekter och ytterligare validerade mänskliga observationer av beteendestörningar som spelatsunder exponeringen. Användningen av digital mjukvara minskade efterbearbetningstiden avsevärt när man analyserar simning aktivitet. Fiskar som simmar hastighet, tillbringade tiden i rörelse, och tillryggalagd sträcka minskade alla signifikant (Figur 3) med ökande kopparkoncentration. Simning banor minskade också med ökande kopparkoncentration (Figur 4).
Figur 1:.. Computer skärmdump av ett kalkylblad mall som används för att bestämma provstamlösning koncentration Kemisk lager förberedelse för testerna utspädningstoxicitets bestämdes med hjälp av ett kalkylblad mall baserad på en målkoncentration Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Utspädnings installation och experimentell design Olika livsstadier vit stör utsattes för koppar. Storleken på späd används för exponeringar valdes baserat på storleken på fisken. (A) Tidigt liv steg stör exponerades med en liten utspädnings setup och (b) äldre etapp i livet stör exponerades med hjälp av en stor utspädnings setup.
Figur 3: simbeteende resultat från ett tidigt liv steg vit stör (Acipenser transmontanus) 72 timmar kopparexponering (med början 30 dagar efter lucka [DPH] fisk). Simning aktivitet endpoints (a) varaktighet rörelse bland 30 DPH vit stör; (B) hastighet simning; och (c
Figur 4: Resultat från ett tidigt liv steg vit stör (Acipenser transmontanus) 96 timmar kopparexponering (med början två dagar efter lucka [DPH] fisk) Överlevande vit stör på två DPH uppvisar förlust av jämvikt och immobilisering efter 72 timmar av en. 96 tim exponering med ökad kopparkoncentration. Asterisk indikerar signifikant skillnad från kontroll, felstaplar representerar standardavvikelse.
Figur 5: Exempel på simning väg resultat från ett tidigt liv steg vit stör (Acipenser Transmontanus) 96 timmar kopparexponering (stirrar med 30 dagen efter lucka [DPH] fisk). Simning vägar stör digitaliseras med hjälp av digital mjukvara från (a) kontroll replikat (n = 5 fisk) och (b) från en hög behandling (50 | ig / l) replikat (n = 3 fisk) efter en 96 h exponering. Notera antalet simning vägar utgör inte antalet fiskar i kammaren på grund av vissa fisken var inaktiva. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
| kvantifierbar Parameter | observation Parametrar |
| Hastighet | Letargi / Hyperactivity |
| avstånd rört | Förlust av jämvikt |
| Varaktigheten av tid i zon | Spasmer / darrningar / upsidener |
| Zone övergångs antal gånger organismen rör sig mellan utvalda zoner | Position i vattenmassan |
| På väg till punkt-beräknar avvikelsen av djurets väg mot en punkt av intresse | Andning (snabb / långsam) |
| Rubrik beräknar rubriken för den valda kroppspunkten | Färgsättning |
| Vrid vinkelskillnaden på väg mellan två prover | gömma |
| Vinkelhastighets beräknas genom att dividera styrvinkel av provintervall | |
| Meander-beräknas genom att dividera turn vinkel av avståndet flyttas. Används för att jämföra vända sig i djur rör sig med olika hastigheter | |
| Tid som tillbringas i rörelse | |
| Mobility topp beräknar hur länge hela området detekteras som djur förändras, även om center punkten är densamma | |
| Rotations en rotation är klar när den valda kroppspunkten har en kumulativ styrvinkel på 360 °. Vänder i motsatt riktning som är mindre än tröskelvärdet ignoreras. | |
| Rörligheten kontinuerligt beräknar den procentuella andelen av rörlighet för den fullständiga området för den detekterade djur, även om mittpunkten förblir densamma. | |
| Avståndet mellan försöks-beräknar avståndet mellan alla aktörer och de utvalda mottagare | |
| Närhet-beräknar hur länge skådespelaren är eller inte är i närheten av mottagaren | |
| relativ rörelse | |
| Net vägt rörelse rörelse skådespelaren till (positiv) och från (negativ) mottagaren, viktat med avståndet mellan dem | |
| Vägt rörelse från-moveme nt av skådespelare från mottagaren, viktat med avståndet mellan dem. | |
| Viktade rörelse till- rörelse skådespelaren till mottagaren, viktat med avståndet mellan dem | |
| Trial kontroll räkningen period mellan två händelser av försöket manöverdon, inom ett element | |
| Trial kontroll händelse ögonblick då en händelse i ett element du har definierat i försöket Kontroll sker. |
Tabell 1:. Beteende endpoints kvantifierade genom digital mjukvara Dessa ändpunkter kan användas på individer eller grupper och även fungera som en lista för visuell observations kontroller av beteende försämring under exponeringen.
