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मानव peritoneal गुहा की एक Organotypic संस्कृति में डिम्बग्रंथि के कैंसर के प्रसार के प्रारंभिक चरणों मॉडलिंग

Published: December 31, 2015 doi: 10.3791/53541
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

Protocol

वर्णित सभी अनुसंधान प्रोटोकॉल शिकागो संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय (आईआरबी) द्वारा समीक्षा की गई है। अवगत सहमति सर्जरी से पहले प्रत्येक रोगी से प्राप्त हुई थी और अध्ययन शिकागो आईआरबी के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। सुरक्षा के लिए मानव ऊतक से निपटने और कोशिकाओं को दूषित होने का खतरा कम करने के लिए जब एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट टाइप 2 और दस्ताने का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

प्राथमिक untransformed stromal कोशिकाओं के 1. अलगाव और संस्कृति

  1. मानव ऊतक संग्रह और तैयारी।
    1. एक पेट की सर्जरी के दौरान हटा मानव वपा, 2 सेमी 3, के नमूने प्राप्त है, और तुरंत आरटी फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (2A चित्रा) में ऊतक विसर्जित कर दिया। एक्स 2 सेमी वपा 3 सेमी का एक टुकड़ा आम तौर पर 1 लाख प्राथमिक मानव मेसोथेलियल कोशिकाओं (एचपीएमसी) और 200,000 प्राथमिक मानव fibroblasts या सामान्य omental fibroblasts (एनओएफ) अर्जित करता है।
    2. ऊतक 3 के लिए 0.5 XG पर में डूब गया था पीबीएस स्पिनमिनट के रूप में जल्द से जल्द करने के बाद संग्रह (<2 पीबीएस में मानव संसाधन) और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में नए सिरे से 20 मिलीलीटर पीबीएस के लिए ऊतक हस्तांतरण। एक 15 सेमी व्यास, बाँझ संस्कृति पकवान (चित्रा 2 बी) में नलियां साथ नख़रेबाज़ द्वारा 5 मिमी 3 टुकड़ों में ऊतक को काटा।
  2. प्राथमिक मानव मेसोथेलियल सेल अलगाव 8
    1. एचपीएमसी को अलग-थलग करने के लिए, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण और ठोस टुकड़े शीर्ष (चित्रा -2 सी एंड डी) के लिए फ्लोट करने के लिए 1 मिनट इंतज़ार करो। एचपीएमसी और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) तल पर तरल में उपस्थित रहेंगे। ट्यूब के नीचे से और एक नया शंक्वाकार ट्यूब में तरल निकालने के लिए एक pipet का प्रयोग करें। 3 मिनट के लिए 0.5 XG पर तरल नीचे स्पिन और एचपीएमसी / आरबीसी गोली से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
      1. कीमा बनाया हुआ ऊतक को 20 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ने ऊतक, नीचे स्पिन, वृद्धि एक विंदुक के साथ और एचपीएमसी / आरबीसी ट्यूब में नीचे से तरल निकालने के लिए अनुमति देते हैं और निकालें: प्रक्रिया तीन बार दोहराएँसतह पर तैरनेवाला। सभी स्पिन पूरा कर रहे हैं और सतह पर तैरनेवाला aspirated है, के बाद गोली एचपीएमसी और आरबीसी में शामिल होंगे।
    2. प्लेट 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 1% सदस्य विटामिन [93 मिलीग्राम / एल], 1% सदस्य अनावश्यक अमीनो एसिड [81.4 के साथ पूर्ण विकास मीडिया के 15 एमएल (DMEM में एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में गोली से सभी कोशिकाओं मिलीग्राम / एल], 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन [कलम strep, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन])।
    3. अतिरिक्त HPMCs को अलग-थलग करने के लिए एक उच्च माध्यमिक पीबीएस धोने प्रदर्शन करते हैं।
      1. ऊतक ऊपर फ्लोट करने के लिए माध्यमिक पीबीएस धोने के लिए, 200 आरपीएम, पीबीएस के 20 मिलीलीटर में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शेष ठोस ऊतक हिला, तो 1 मिनट इंतज़ार करो। 3 मिनट के लिए 0.5 XG पर अपकेंद्रित्र, एक नया ट्यूब में ट्यूब के नीचे से तरल निकालें, और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
      2. पूर्ण विकास मीडिया के 15 मिलीलीटर में एक अलग 75 सेमी 2 फ्लास्क में धो माध्यमिक पीबीएस से सभी एचपीएमसी / आरबीसी प्लेट।
