Abstract
थाइमस, αβ टी कोशिकाओं और रीढ़ में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की रीढ़ की हड्डी की पीढ़ी के लिए प्राथमिक अंग है, लंबे समय αβT केवल कोशिकाओं के स्रोत के रूप में माना गया है। फिर भी, थाइमिक पेचीदगी परिधि में भोले αβT कोशिकाओं का एक काफी कम उत्पादन के लिए अग्रणी जीवन में जल्दी शुरू होता है। फिर भी, यहां तक कि शतायु नये अधिग्रहीत रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता का निर्माण कर सकते हैं। हाल के शोध से समारोह की थाइमिक नुकसान की भरपाई हो सकती है कि रास्ते में से हालांकि हमारी समझ अभी भी rudimental हैं, extrathymic αβT सेल विकास चलता है। γδ टी कोशिकाओं ऊतकों में मुख्य टी सेल सबसेट का गठन कि जन्मजात लिम्फोसाइट हैं। हमने हाल ही में दिखा कर एक γδ टी सेल सबसेट के लिए एक अब तक नाचीज बकाया समारोह जिम्मेदार माना कि सीडी 4 की दुर्लभ इकाई + Vδ1 + γδ टी कोशिकाओं भड़काऊ शर्तों में αβT कोशिकाओं में transdifferentiate कर सकते हैं। यहाँ, हम पीपरिधीय रक्त से इस पूर्वज के अलगाव और इसके बाद खेती के लिए प्रोटोकॉल rovide। Vδ1 कोशिकाओं सकारात्मक हम एक और चुंबकीय लेबलिंग तकनीक के साथ सीडी 4 + कोशिकाओं के दुर्लभ अंश को लक्षित जिसमें एक दूसरे कदम के द्वारा पीछा किया, चुंबकीय मोतियों का उपयोग स्वस्थ मानव दाताओं की PBMCs से समृद्ध कर रहे हैं। दूसरी लेबलिंग की चुंबकीय शक्ति पहला चुंबकीय लेबल में से एक से अधिक है, और इस तरह ब्याज की आबादी का, कुशल मात्रात्मक और विशिष्ट सकारात्मक अलगाव की अनुमति देता है। हम तो कोशिकाओं की क्लोनिंग और कुशलता के विस्तार के लिए और FACS विश्लेषण द्वारा उत्पन्न क्लोन की पहचान के लिए आवश्यक तकनीक और संस्कृति हालत परिचय। इस प्रकार, हम शुद्धि, संस्कृति और सीडी 4 + Vδ1 + γδ टी कोशिकाओं की पूर्व vivo विस्तार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह ज्ञान इस αβT सेल progenitor`s जीव विज्ञान से संबंधित हैं कि अध्ययन के लिए और आईडीई करने का लक्ष्य है, जो उन लोगों के लिए शर्त हैइसकी transdifferentiation में शामिल कर रहे हैं कि आणविक चलाता ntify।
Introduction
रीढ़ में, सेलुलर और प्रतिरक्षा के एक त्रिदोषन भाग में संरचित है कि प्रतिरक्षा अनुकूली रोगजनकों के खिलाफ रक्षा करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। एंटीजन की एक विस्तृत श्रृंखला की मान्यता टी कोशिकाओं के संबंध में थाइमस 1 में मुख्य रूप से उत्पादन किया जा ग्रहण कर रहे हैं जो hyperpolymorphic टी और बी सेल रिसेप्टर्स (TCR / बीसीआर), द्वारा मध्यस्थता है। बहां, अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी), थाइमस बीज और अंत में सभी टी सेल प्रजातियों को जन्म दे रही अच्छी तरह से परिभाषित चरणों के साथ अलग। और सीडी 8 - - थाइमस बोने पूर्वज सीडी 4 कर रहे हैं और इस तरह अपरिपक्व, डबल नकारात्मक (डी.एन.) thymocyte अंश का गठन। थाइमस व्युत्पन्न संकेत तो उनके वंश प्रतिबद्धता और αβ या γδ टी कोशिकाओं या तो में भेदभाव प्रेरित। DN2 / 3 thymocytes में कार्यात्मक रूप से पुनर्व्यवस्थित TCR-γ और TCR-δ श्रृंखला जीनों की अभिव्यक्ति सेलुलर प्रसार एक ड्राइव जो δTCR परिसरों, γ की ओर जाता हैγ δT कोशिकाओं 2,3 में भेदभाव को बढ़ावा देने चाहते हैं। इसके विपरीत, एक preTCR पीटी का निर्माण करने के लिए preTα साथ जोड़ी कर सकते हैं कि एक कार्यात्मक TCR-β श्रृंखला की पुनर्व्यवस्था, ट्रांसक्रिप्शनल DN3 thymocytes में TCR-γ श्रृंखला का मुंह बंद करने और सीडी 4 + 8 + डबल सकारात्मक thymocytes 4 में उनके संक्रमण लाती है । इस स्तर पर, TCR-α श्रृंखला के पुनर्संयोजन इस प्रकार इन कोशिकाओं अपरिवर्तनीय 5-9 में उत्पादन एक γδTCR नकारात्मक, TCR-α ठिकाना भीतर स्थित है कि TCR-δ ठिकाना को हटाने, होता है। पुन: व्यवस्थित αβTCRs बाद में औतोइम्मुिनित (नकारात्मक चयन) से बचने के लिए एक निश्चित सीमा से अधिक नहीं हो सकता है, जो दुर्बलता (सकारात्मक चयन) स्वयं एमएचसी बाध्य करने की उनकी क्षमता, के लिए चुने गए हैं। MHC वर्ग मैं या द्वितीय बंधन की उनकी क्षमता के अनुसार, चयनित αβT कोशिकाओं एकल सकारात्मक सीडी 4+ या सीडी 8 + टी कोशिकाओं, जो बाहर निकलें थाइमस के रूप में भोले टी कोशिकाओं में विकसित करना।
हालांकि, थाइमस की पेचीदगी जल्दी लगभग बुझा के बाद किशोरावस्था 10 है कि भोले टी कोशिकाओं की तेजी से कम उत्पादन के लिए अग्रणी जीवन में शुरू होता है। फिर भी, टी सेल पूल के आकार के बाद थाइमिक होमियोस्टैटिक टी कोशिकाओं के प्रसार को और लंबे समय रहते immunologic स्मृति 11 के प्रसार से ही भाग में समझाया जा सकता है, जो जीवन भर लगातार बना रहता है। नतीजतन, extrathymic टी सेल विकास होने चाहिए। हाल के शोध-पर जो extrathymic कार्यात्मक αβ टी कोशिकाओं 12-17 को जन्म साइटों दिया αβT सेल पूर्वज, विशेषता है कि पर्याप्त आकर्षण का फायदा हुआ है। फिर भी, एक थाइमस से स्वतंत्र αβT कोशिकाओं में अंतर यह है कि extrathymic αβT सेल व्यापारियों के बारे में विस्तृत ज्ञान हम वे इस तरह ले मार्ग पर है पृष्ठभूमि के रूप में के रूप में टूटा हुआ है।
हमने हाल ही में Vδ1 + के छोटे टी सेल इकाई की पहचान 18, के रूप में सीडी 4 + γδT कोशिकाओं। दिलचस्प बात यह है और संभावित नए एंटीजन मान्यता प्राप्त किया जा सकता है, ताकि इस प्रकार, प्रदर्शनों की सूची विविधता का विस्तार करने के बाद थाइमिक टी कोशिकाओं के homeostatic प्रसार, Vδ1 सीडी 4 + कोशिकाओं की transdifferentiation नई टी सेल रिसेप्टर्स उत्पन्न करता है, के विपरीत और संरक्षण हो सकता नये अधिग्रहीत रोगजनकों के खिलाफ मेजबान। यह टी कोशिकाओं की प्लास्टिसिटी के लिए कहते हैं और extrathymic टी सेल के विकास के लिए एक अब तक नाचीज नए मार्ग कहते हैं।
उद्देश्य यह αβT सेल extrathymic विकास precursor`s ट्रिगर है कि उन मार्करों और अणुओं की पहचान करने के लिए लिम्फोसाईटिक स्रोतों से मात्रात्मक अलगाव, एकल कोशिका क्लोन की पीढ़ी और उनके कुशल विस्तार आवश्यक हैं।
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Protocol
नैतिक कथन: सभी प्रक्रियाओं हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार बाहर किया गया और विश्वविद्यालय के Tübingen में क्लीनिकल आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (38 / 2009B02 और 470 / 2013B02 परियोजनाओं)।
परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear 1. अलगाव (PBMCs)
- 1,000 आइयू हेपरिन सल्फेट युक्त एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग venipuncture के माध्यम से एक स्वस्थ स्वयंसेवक से 50-100 मिलीग्राम ले लो और रक्त एक पतला: पीबीएस (पीएच = 7.2) के साथ 2।
- 15 मिलीलीटर रक्त को अलग समाधान पर पीबीएस समाधान ऐसे Biocoll के रूप में (घ = 1.077 ग्राम / एमएल) के एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब: ध्यान से रक्त का 35 मिलीलीटर परत। आरटी पर 800 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
नोट: ब्रेक इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। - एक विंदुक के साथ लिम्फोसाईटिक परत की कोशिकाओं को इकट्ठा करने और कम से कम 50 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धो (; 400 XG पर 12 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज)। एक विंदुक के साथ centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें।