/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> Video 1. Visuell definition av onormalt beteende som uppvisas av drabbade vita stör (Högerklicka för att ladda ner) En daglig observations checklista användes för att dokumentera avvikelser Den. förlust av balans och immobilisering var de vanligaste avvikelser observerades under exponeringarna. modifierade från Calfee et al. 7
Video 2: Visuell dokumentation belysa ett exempel på vit stör simbeteende. (Högerklicka för att ladda ner) Vit stör simning aktivitet minskades kraftigt vid exponering för ökande kopparkoncentration. Stören avbildas i denna video är från en kontroll, medium låg, och en hög behandling vid slutet av en 96 h vattenlösning av kopparexponering. Även den vita stör fortfarande levde är det uppenbart fisken var kraftigt nedsatt på behandlingarna jämfört med kontrollerna. Modifierad från Calfee et al. 7
Discussion
Förändringar i beteende på grund av exponering för en förorening används ofta som en slutpunkt för subletal toxicitet, men kan vara svåra att mäta. I allmänhet är beteendesvar mätt med visuella observationer och manuell dataanalys som kräver en hel del tid att bearbeta. Men med stigande teknik, har metoder för att kvantifiera simning aktivitet fokuserat på att använda videography 18 och rörelseanalys eller digital mjukvara som minskar den tid bearbetning och analys. Under analys av videon fångade data kvantifiera simning variabler manuellt skulle ha varit mycket tidskrävande så användningen av videodatainspelningar och fisk spårningsprogram som ett mer effektivt och ändamålsenligt sätt för att analysera stör simbeteende. Även förfarandet markerade simning beteendet hos en fisk, anpassa för andra organismer som amfibier och ryggradslösa vattendjur skulle kräva enkla ändringar. Beroende på vad beteende endpoints bemöts, experimentell design och kamerasystem kan utvecklas för användning med nästan alla kommersiellt tillgängliga spårningsprogram paket.
Metoden demonstreras med hjälp av upplöst koppar, men är tillämplig på andra vattenföroreningar eller egenskaper, såsom temperatur eller syrehalt. Protokollen utvecklas och presenteras i detta dokument används en enkel digital videokamera som inspelningsenhet. De digitala filer lätt överföras till en dator och laddat in i rörelse analysprogram. Metoderna ständigt ändras och förfinas för att effektivisera kvantifiering processen. Det är absolut nödvändigt att videokvaliteten vara i HD för att analysen programvara för att identifiera varje enskild fisk för att spåra. Någon bakgrund som inte kontrasterar med fisken kommer att orsaka problem när man försöker bearbeta datafiler. Ett annat vanligt problem med tvådimensionell video tracking är att identifiera individerNär du simmar vägar korsas. Detta kan korrigeras manuellt genom att identifiera varje fisk under vägen korsningen och koppla upp vägsegmenten i programvaran. Alternativt kan total aktivitet bestämmas från varje replikat kammare som en grupp i genomsnitt. Flera enskilda kammare med var och en innehållande en fisk kan filmas i samma synfält för att beräkna rörelser enskilda fiskar.