    4. कोई r अलग करने के लिएमात्रा से पीबीएस समाधान: 1 0.25% trypsin 25 मिमी EDTA: एचपीएमसी emaining, एक 1 के 20 मिलीलीटर में 10 मिनट के लिए, 200 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस डिग्री कीमा बनाया हुआ ऊतक हिला। ऊतक, वृद्धि ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में, और 0.5 GX 3 मिनट पर नीचे स्पिन करने की अनुमति दें।
      1. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पूर्ण विकास मीडिया के 15 मिलीलीटर में एक अलग 75 सेमी 2 फ्लास्क में सभी एचपीएमसी / आरबीसी थाली।
    5. संस्कृति एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर चढ़ाया कोशिकाओं। खर्च मीडिया को हटाने के बिना दिन 3 और 5 पर पूर्ण विकास मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़कर फ़ीड चढ़ाया कोशिकाओं। एचपीएमसी बंटवारे से पहले 5-7 दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है।
      1. मूल phenotype के dedifferentiation और संशोधन को कम से कम करने के लिए सभी प्रयोगों में (बीतने के 2 तक) कम बीतने एचपीएमसी का प्रयोग करें। चरण विपरीत capabilitie के साथ प्लास्टिक अंतर हस्तक्षेप विपरीत क्षमताओं या 4-20x उद्देश्य के साथ एक 20x उद्देश्य के साथ बेहतर एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करेंकोशिकाओं के सभी छवियों को लेने के लिए (माइक्रोस्कोप पर चरण विपरीत फिल्टर), और 3,3'-diaminobenzidine (थपका) धुंधला प्रतिरक्षाऊतकरसायन का विश्लेषण करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र में एक 10x उद्देश्य ()।
    6. एचपीएमसी cuboidal पुष्टि करते हैं कि और immunohistochemistry 8 (चित्रा 3 ए, सी, ई) के प्रदर्शन से cytokeratin 8 और vimentin व्यक्त करते हैं।
  3. एनओएफ अलगाव 8
    1. 1: 100x कलम strep का एक मिश्रण एक 1: के संयोजन से कोलैजिनेज़ प्रकार III समाधान (10x) के एक शेयर के 10 मिलीलीटर की तैयारी कोलैजिनेज़ प्रकार III की 1,500 इकाइयों गतिविधि / एमएल: पीबीएस में hyaluronidase की 714 इकाइयों गतिविधि / मिलीलीटर।
    2. 1% सदस्य विटामिन [93 मिलीग्राम / एल] के साथ सीरम मुक्त मीडिया में पतला 10x कोलैजिनेज़ प्रकार III समाधान के 10 एमएल (DMEM में 6 घंटे के लिए 200 rpm पर एचपीएमसी अलगाव के बाद बनी हुई है कि कीमा वपा ऊतक, 37 डिग्री सेल्सियस से मिलाओ, 1% सदस्य अनावश्यक अमीनो एसिड [81.4 मिलीग्राम / एल], 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन [कलम strep, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन])। पचा ऊतक अपारदर्शी लग जाएगा और कुछ रेशेदार मलबे (चित्रा 2 ई) हो सकता है।
    3. समाधान युक्त एनओएफ कोशिकाओं अपकेंद्रित्र आरटी पर 3 मिनट के लिए 0.5 XG पर निलंबन में, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और पूर्ण विकास मीडिया के 13 मिलीलीटर में एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में गोली थाली।
    4. पुराने मीडिया निकालें और 24 घंटे के बाद नए सिरे से पूर्ण विकास मीडिया के 15 मिलीलीटर के साथ बदलें। एनओएफ बंटवारे से पहले 1-3 दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता। कोशिकाओं confluency तक पहुँचने जब एनओएफ का नोट प्रसार के लिए संघर्ष करेंगे।
    5. प्राथमिक मानव fibroblasts फ्लैट, लम्बी कोशिकाओं पुष्टि करते हैं कि और vimentin व्यक्त करते हैं लेकिन इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री 8 प्रदर्शन से 8 Cytokeratin नहीं (चित्रा 3 बी, डी, एफ)। Dedifferentiation कम करने के लिए (आदर्श पारित होने के 3 से पहले) के प्रयोगों के लिए कम बीतने एनओएफ का प्रयोग करें और मूल phenotype के संशोधन। कोशिकाओं के सभी चरण छवियों को लेने के लिए प्लास्टिक डीआईसी क्षमताओं के साथ एक 20x उद्देश्य के साथ एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करें,और उज्ज्वल क्षेत्र में एक 10x उद्देश्य प्रतिरक्षाऊतकरसायन थपका धुंधला विश्लेषण करने के लिए।