- Lyse निलंबित और incub द्वारा एरिथ्रोसाइट्स शेष2-4 मिनट के लिए एक hypotonic बफर समाधान के 1-5 मिलीलीटर के साथ लिम्फोसाईटिक अंश ating।
नोट: जोखिम और बफर lysing की मात्रा की अवधि का इस्तेमाल किया lysing बफर पर और लिम्फोसाइट अंश में छोड़ा लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करती है। - 12 मिनट के लिए 250 XG पर पीबीएस (1:10) के साथ कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज पतला और बाद में resuspend और 12 मिनट के लिए 300 XG पर 10 मिलीलीटर पीबीएस में एक बार सेल गोली धो लें।
- पीबीएस में लिम्फोसाइट Resuspend और Trypan नीले समाधान का उपयोग कर एक Neubauer गिनती चैम्बर में कोशिकाओं की गिनती।
नोट: आमतौर पर,> 1 एक्स 10 8 लिम्फोसाइट 100 मिलीलीटर से प्राप्त कर रहे हैं हौसले परिधीय रक्त खींचा।
Vδ1 टी कोशिकाओं की 2. अलगाव
- Vδ1 सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्ति को निर्धारित करने के लिए एक प्रारंभिक FACS के लिए <1 एक्स 10 6 पृथक लिम्फोसाइट ले लो।
नोट: इस टी सेल इकाई की जनसंख्या के आकार व्यक्तियों और उनके immunologic स्थिति के अनुसार के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। िटिपकसहयोगी, टी कोशिकाओं के बारे में 1% Vδ1 + और Vδ1 + कोशिकाओं के बारे में 1-5% कर रहे हैं सीडी 4+ हैं।- पीबीएस 2% एफसीएस और 5 मिमी EDTA युक्त होते हैं जो 1 मिलीलीटर FACS बफर के साथ कोशिकाओं पतला। 2 मिनट के लिए 660 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला छानना। के बारे में 100 μl FACS बफर के भाटा मात्रा बाद में धुंधला के लिए पर्याप्त है। संक्षेप में भंवर और 5 μl FACS धुंधला की वृद्धि की विशिष्टता के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए अभिकर्मक एफसी रोकने के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
- एफसी अवरुद्ध अभिकर्मक को हटाने के बिना कोशिकाओं को सीधे मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ें। , सीडी 8 (1: 200) और TCRαβ (1:25): Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), सीडी 4 (200 1) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग करना सुनिश्चित करें। इसी इम्युनोग्लोबुलिन आइसोटाइप साथ निर्धारण नियंत्रण तैयार करें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
- (2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज; 660 XG पर) 1 मिलीलीटर FACS बफर में कोशिकाओं को धो लें, supern छाननाatant और शेष बफर मात्रा में FACS के अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें।
- 12 मिनट के लिए centrifugation द्वारा (FACS विश्लेषण में इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं) कोशिकाओं pelletize; 300 ग्राम पर; 8 डिग्री सेल्सियस। तैरनेवाला निकालें और 1 10 x 7 कोशिकाओं प्रति 60 μl एमएसीएस बफर pelletin सेल resuspend। 1 10 x 7 कोशिकाओं प्रति 20 μl एफसी अवरुद्ध अभिकर्मक जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- सीधे कोशिकाओं को एक 10 x 7 कोशिकाओं प्रति 10 μl FITC संयुग्मित विरोधी मानव Vδ1 एंटीबॉडी जोड़ें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए सेते हैं।
- 14 मिलीलीटर एमएसीएस-बफर का उपयोग कोशिकाओं को धो लें (12 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, 300 ग्राम, 8 डिग्री सेल्सियस)। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1x10 7 कोशिकाओं प्रति 80 μl एमएसीएस बफर में कोशिकाओं resuspend।