För närvarande har vi uppgraderat till att använda en serie av overhead övervakningskameror ovanför exponeringskammare som är kopplade till en högupplöst digital videoinspelning enhet (HD-DVR). Emellertid kommer användningen av någon kamera system som kan spela in högupplösta MPEG-4 video fungerar. HD-DVR kan ställas in för att spela in vid en viss tidpunkt och programmeras för upp till 7 dagar. Detta hands-off automatiserade tillvägagångssätt gör det möjligt att fånga flera filmer samtidigt att upprätthålla konsekvens och samtidigt minimera yttre störningar som skulle kunna äventyra fiskens beteende. HD-DVR systems är anslutna till ett internt nätverk så att överföra filer är relativt enkel. Medan den automatiska kamerasystemet är en mycket förbättrad teknik för att kvantifiera simbeteende, är det fortfarande fördelaktigt att genomföra visuella observationer att fungera som ytterligare underlag för att dokumentera beteende försämring under toxicitetstester.
Det finns en lång historia av litteratur dokumentera förändrad fiskens beteende till följd av exponering för metaller som går tillbaka till det tidiga 1960-talet 19,20,21. Koppar har visat sig orsaka förändringar i aktivitetsnivåer som hypoaktivitet i bluegill 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) och förändringar i rörelse och näring av bäckröding 23 (Salvelinus fontinalis). Åtminstone några ung fisk förlitar sig på sitt luktsinne för att upptäcka och undvika rovdjur, och koppar-inducerad Chemosensory brist kan påverka beteenden i samband med detektering av larm kemikalier 24,25,26 27. Dessa förändrade beteenden överensstämde med vad som observerades under exponeringarna.
Simbas beteende vit stör var kraftigt påverkades under subletal exponering för vattenhaltiga kopparkoncentrationer .. Dessa resultat illustrerar hur beteendet påverkas vid subletala koncentrationer av koppar och kan användas som en indikator på toxisk stress. Videon baserad analys visat sig vara effektiva i att kvantifiera simning beteende och även varit kvalitativ visuell dokumentation av de allvarliga effekter på stör utsätts för koppar. Analysen Programvaran är också möjligt att kvantifiera andra beteende ändpunkter. Se tabell 1 för en lista. Exponeringssystemet kan modifieras för att ta itu med varje ändpunkt irealtid läge och kan användas för att kvantifiera skillnader i beteende i samband med exponering för olika föroreningar av oro.
Användningen av beteende endpoints i vattenmiljön toxikologisk forskning är allt anställd och bör övervägas vid utvärdering av effekterna av föroreningar eftersom adaptiv beteende funktion är avgörande vid fastställandet av miljöskador 9. Effekterna av miljöföroreningar till fiskens beteende är ofta subjektiv och utmanande särskilt när det handlar om subletala endpoints i frånvaro av standardmetoder ..
Simning aktivitet som kvantifieras med hjälp av dessa metoder kan noggrant övervakas, är icke-förstörande med minimal belastning på organismen och kan upprepas. Simning beteende är en giltig och konsekvent index för subletal toxicitet som bör ingå i testprotokoll för att utöka känsligheten av test 5 standardtoxicitets.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2 L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
References
- Gerhardt, A. Aquatic behavioral ecotoxicology-prospects and limitations. Hum Ecol Risk Assess: An International Journal. 13 (3), 481-491 (2007).
- Beitinger, T. L. Behavioral reactions for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 495-528 (1990).
- Beitinger, T. L., McCauley, R. W. Whole-animal and physiological processes for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 542-575 (1990).
- Behavioural Ecotoxicology. Dell'Omo, G. , J Wiley & Sons. Chichester, UK. (2002).
- Little, E. E., Finger, S. E. Swimming behavior as an indicator of sublethal toxicity in fish. Environ Toxicol Chem. 9, 13-19 (1990).
- Rand, G. M. Behavior. Fundamentals of Aquatic Toxicology: Methods and Applications. Rand, G. M., Petrocelli, S. R. , Hemisphere Publishing. New York. 221-256 (1985).
- Calfee, R. D., et al. Acute sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to copper, cadmium, or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2259-2272 (2014).