2. Organotypic संस्कृति 8 चढ़ाना

  1. अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए 3 मिलीलीटर 0.25% की trypsin / 25 मिमी EDTA के द्वारा पीछा पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ rinsing द्वारा 75 सेमी संस्कृति कुप्पी से रिलीज एनओएफ। पूर्ण विकास मीडिया के कम से कम 3 बार की मात्रा के साथ trypsin बेअसर।
  2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में trypsinized कोशिकाओं स्थानांतरण और 0.5 GX 3 मिनट पर नीचे स्पिन। तैरनेवाला निकालें और पूर्ण विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में वापस कोशिकाओं को ले आओ। संस्कृति कुप्पी से बरामद कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक सेल काउंटर का प्रयोग करें।
  3. एक 96 अच्छी तरह से, स्पष्ट तली, काले थाली पर 100 μl प्रति 2,000-4,000 एनओएफ थाली करने के लिए पूर्ण विकास मीडिया की उचित मात्रा में कोशिकाओं पतला। चढ़ाना पहले सेल मिश्रण करने के लिए चूहे की पूंछ कोलेजन मैं के 0.5 माइक्रोग्राम / 100 μl जोड़ें। चलो कोशिकाओं को कम से कम 4 घंटे के लिए एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर बैठते हैं, या कोशिकाओं तकप्लेट सतह का पालन करने के लिए।
  4. कदम 2.1 और 2.2 में वर्णित एक ही तरीके का उपयोग संस्कृति कुप्पी से एचपीएमसी रिलीज। पूर्ण विकास मीडिया की उचित मात्रा में कोशिकाओं को पहले से ही 96 अच्छी तरह प्लेटों में कोलेजन मैं के साथ चढ़ाया एनओएफ की चोटी पर 50 μl प्रति 10,000-20,000 एचपीएमसी थाली करने के लिए पतला। कोशिकाओं के प्रयोगों की शुरुआत से पहले कम से कम 18 घंटे के लिए एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर बैठते हैं।
  5. पूर्ण विकास मीडिया में HeyA8 या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं -expressing संस्कृति हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)। HeyA8 या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं fluorescently copepod cGFP (pCDH-सीएमवी एमसीएस EF1) व्यक्त एक lentiviral वेक्टर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। HeyA8 या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करने के दिन (लघुगणक विकास के चरण) पर 80-90% मिला हुआ होना चाहिए। संस्कृति की थाली से कोशिकाओं को छोड़ दें और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए कदम 2.1-2.2 में वर्णित एक ही तरीके का उपयोग गिनती।
  6. डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को एक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए पूर्ण विकास मीडिया में ठीक करने की अनुमतिढक्कन के साथ शंक्वाकार ट्यूब शिथिल सील कर दिया।

3. आसंजन परख 8

  1. वसूली के बाद, 0.5 XG पर 3 मिनट के लिए कताई द्वारा या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को गोली और फिर सतह पर तैरनेवाला हटाने और 50,000 कोशिकाओं / 100 μl की एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए सीरम मुक्त मीडिया की उचित मात्रा में कोशिकाओं को कमजोर।
  2. खर्च की मीडिया को दूर करने के लिए एचपीएमसी / एनओएफ organotypic संस्कृतियों के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें पलटना, और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सीरम मुक्त मीडिया में कैंसर सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें। 4 घंटा 30 मिनट के लिए एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  3. मीडिया और गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली उलटें। ध्यान से और धीरे से अच्छी तरह से प्रत्येक में पीबीएस के 100 μl pipet, और फिर प्लेट पलटना कम शक्ति पर एक मल्टीचैनल pipet का प्रयोग करें। पीबीएस और एक बार धोने दोहराएँ।
  4. पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl 4% paraformaldehyde जोड़ने पलटना। प्लेट 20 मील लिए बैठने की अनुमतिएन कोशिकाओं को ठीक करने के लिए। 20 मिनट के बाद, प्लेट पलटना और 100 μl पीबीएस जोड़ने।
  5. कुओं की कुल प्रतिदीप्ति सूचना दी जा सकती है या कोशिकाओं की संख्या मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि ध्यान दें। मात्रा का ठहराव के लिए, 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में HeyA8 कोशिकाओं का उपयोग कर दो प्रतियों में पहली प्लेट एक मानक वक्र।
    1. नीचे 1 मिलियन कोशिकाओं कताई मीडिया को दूर करने, और उन्हें 20 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde में बैठने के लिए अनुमति देकर मानक वक्र बनाओ।
    2. स्पिन कोशिकाओं को फिर से और पीबीएस (ब्योरा कोशिकाओं 1 लाख / मिलीलीटर एकाग्रता पुष्टि करने के लिए) एमएल 1 में लाने के लिए। प्लेट 50,000, 40,000, 30,000, 20,000, 10,000, 5000, 1000, और अच्छी तरह से दो प्रतियों में से प्रत्येक में 0 कोशिकाओं, और अच्छी तरह से प्रत्येक में 50 μl के अंतिम कुल मात्रा के लिए पीबीएस जोड़ें।
  6. नीचे उच्च कुओं (मानक वक्र पर 50,000) स्केलिंग, एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक (उत्तेजना = 488 एनएम, उत्सर्जन = 528 एनएम) पर संस्कृति की थाली में पढ़ा। Organotyp का पालन कितने डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की गणना करने के लिए मानक वक्र का उपयोगप्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा -4 ए-सी) में आईसी संस्कृति।