- 1-2 x 10 5 कोशिकाओं ले लो और FACS विश्लेषण द्वारा लेबलिंग के सत्यापन के लिए 100 μl FACS बफर में उन्हें पतला। आगे कोई additives के इस कदम के लिए आवश्यक हैं। एक suffi है कि वहाँ सुनिश्चित करेंVδ1 के लिए चमक में दक्ष अंतर - और Vδ1 + कोशिकाओं। इस मामले में ऐसा नहीं है, तो दोहराने) 2.3) और 2.4 कदम।
- शेष कोशिकाओं को एक 10 x 7 कोशिकाओं प्रति 20 μl विरोधी FITC microbeads जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं। इसके बाद, (300 XG पर 12 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, 8 डिग्री सेल्सियस) में कम से कम 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर का उपयोग कोशिकाओं को धो लें।
- Centrifugation के दौरान, 500 μl एमएसीएस बफर के साथ एक चुंबक में रखा पूर्व ठंडा चुंबकीय स्तंभ संतुलित करना।
- (सेल नंबर से अधिक 1 एक्स 10 8 के लिए इस मात्रा के हिसाब से ऊपर पैमाने पर) 500 μl एमएसीएस बफर में कोशिकाओं Resuspend और स्तंभ पर ध्यान कोशिकाओं लागू होते हैं। Vδ1 युक्त प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए - कोशिकाओं।
- 500 μl एमएसीएस बफर के साथ स्तंभ में तीन बार धोएं और एक ही ट्यूब में फिर से प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। जलाशय स्तंभ पर बफर लागू करने से पहले खाली होना चाहिए कि ध्यान दें।
- चुंबकीय डिवाइस से स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह। जल्दी मजबूती स्तंभ में सवार धक्का द्वारा 1 मिलीलीटर एमएसीएस बफर के साथ स्तंभ फ्लश। एक ट्यूब में eluate लीजिए।
नोट:> 98% की शुद्धता को प्राप्त करने के क्रम में, यह आमतौर पर दोहराने के लिए आवश्यक है एक दूसरे स्तंभ के साथ) 2.7-2.9 कदम। - (2.1.2 देखें) पहले की तरह ही एंटीबॉडी पैनल के साथ FACS विश्लेषण 18 से कोशिकाओं की शुद्धता को सत्यापित करने और कोशिकाओं की गिनती।
Vδ1CD4 + टी कोशिकाओं की 3. अलगाव
- > 30 सेकंड के लिए एक भंवर के साथ सीडी 4 मोतियों की 25 μl Resuspend। 1 मिनट के लिए एक चुंबक में ट्यूब डाल द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 1 मिलीलीटर एमएसीएस बफर में मोती (निर्माता के रूप में चित्रित न्यूनतम राशि) को धो लें। एक छोटे पैमाने पर पिपेट (200 μl) के साथ सावधानी से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एमएसीएस बफर के मूल मात्रा में मोती resuspend।
- 1 के लिए Vδ1 + कोशिकाओं (सेंट्रीफ्यूज pelletize2 मिनट; और) 300 XG पर सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और 500 μl एमएसीएस बफर में सभी Vδ1 + कोशिकाओं resuspend और मोती युक्त ट्यूब के लिए उन्हें जोड़ने। सख्ती मिश्रण और (एक रोटेटर में, उदाहरण के लिए) लगातार झुकने के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
- 2 मिनट के लिए एक चुंबक में कोशिकाओं से युक्त ट्यूब रखें। ढक्कन में कोई अवशेष देखते हैं कि सुनिश्चित करें।
नोट: सीडी 4 + कोशिकाओं चुंबकीय मोती बाध्य और चुंबक का सामना करना पड़ ट्यूब की ओर करने के लिए संलग्न कर लिया जाएगा। - एक छोटे पैमाने पर पिपेट का उपयोग Vδ1 + कोशिकाओं - ध्यान चुंबकीय उपकरण के अंदर ट्यूब रखते हुए ढक्कन खोलने के लिए और सीडी 4 में शामिल है जो सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। एक अलग ट्यूब में Vδ1 + कोशिकाओं और आबादी से सीडी 4 कोशिकाओं या मोती शेष संभवतः से बचने के लिए फिर से चुंबक में इस ट्यूब जगह - सीडी 4 रखें।