- Little, E. E., Calfee, R. D., Linder, G. Toxicity of smelter slag-contaminated sediments from Upper Lake Roosevelt and associated metals to early life stage White Sturgeon (Acipenser transmontanus Richardson, 1836). J Appl Ichthyol. , 1-11 (2014).
- Wang, N., et al. Chronic sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to cadmium, copper, lead or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2246-2258 (2014).
- Little, E. E. Behavioral measures of injuries to fish and aquatic organisms: regulatory considerations. Behavioural Ecotoxicology. Dell'Omo, G. , J Wiley & Sons. Chichester, UK. 411-431 (2002).
- Little, E. E., Brewer, S. K. Neurobehavioral toxicity in fish. Target Organ Toxicity in Marine and Freshwater Teleosts New Perspectives: Toxicology and the Environment. Volume 2. Schlenk, D., Benson, W. H. , Taylor and Francis. London and New York. 139-174 (2001).
- Mount, D. I., Brungs, W. A. A simplified dosing apparatus for fish toxicological studies. Water Res. 1, 21-29 (1967).
- Standard guide for performing early life-stage toxicity tests with fishes. Annual.Book of ASTM International Standards. Volume 11.06. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E1241.htm (2014a) 1241-1305 (2013).
- Standard guide for measurement of behavior during fish toxicity tests. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E1711.htm (2014b) 1711 (2014).
- Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , ASTM International. West Conshohocken, PA. SOURCE: http://www.astm.org/Standards/E729.htm (2014c) 729-796 (2014).
- Brunson,, et al. Assessing bioaccumulation of contaminants from sediments from the upper Mississippi River using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch Environ ConTox. 5, 191-201 (1998).
- Brumbaugh, W. G., May, T. W., Besser, J. M., Allert, A. L., Schmitt, C. J. Assessment of elemental concentrations in streams of the New Lead Belt in southeastern Missouri, 2002-05. U.S. Geological Survey Scientific Investigations Report 2007-5057. , (2007).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Gipson, G. T., Molteno, T. C. A., Hunter, C. A video-based movement analysis system to quantify behavioral stress responses of fish. Water Res. 38, 3993-4001 (2004).
- Sprague, J. B. Avoidance of Copper-Zinc Solutions by Young Salmon in the Laboratory. JWater Pollut Control Fed. 36 (8), 990-1004 (1964).
- Saunders, R. L., Sprague, J. B. Effects of copper-zinc mining pollution on a spawning migration of Atlantic salmon. Water Res. 1 (6), 419-432 (1967).
- Barron, M. G. Environmental contaminants altering behavior. Behavioural Ecotoxicology. Dell'Omo, G. , Wiley & Sons. Chichester, UK. 167-186 (2002).
- Ellgaard, E. G., Guillot, J. L. Kinetic analysis of the swimming behavior of bluegill sunfish, Lepomis macrochirus rafinesque, exposed to copper: hypoactivity induced by sublethal concentrations. J Fish Biol. 33, 601-608 (1998).
- Drummond, R. A., Spoor, W. A., Olson, G. G. Some short-term indicators of sublethal effects of copper on brook trout, Salvelinus fontinalis. J Fish Res Board Can. 30, 698-701 (1973).
- Hansen, J. A., Rose, J. D., Jenkins, R. A., Gerow, K. G., Bergman, H. L. Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to copper: neurophysiological and histological effects on the olfactory system. Environl Toxicol Chem. 18, 1979-1991 (1999).
- Sandahl, J. F., Baldwin, D. H., Jenkins, J. J., Scholz, N. L. A sensory system at the interface between urban stormwater runoff and salmon survival. Environ Sci Technol. 41 (8), 2998-3004 (2007).
- McIntyre, J. K., Baldwin, D. H., Beauchamp, D. A., Scholz, N. L. Low-level copper exposures increase visibility and vulnerability of juvenile coho salmon to cutthroat trout predators. Ecol Appl. 22 (5), 1460-1471 (2012).
- Green, W. W., Mirza, R. S., Wood, C. M., Pyle, G. G. Copper binding dynamics and olfactory impairment in fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol. 44 (4), 1431-1437 (2010).