4. प्रसार परख 10

  1. डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं को ठीक करने के बाद 1% FBS के साथ (DMEM 1% FBS के मीडिया की उचित मात्रा में कोशिकाओं को कमजोर तो 0.5 XG पर 3 मिनट के लिए कताई द्वारा गोली कोशिकाओं और, 1% सदस्य (कदम 2.5 और इसके बाद के संस्करण 2.6 देखें) विटामिन [93 मिलीग्राम / एल], 1% सदस्य अनावश्यक अमीनो एसिड [81.4 मिलीग्राम / एल], 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन [कलम strep, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन]) 4,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए / 150 μl।
  2. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एफबीएस मीडिया बिताया मीडिया को दूर, और 1% में कैंसर सेल निलंबन के 150 μl जोड़ने के लिए एचपीएमसी / एनओएफ organotypic संस्कृतियों के साथ 96 अच्छी तरह से थाली उलटें। 72 घंटे के लिए एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  3. नीचे रिश्तेदार प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए एक बार एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक एक दिन (उत्तेजना = 488 एनएम, उत्सर्जन = 528 एनएम) पर संस्कृति की थाली पढ़ाकोशिकाओं की। 48 घंटा (चित्रा 5 ए-सी) में मीडिया बदल रहा है, 96 घंटे के लिए परख जारी रखें। (प्लेट बेहतर है inverting) मीडिया बदल रहा है जब संस्कृति को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।

5. आक्रमण परख 8

  1. 3 डी संस्कृति चढ़ाना पहले, एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली डालने (8 माइक्रोन ताकना आकार) के लिए 200 μl पीबीएस में 7.5 माइक्रोग्राम चूहे की पूंछ कोलेजन मैं जोड़ने। थाली सेते हे / n, तो ध्यान से तुरंत कोलेजन लेपित सम्मिलित करता है (ऊपर चरण 2) पर एचपीएमसी / एनओएफ organotypic संस्कृति चढ़ाना पहले एक pipet के साथ पीबीएस को दूर करते हैं।
  2. 3.1 कदम के रूप में या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को तैयार करें। सम्मिलित करता है पर organotypic संस्कृतियों पर या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं की थाली के लिए, ध्यान से सम्मिलित करता है के ऊपर से अधिक मीडिया को दूर करने के लिए एक pipet का उपयोग करें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सीरम मुक्त मीडिया में या गर्भाशय के कैंसर सेल निलंबन के 100 μl जोड़ें।
  3. में कैंसर सेल प्रेरित करने के लिए अच्छी तरह से डालने के नीचे में पूर्ण विकास मीडिया के 750 μl जोड़ेंorganotypic संस्कृतियों में vasion। 24 घंटे के लिए एक humidified वातावरण में 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    नोट: organotypic संस्कृति डालने के पार और डालने के नीचे की ओर ही रहेगा आक्रमण कि डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं।
  4. एक खाली कुएं में डालने के लिए कदम तो, 24 घंटे के बाद, चिमटे से डालने समझ और संक्षेप में पीबीएस की एक बीकर में यह कुल्ला। 1 मिनट की कुल के लिए एक कपास झाड़ू के दोनों पक्षों के साथ प्रत्येक डालने के शीर्ष रगडें। जल्दी से अच्छी तरह से प्रत्येक में 750 μl 4% paraformaldehyde युक्त एक प्लेट में डालने जगह है। प्रत्येक डालने 750 μl पीबीएस के साथ भरा कुओं में सम्मिलित करता है स्थानांतरित करने से पहले 10 मिनट के लिए paraformaldehyde में बैठने की अनुमति दें।
  5. 2.5x बढ़ाई पर एक माइक्रोस्कोप के साथ आक्रमण की कोशिकाओं (सम्मिलित की तह तक पालन किया और फिक्स्ड) देखें। पूरे अच्छी तरह से देखने के क्षेत्र के अंदर है, परहेज, 10x करने के लिए बढ़ाई समायोजित करने और 5 चित्रों, अच्छी तरह से प्रत्येक चक्र में केंद्र के पास एक और 1 लेने के लिएकिनारों को भी बंद कर रहे हैं कि छवियों ले रही है। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक ही पैटर्न का पालन करें।
  6. उनके प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 6A-सी) में क्षेत्र के प्रति आक्रमण कोशिकाओं के एक औसत नंबर पाने के लिए प्रत्येक छवि में कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए निर्माता के प्रोग्राम का उपयोग करें।