- सीडी 4 धो - कोशिकाओं 5 मिलीलीटर एमएसीएस बफर में (सेंट्रीफ्यूज 12 मिनट के लिए, 300 XG पर) एकएन डी 100 μl मीडिया प्रति 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में resuspend। सीडी 4 - कोशिकाओं को आसानी से (4.2) नीचे दी गई शर्तों के तहत खेती की जा सकती।
- चुंबकीय क्षेत्र के बाहर सीडी 4 + सेल लक्ष्य के साथ ट्यूब की जगह 500 μl एमएसीएस बफर में कोशिकाओं resuspend और चुंबकीय उपकरण में वापस डाल दिया। दोहराएँ एक उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए दो बार 3.3-3.5 कदम। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें
- 100 μl संस्कृति मीडिया में सीडी 4 + कोशिकाओं (1640 RPMI, 10% एफसीएस, 1% एल Glutamine, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) Resuspend और एक मनका detaching समाधान के 10 μl जोड़ें। लगातार झुकने (जैसे, एक रोटेटर में) के साथ 45 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- 1 मिनट के लिए एक चुंबक में कोशिकाओं की जगह। ध्यान से एक छोटे पैमाने पर पिपेट का उपयोग मनका-मुक्त Vδ1 + सीडी 4 + कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
- चुंबक के बाहर, 100 μl संस्कृति मीडिया और दोहराने के साथ मोती resuspendसीडी 4 + कोशिकाओं की उच्च सेल नंबर प्राप्त करने के लिए दो बार 3.6 और 3.7 कदम।
- कोशिकाओं pelletize (12 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र) और pipetting द्वारा पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ताजा, पूर्व गर्म मीडिया में कोशिकाओं Resuspend और उन्हें गिनती। 2.1.1-2.1.3 चरणों में दर्शाया FACS विश्लेषण द्वारा Vδ1 + सीडी 4 + कोशिकाओं की शुद्धता की जांच करना।
लिमिटेड कमजोर पड़ने से 4. एकल सेल क्लोनिंग
- 1.1-1.6 में दर्शाया के रूप में एक अल्लोजीनिक दाता से परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) अलग।
- Γ विकिरण का उपयोग कर 25 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में 80 Gy के साथ 2.5 10 x 7 अल्लोजीनिक PBMCs चमकाना।
- 96 अच्छी तरह यू-फार्म प्लेटों में 5 एक्स 10 4 फीडर उन्हें विकिरणित फीडर कोशिकाओं को आईएल -2 (200 यू / एमएल), आईएल -7 (20 एनजी / एमएल) और पीएचए (2 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें और वितरित अच्छी तरह से प्रति 50 μl में कोशिकाओं।
- 50 μl प्रति 0.3 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए Vδ1 + सीडी 4 + कोशिकाओं पतला। Pipetते प्रत्येक अच्छी तरह से विकिरणित कोशिकाओं और साइटोकिन्स को शरण देने के लिए सेल के समाधान के 50 μl।
नोट: इस प्रकार, साइटोकिन्स 100 यू / एमएल आईएल -2, 10 एनजी / एमएल आईएल 7 और 1 माइक्रोग्राम / एमएल पीएचए के अंतिम एकाग्रता के लिए पतला कर रहे हैं। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified माहौल में एक मशीन में 96 अच्छी तरह प्लेटें सेते हैं।- वैकल्पिक रूप से, क्लोन के रूप में एक ही संस्कृति की शर्तों के तहत थोक संस्कृति के रूप में Vδ1 + सीडी 4 + कोशिकाओं शुद्ध शेष खेती।
- साइटोकिन्स और ताजा मीडिया के साथ हर 3-4 दिनों कोशिकाओं की आपूर्ति। इस के लिए, pipetting द्वारा 50 μl ताजा माध्यम के साथ कुओं में मध्यम के आदान प्रदान के आधा। हर पूरकता को साइटोकिन्स का 2 गुना एकाग्रता जोड़ें। भोजन की अच्छी तरह से हर दूसरे दौर प्रति 5x10 4 विकिरणित फीडर कोशिकाओं जोड़ें।
- संस्कृति के माध्यम से और फार्म कालोनियों का रंग बदलने के इस तरह वे metabolize के रूप में पहला क्लोन 3-4 सप्ताह के बाद दिखाई देने लगते हैं पालन और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना।