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Representative Results

organotypic संस्कृति पहले कोलेजन प्रकार मैं के साथ प्राथमिक मानव fibroblasts मिश्रण और फिर मेसोथेलियल कोशिकाओं से 5 गुना संख्या के साथ इस संस्कृति overlaying द्वारा इकट्ठा किया गया था। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं आसंजन, आक्रमण या प्रसार का अध्ययन करने के लिए जोड़ा गया था इससे पहले कि संस्कृति में कम से कम 18 घंटे के लिए incubated था। प्रत्येक परख बहु के साथ दोहराया गया था (एन = 5) और आक्रमण assays (एन = 3) (एन = 3-5) विभिन्न रोगियों और कई कुओं से प्राप्त 3 डी संस्कृतियों आसंजन के लिए हर हालत में परीक्षण किया गया (एन = 5), प्रसार । 4 घंटा (चित्रा 4) के बाद 3 डी organotypic संस्कृति का पालन ओवेरियन कैंसर की कोशिकाओं, 72 घंटा (6 बार HeyA8 सेल दुगनी समय) (चित्रा 5) के बाद संस्कृति पर प्रचूर मात्रा में है, और 24 घंटा (चित्रा 6) के बाद आक्रमण किया। HeyA8 या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं के आसंजन, प्रसार और आक्रमण इंटीग्रिन पर निर्भर (चित्रा 4-6) था। विशेष रूप से, RGD पेप्टाइड और antib अवरुद्धएंटीबॉडी (चित्रा 4) 10 नहीं किया -integrin रेड पेप्टाइड, नियंत्रण एंटीबॉडी और 4 β जबकि odies, organotypic संस्कृति को डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका आसंजन हिचकते -integrin 5 -integrin, β 1 -integrin और α वी β 3 α करने के लिए। और organotypic संस्कृति पर हिचकते हैं या गर्भाशय के कैंसर सेल प्रसार -integrin 1 β, रेड पेप्टाइड, एंटीबॉडी को नियंत्रित करते हुए, α एंटीबॉडी -integrin 3 β और 4 -integrin β वी - प्रसार परख, RGD पेप्टाइड और 5 α के लिए एंटीबॉडी को रोकने में एंटीबॉडी (चित्रा 5) नहीं था। एंटीबॉडी -integrin α वी β 3 3 डी organotypic संस्कृति के माध्यम से या गर्भाशय के कैंसर सेल आक्रमण बढ़ाया है, जबकि और हिचकते -integrin 1 β - आक्रमण परख में, RGD पेप्टाइड और अवरुद्ध एंटीबॉडी 5 α करने के लिए। रेड पेप्टाइड, नियंत्रण एंटीबॉडी, और β4 -integrin एंटीबॉडी आक्रमण (चित्रा 6) को प्रभावित नहीं किया। शायद ही कभी, इन assays संयुक्त राष्ट्र व्याख्या की जाएगी (यानी, नियंत्रण एंटीबॉडी की तुलना में जब आसंजन, प्रसार या आक्रमण को बाधित नहीं होगा एंटीबॉडी अवरुद्ध -integrin α 5)। इससे पहले, हम निश्चित organotypic संस्कृतियों assays के दौरान मीडिया या पीबीएस धोने की बदलती पर दूर धोने जाएगा कि मिल गया है। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को मर चुके हैं या trypsin से काफी देर तक बरामद नहीं किया है तो इसके अलावा, के लिए फिर से एक्सप्रेस integrins पचाने, assays के काम नहीं करेगा। इसलिए, यह organotypic संस्कृति गर्भाशय के कैंसर सेल परख की गुणवत्ता का आकलन किया जा सकता है ताकि प्रत्येक परख में एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए हमेशा महत्वपूर्ण है। यहाँ दिखाया गया है, RGD पेप्टाइड, 5 -integrin α और organotypic संस्कृति के लिए एंटीबॉडी सभी हिचकते हैं या गर्भाशय के कैंसर कोशिका आसंजन, आक्रमण और प्रसार को अवरुद्ध -integrin 1 β और सकारात्मक चोर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैभविष्य assays में trols। इसी तरह, 4 β एंटीबॉडी अवरुद्ध organotypic संस्कृति को डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका आसंजन, आक्रमण और प्रसार को प्रभावित नहीं किया -integrin और भविष्य assays में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
मानव omental मेटास्टेसिस के चित्रा 1. प्रोटोकॉल। Hematoxylin और (ए) सामान्य मानव वपा (एमसी, मेसोथेलियल कोशिकाओं, झूठ बोलना, फ़ाइब्रोब्लास्ट, आदि, adipocytes) और (बी) या गर्भाशय के कैंसर omental मेटास्टेसिस (मेट, या गर्भाशय के कैंसर मेटास्टेसिस) की eosin दाग। = पैनल में लंबाई में 100 माइक्रोन बार। मानव वपा की सतह के लिए जल्दी या गर्भाशय के कैंसर सेल मेटास्टेसिस नकल उतार या गर्भाशय के कैंसर मेटास्टेसिस के 3 डी organotypic मॉडल (सी) योजनाबद्ध। देखें एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के सायन।