नोट: फर के लिएवहाँ की खेती, अच्छी तरह से क्लोन resuspend और उन्हें 96 अच्छी तरह प्लेटें अलग करने के लिए हस्तांतरण। 2.1.1-2.1.3 में संकेत के रूप FACS के माध्यम से कोशिकाओं का विश्लेषण। इन शर्तों के तहत रखा क्लोन अंततः αβTCR को Vδ1 से उनकी TCR बदल सकता है। इस transdifferentiation के लिए समय बिंदु क्लोन करने के क्लोन से भिन्न होता है।
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Representative Results
चित्रा 1 विभिन्न चरणों और परिधीय रक्त से Vδ1 टी कोशिकाओं के अलगाव के परिणाम को दर्शाया गया है। चित्रा 1 ए CD3 + लिम्फोसाइट में Vδ1 + कोशिकाओं का एक विशिष्ट वितरण, साथ ही Vδ1 + आबादी के सह रिसेप्टर अभिव्यक्ति से पता चलता है। इस दाता में, Vδ1 + कोशिकाओं (लाल) की आवृत्ति कुल लिम्फोसाइट गिनती के 2.3% है और Vδ1 + लिम्फोसाइटों के सीडी 4 अभिव्यक्ति (हरा) 2.6% है। कुल मिलाकर, अलगाव के लिए लक्ष्य की आबादी इस दाता में कुल लिम्फोसाइटों के 0.06% का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 1 बी चुंबकीय लेबलिंग करने के लिए आगे बढ़ने से पहले Vδ1 + कोशिकाओं के लिए एक इष्टतम धुंधला तीव्रता से पता चलता है। Vδ1 + कोशिकाओं कुशलता लेबल और magn से अलग किया जा सकता है, ताकि प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला स्पष्ट रूप से अलग Vδ1 नकारात्मक और सकारात्मक Vδ1 आबादी में परिणाम चाहिएetic मोती। चित्रा 1C FACS विश्लेषण से अलगाव की प्रक्रिया के बाद Vδ1 + कोशिकाओं को दर्शाया गया है। Vδ1 + की पवित्रता CD3 + कोशिकाओं की आमतौर पर> 99% है। शुद्धता बढ़ाने के लिए, अलग कक्षों में एक दूसरे अलगाव स्तंभ पर लागू कर रहे हैं। काफी सेल नुकसान में यह परिणाम हालांकि इस संभावित TCRαβ + सीडी 4 + कोशिकाओं contaminating की मात्रात्मक उन्मूलन के लिए सुराग कदम।
सीडी 4 + अलगाव के परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है। वजह से कोशिकाओं CD4 + कोशिकाओं के दृष्टिकोण पवित्रता क्लोनिंग एक सीमित कमजोर पड़ने एकल कोशिका में विस्तार कर रहे हैं के बाद से सीडी 4 + Vδ1 + कोशिकाओं, और कम से कम 100% कर सकते हैं की कम संख्या के लिए सहन किया। यहाँ दिखाया प्रयोग, Vδ1 + सीडी 4 + कोशिकाओं की पवित्रता में था के बारे में 90% (2A चित्रा, सही धब्बा) और बाद में एकल कोशिका क्लोनिंग 60 से अधिक Vδ1 में हुई+ सीडी 4+ टी सेल क्लोन। इसके विपरीत, Vδ1 + सीडी 4 में - अंश कोई सीडी 4 + कोशिकाओं को इस अलगाव रणनीति की दक्षता पर प्रकाश डाला गया है, जो (चित्रा 2 बी), बने रहे। ध्यान से, सीडी 4 + कोशिकाओं (नीला) सीडी 4 की तुलना में एक अलग पहचाना निचले स्तर पर Vδ1 व्यक्त - कोशिकाओं (लाल) (2A चित्रा, दोनों दाग)। इस प्रकार, Vδ1 + कोशिकाओं का धुंधला अत्यधिक-रूप में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए Vδ1 + टी सेल पूल के भीतर सीडी 4 + अंश की पर्याप्त लेबलिंग और सफल अलगाव होना चाहिए।
चित्रा 3 में, एक उभरती हुई क्लोन के विशिष्ट लक्षण प्रारूप प्रस्तुत किया है। TCR एक Vδ1 और एक Vγ9 चेन और प्रतिरूप कोशिकाओं के CD3 और सीडी 4। चित्रा 3 बी प्रस्तुत तकनीक के साथ अलग से एक क्लोन की transdifferentiation की प्रक्रिया को दर्शाया गया है अभिव्यक्त बना है। Transdifferentiation downregulati शामिलएक αβTCR की नए सिरे से अभिव्यक्ति द्वारा paralleled है जो एक कम अभिव्यक्ति स्तर तक V'1 श्रृंखला की पर। यह अंततः एकल सकारात्मक αβTCR व्यक्त टी कोशिकाओं को जन्म देता है जो एक क्षणिक TCR-डबल सकारात्मक फेनोटाइप की ओर जाता है। सह रिसेप्टर अभिव्यक्ति भी transdifferentiation के दौरान बदल सकते हैं। Thymocytes के लिए इसी प्रकार, एक सीडी 4 + 8 + डीपी फेनोटाइप अंततः सपा सीडी 4+ या सीडी 8 + αβ टी कोशिकाओं या तो में विकसित करता है, जो हो सकता है। यहाँ प्रस्तुत संस्कृति शर्तों के तहत, transdifferentiation αβTCR में उनके Vδ1 + TCR बदल एक दुर्लभ घटना केवल एक 50 क्लोन से बाहर है।