चित्र 2
प्राथमिक मानव omental कोशिकाओं की चित्रा 2. अलगाव। (ए) वपा का एक टुकड़ा पीबीएस में सर्जरी पर एकत्र की है और प्रयोगशाला में पहुंचा दिया है। ऊतक 0.5 xgx 3 मिनट पर pelleted और ताजा पीबीएस को सौंप दिया है। (बी) वपा का टुकड़ा पीबीएस के साथ धोया एक 10 सेमी पेट्री डिश को सौंप दिया है, और नलियां छोटे टुकड़े (0.5 सेमी में वपा कटौती करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं 3 )। (सीडी) ऊतक के टुकड़े एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एकत्र की है और एचपीएमसी के अलगाव के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित कर रहे हैं। पीबीएस ट्यूब से हटा दिया जाता है और एचपीएमसी पीबीएस से 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.5 XG pelleted कर रहे हैं। (एमसी, मेसोथेलियल कोशिकाओं, आरबीसी, लाल रक्त कोशिकाओं, झूठ बोलना, फ़ाइब्रोब्लास्ट) (ई) एनओएफ remaini से अलग कर रहे हैं hyaluronidase और collagenase प्रकार III के साथ ऊष्मायन के बाद एनजी omental ऊतक। छवि एक 6 से 12 घंटे की पाचन के बाद ऊतक से पता चलता है। एनओएफ आरटी पर 0.5 XG पर कताई द्वारा pelleted कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एचपीएमसी और एनओएफ की चित्रा 3. विशेषता मानव वपा ऊतक से अलग। (ए) मेसोथेलियल कोशिकाओं (एचपीएमसी) और (बी) fibroblasts (एनओएफ) के पहले चरण के विपरीत छवियों वपा ऊतक से अलगाव के बाद। मानव एचपीएमसी (सी) cytokeratin 8 और (ई) vimentin के लिए दाग। मानव एनओएफ (एफ) vimentin के लिए दाग, लेकिन (डी) cytokeratin 8. बार = 100 माइक्रोन के लिए दाग नहीं था, सभी पैनलों के लिए लागू होता है।ftp_upload / 53,541 / 53541fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Organotypic संस्कृति को चित्रा 4. ओवेरियन कैंसर कोशिका आसंजन इंटीग्रिन पर निर्भर है। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में (ए) आसंजन परख, 50,000 fluorescently लेबल या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं, HeyA8 कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था। प्रत्येक कुएं में कुल प्रतिदीप्ति की सूचना दी है। नियंत्रण एंटीबॉडी माउस आईजीजी है। प्रत्येक बार मतलब +/- मानक त्रुटि मतलब प्रतिनिधित्व करता है। प्रतिनिधि (बी) के चरण विपरीत और organotypic संस्कृति को डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका आसंजन (सी) फ्लोरोसेंट छवियों। बार = 100 माइक्रोन, दोनों पैनलों के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Organotypic संस्कृति पर चित्रा 5. ओवेरियन कैंसर सेल प्रसार इंटीग्रिन पर निर्भर है। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में (ए) प्रसार परख, 4000 fluorescently लेबल या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं, HeyA8 कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था। कोशिकाओं की कुल संख्या की सूचना दी है। नियंत्रण एंटीबॉडी माउस आईजीजी है। प्रत्येक बार मतलब +/- मानक त्रुटि मतलब प्रतिनिधित्व करता है। मर्ज किए गए चरण विपरीत और (बी) में organotypic संस्कृति पर या गर्भाशय के कैंसर सेल प्रसार के फ्लोरोसेंट छवियों 24 और (सी) 96 घंटा। बार = 100 माइक्रोन, दोनों पैनलों के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Organotypic संस्कृति के माध्यम से चित्रा 6 ओवेरियन कैंसर आक्रमण इंटीग्रिन पर निर्भर है। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में (ए) आक्रमण परख, 40,000 fluorescently लेबल या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं, HeyA8 कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था। (डालने की तह तक 3 डी संस्कृति के माध्यम से चले गए) हमलावर कोशिकाओं की संख्या की सूचना दी है। नियंत्रण एंटीबॉडी माउस आईजीजी है। प्रत्येक बार मतलब +/- मानक त्रुटि मतलब प्रतिनिधित्व करता है। (बी) के चरण विपरीत और (सी) organotypic संस्कृति के माध्यम से आक्रमण किया कि डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों। बार = 100 माइक्रोन, सभी पैनलों के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पेरिटोनियल microenvironment के एक organotypic मॉडल या गर्भाशय के कैंसर के प्रसार में microenvironment के सेलुलर और जन्मजात घटकों दोनों के व्यक्तिगत और सामूहिक समारोह (एस) का आकलन करने के लिए स्थापित किया गया था। डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका आसंजन, प्रसार, और आक्रमण की जांच करने के लिए 3 डी organotypic संस्कृति चढ़ाना और अनुकूलित करने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल प्रदान की जाती हैं। प्राथमिक मानव omental मेसोथेलियल कोशिकाओं और fibroblasts रोगियों से अलग और सामान्य आकृति विज्ञान और रोगी भिन्नता को संरक्षित करने के लिए एक प्रारंभिक बीतने पर इस्तेमाल किया गया। इस मॉडल में, सामान्य omental fibroblasts और ईसीएम (आमतौर पर कोलेजन प्रकार मैं) एक प्राथमिक मानव मेसोथेलियल सेल monolayer साथ स्तरित थे। यह मॉडल histologically पेरिटोनियल अस्तर mimics, और हमें विश्राम करने या गर्भाशय के कैंसर कोशिका आसंजन, प्रसार, और आक्रमण 8,27 सहित डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस में महत्वपूर्ण घटनाओं की जांच करने की अनुमति देता है।