चित्रा 1. FACS परिधीय रक्त से वी δ1 टी कोशिकाओं के अलगाव की प्रक्रिया के सभी चरणों की निगरानी का विश्लेषण करती है। (ए </ परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों और उनके सह-रिसेप्टर अभिव्यक्ति की CD3 + कोशिकाओं में Vδ1 + कोशिकाओं (लाल की मजबूत>) वितरण)। सीडी 4 + Vδ1 + कोशिकाओं नीला (चक्र) में संकेत कर रहे हैं। चुंबकीय लेबलिंग करने के लिए आगे बढ़ने से पहले Vδ1 अंश (बी) धुंधला हो जाना। Vδ1 अलगाव के बाद सकारात्मक अंश की कोशिकाओं + (सी) FACS विश्लेषण। नंबर gated कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
। अंश - चित्रा 2. FACS वी δ का विश्लेषण करती है 1 सीडी 4 + (ए) सीडी 4 + अंश और (बी) के सीडी 4 आइसोलेट्ससीडी 4 + सेल अलगाव के बाद। नंबर gated कोशिकाओं का प्रतिशत संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सही पता लगाने के बाद एक क्लोन की चित्रा 3. प्ररूपी विश्लेषण। (ए) एक हौसले से पृथक क्लोन की TCR संरचना और सह रिसेप्टर अभिव्यक्ति। Vδ1 और Vγ9 TCR CD3 और सीडी 4 के साथ सह व्यक्त किया है। एक सीडी 4 + Vδ1 + क्लोन में transdifferentiation (बी) प्रक्रिया। TCR अभिव्यक्ति (ऊपर), और सह रिसेप्टर अभिव्यक्ति (नीचे) 18 के परिवर्तन की बदलें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इसके सकारात्मक चुंबकीय सेल अलगाव के लिए Vδ1 और सीडी 4: एक दुर्लभ (टी) सेल इकाई के phenotype, जीव विज्ञान और समारोह का अध्ययन करने के लिए, अर्थात् Vδ1 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं, हम दो मार्कर का इस्तेमाल किया। सीडी 4 monocytes और वृक्ष के समान कोशिकाओं पर एक निचले स्तर पर, टी सहायक कोशिकाओं पर व्यक्त की, और hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं पर एक बहुत कम स्तर पर है, जबकि Vδ1, एक अनाथ रिसेप्टर है।
उच्च शुद्धता में कोशिकाओं के संवर्धन और चयन के लिए तकनीक प्रतिदीप्ति सेल छँटाई (FACS), फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आधार पर उप आबादी में कोशिकाओं की आबादी को अलग करती है कि एक तकनीक सक्रिय शामिल हैं। Fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग दाग कोशिकाओं एक और जो fluorophore (s) वे बाध्य है के आधार पर एक से अलग किया जा सकता है। Sorters केवल आवश्यकता है खुद छँटाई जाता है तो उपयोगी है, जो% 19 98 के करीब पवित्रता, प्राप्त कर सकते हैं। इस तकनीक की कमियां हल कोशिकाओं सेल छठी में कमी बताते हैं कि शामिलक्षमता है, और हमारे लक्ष्य भी जनसंख्या transdifferention के लिए एक कम क्षमता में। छंटाई के बाद एक कम सेल व्यवहार्यता बाल काटना बलों और FACS कोशिकाओं पर लगाता है कि हाइड्रोडायनामिक तनाव के कारण होने की धारणा है। इसके अलावा, व्यवहार्य और बाद में संस्कृति के लिए प्रदूषण को बिना कोशिकाओं रखने के लिए, प्रयोग प्रबंधन करने के लिए कठिन है जो सड़न रोकनेवाला बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, FACS छँटाई छँटाई के लिए कोशिकाओं की उच्च संख्या की सिफारिश की।