इससे पहले, सीमित 3 डी मॉडल हैइस 3 डी organotypic मॉडल पेरिटोनियल गुहा की मेसोथेलियल अस्तर के निर्माण विश्राम करने के लिए सबसे पहले है, जबकि सूक्ष्म 13,14,21-25 साथ या गर्भाशय के कैंसर बातचीत की जांच के लिए स्थापित किया गया। मानव वपा उम्र और स्वास्थ्य के क्षेत्र में अलग-अलग रोगियों से एकत्र किया जाता है। ऊतक के स्वास्थ्य को सीधे मेसोथेलियल सेल और fibroblast अलगाव की तकनीक को प्रभावित करता है। स्वस्थ ऊतकों को वर्तमान बड़े lobules (> 5 मिमी) के साथ रंग में अधिक नारंगी है कि ऊतक की तुलना में बहुत छोटे lobules (1-3 मिमी) के साथ रंग में हल्का प्रकट होता है। ऊतक प्रयोगशाला के लिए सर्जरी से किया जाता है के रूप में एचपीएमसी के बहुमत प्रारंभिक पीबीएस में दूर स्लाव। 1 पीबीएस: ऊतक स्वस्थ, तथापि, अधिक लचीला एचपीएमसी को हटाने, और अतिरिक्त पीबीएस washes और 1 के लिए कर रहे हैं ट्रिप्सिन डाइजेस्ट एचपीएमसी और एनओएफ कोशिकाओं के एक मिश्रित संस्कृति में हो सकता है। स्वस्थ ऊतकों में, कुछ एचपीएमसी 6 घंटे की कोलैजिनेज़ पचाने जीवित रह सकते हैं, और पूर्ण में 1x collagenase समाधान में एक डाइजेस्ट हे / एनविकास मीडिया एक शुद्ध एनओएफ संस्कृति प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है। वपा हटाने पर पीबीएस में तुरंत रखा जाना चाहिए या नहीं HPMCs ऊतक से बरामद किया जाएगा ध्यान दें। ऊतक आरटी पर या एक फ्रिज में समय (> 2 घंटा) की एक विस्तारित अवधि के लिए पीबीएस में भंडारित किया जाता है इसके अलावा, अगर, पृथक रूप से व्यवहार्य HPMCs की संख्या काफी कम है।