अलगाव किट प्रत्यक्ष चुंबकीय लेबलिंग और कई सतह मार्कर के अनुसार कोशिकाओं की छंटाई के लिए कई कंपनियों से विकसित किया गया है। उनकी रणनीति या तो enzymatically या competitively जो यह बाध्य किया गया था करने के लिए संरचना से चुंबकीय लेबल हटा जो एक रिलीज अभिकर्मक, का उपयोग करके पहले प्रकार के बाद कोशिकाओं से चुंबकीय लेबल हटाने पर निर्भर करता है। यह ब्याज था की एक और सतह मार्कर के लिए एक दूसरे चुंबकीय लेबलिंग और कोशिकाओं की जुदाई की अनुमति देता हैटी चुंबकीय मोतियों के साथ प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से या तो लेबलिंग का उपयोग करके हासिल की है। लेबल का हटाया विस्तारित समय की अवधि एक रसायन के लिए जोखिम और दोहराया धोने कदम के लिए (2-8 डिग्री सेल्सियस पर, बर्फ पर) कम तापमान पर काम कर रहा है की सिफारिश की। दूसरा पैरामीटर जुदाई का लक्ष्य कोशिकाओं अवशिष्ट चुंबकीय लेबल कोशिकाओं ofany को हटाने के लिए भी एक दूसरे दौर चयन (पहली जुदाई के बाद सकारात्मक अंश में <10% लक्ष्य कोशिकाओं) के बाद एक कम एकाग्रता में मौजूद हैं, तो जरूरी है। यह प्रक्रिया है-इसके अलावा लक्ष्य कोशिकाओं का एक बड़ा नुकसान होने की वजह से बार-बार धोने कदम-से कारण यांत्रिक और शारीरिक तनाव को सेलुलर क्षति और समारोह के नुकसान उत्प्रेरण के लिए उच्च जोखिम के लिए। छँटाई FACS के साथ तुलना में हालांकि सेल की तैयारी बाँझ रहते हैं और छोटे सेल नंबर हल किया जा सकता है।
हम आगे बढ़ाने की रणनीति है कि दो लगातार निष्पादित सकारात्मक चयन को जोड़ती है, अभी तक पहले लेबल को हटाने के मीटर के रूप में की आवश्यकता नहीं हैagnetic लेबल के कई लॉग चरणों से उनके चुंबकीय बलों के परिमाण में मतभेद है। मनका प्रकार चुंबकीय लेबल पहले विरोधी fluorochrome 50 एनएम के एक व्यास के साथ, छोटा है, वहीं दूसरी विरोधी fluorochrome इस प्रकार पहली चुंबकीय लेबल 20 की मात्रा / ताकत करने से अधिक, मनका प्रकार के उपाय 1 माइक्रोन 4.5 चुंबकीय लेबल 90 गुना। इसके अतिरिक्त, दूसरा सकारात्मक तरह सेल तनाव को छोड़ देता है कोशिकाओं लेबल की कोशिकाओं शीशी की दीवार से जुड़े होते हैं, इसलिए है कि एक चुंबकीय उपकरण में डाल दिया जाता है कि एक 1.5 मिलीलीटर की शीशी में रहने के रूप में, कि चुंबकीय स्तंभ प्रतिधारण / रिलीज के साथ जुड़ा हुआ है। कपड़े धोने का कार्यक्रम एक छोटे पैमाने पर रखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल सेल नुकसान को कम करता है और कोशिकाओं को कम हेरफेर का अनुभव है और multisort अलगाव किट सिस्टम का उपयोग कर प्रोटोकॉल से अधिक तेजी से अलगाव की प्रक्रिया से गुजरती हैं के बाद से सेल व्यवहार्यता बढ़ जाती है सविस्तार।
नतीजतन, इस प्रोटोकॉल भी कोशिकाओं की एक छोटी संख्या और एक अन्य लाभ यह है कि अलग करने के लिए अनुमति देता है: हल कोशिकाओं काएं रहनाप्रक्रिया के दौरान चिढ़ाना। सीमित कमजोर पड़ने का उपयोग करते हुए इसके बाद क्लोनिंग के प्रयोगों यहां अलग कक्षों, के व्यक्तिगत सदस्यों के कुशल विस्तार बहुत दुर्लभ Vδ1 + सीडी 4 + γδ टी सेल इकाई 18 अनुमति देता है। हल कोशिकाओं उत्कृष्ट व्यवहार्यता और clonogenicity दिखाने के लिए और पूरी तरह से कार्यशील रहते हैं।
भविष्य अनुप्रयोगों के लिए, मात्रात्मक चयन और सफलतापूर्वक हौसले से तैयार की गई परिधीय रक्त सहित विभिन्न मानव स्रोतों से छोटे टी सेल संस्थाओं को शुद्ध करने के लिए इस रणनीति का प्रयोग, (जुटाए) leukapheresis उत्पादों, अलग है कि चुंबकीय लेबल का उपयोग दो लगातार प्रदर्शन सकारात्मक चयन के संयोजन से गर्भनाल रक्त और अस्थि मज्जा उनके चुंबकीय बलों में परिमाण और इस तरह प्रतिधारण क्षमता से।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
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