एक 1: कोशिकाओं मेसोथेलियल को fibroblasts की 5 अनुपात विवो 8 में कोशिकाओं मेसोथेलियल को fibroblasts की अनुपात नकल करने के लिए चढ़ाया जाता है। यह अलग मेसोथेलियल कोशिकाओं के आकार रोगी से रोगी को बदलता है और इस चढ़ाना अनुपात करने के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ रोगियों की मेसोथेलियल कोशिकाओं बहुत छोटे होते हैं; इन मामलों में, हम मेसोथेलियल कोशिकाओं (20,000) के दोहरे नंबर प्लेट। इसके अलावा, प्राथमिक कोशिकाओं को हमेशा आकारिकी की रक्षा करने के लिए एक प्रारंभिक (1-2) से पारित होने पर किया जाता है। मेसोथेलियल कोशिकाओं cuboidal या पतली, और cuboidal मेसोथेलियल कोशिकाओं को और अधिक पतली हो जाते हो सकता हैवे या TGFβ 10 के साथ या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं या उपचार से वातानुकूलित मीडिया के लिए अधिक से अधिक जोखिम के साथ passaged कर रहे हैं।

डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं का पालन करना और एक ही या अलग रोगियों से उपकला मेसोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में अधिक कुशलता से mesenchymal मेसोथेलियल कोशिकाओं के माध्यम से आक्रमण कर सकते हैं। आमतौर पर, हम या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक assays शुरू करने से पहले 18 घंटे के लिए organotypic संस्कृति की स्थापना की। अब मेसोथेलियल कोशिकाओं और fibroblasts, साथ में वे या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, जो ईसीएम प्रोटीन, सहित विभिन्न प्रोटीन स्रावित करने के लिए और अधिक समय सुसंस्कृत हैं। इन assays के प्रदर्शन integrins, प्रोटिएजों, और वृद्धि कारकों सहित वृद्धि की आसंजन, आक्रमण, और / या प्रसार के साथ जुड़े प्रोटीन का अंतर प्रसार दर और अभिव्यक्ति के स्तर है, जब एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रत्येक कैंसर कोशिका लाइन या प्राथमिक मानव में, खाते में लेने के लिए कैंसर कोशिका प्रकार के।organotypic संस्कृति के साथ कार्यात्मक assays से प्रत्येक में इस्तेमाल कैंसर कोशिकाओं के समय और संख्या प्रत्येक कैंसर कोशिका लाइन या प्राथमिक कैंसर सेल के प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, वर्णित आसंजन परख में, या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को इस समय के दौरान संस्कृति पर हमला हो सकता है।

जाहिर है, यह organotypic मॉडल ऐसे सभी प्रतिरक्षा, एन्दोथेलिअल के रूप में सामान्य पेरिटोनियल microenvironment के घटक है, और वसाकोशिका कोशिकाओं को शामिल नहीं करता। प्राथमिक कोशिकाओं केवल पहले तीन मार्ग के भीतर उपयोग किया जाता है के रूप में इसके अतिरिक्त, मॉडल, पहुंच और प्राथमिक मानव ऊतक की उपलब्धता पर निर्भर करता है। हालांकि, मॉडल प्राथमिक मानव कोशिकाओं और मेटास्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि अनेक प्रकार की कोशिकाओं के समावेश के अपने प्रयोग में कई फायदे हैं। इस मॉडल के बाद अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं में जीन और प्रोटीन विनियमन (यानी, कैंसर की कोशिकाओं को, सामान्य मेसोथेलियल या fibroblast कोशिकाओं) की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैसह संस्कृति। विशेष रूप से, की भूमिका जल्दी मेटास्टेसिस में सी-मेट 28, एमएमपी 2 9,29, 5 -integrin 10,31 α 3 -integrin 16 β ई cadherin 30, β 1 -integrin 10,,, और फ़ाइब्रोनेक्टिन 10 है पता लगाया गया। इसके अतिरिक्त, मॉडल ऐसे adipocytes 6 के समावेश के रूप में और अधिक प्रकार की कोशिकाओं को शामिल करने के लिए विस्तार करने की क्षमता है। मॉडल संशोधित और पेरिटोनियल microenvironment करने के लिए 27 या गर्भाशय के कैंसर कोशिका आसंजन / आक्रमण के छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग में उपयोग के लिए छोटी की गई है। इस मॉडल का भविष्य अनुप्रयोगों यंत्रवत अध्ययन और उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए मैक्रोफेज सहित परख में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समावेश में शामिल होंगे। सारांश में, organotypic सेल संस्कृति गोवा के साथ मानव पेरिटोनियल microenvironment गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान करता है,प्रचार-प्रसार और रोग प्रगति का महत्वपूर्ण आणविक तंत्र elucidating, और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के एल।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS Fisher Scientific SH3001304
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640
15 cm culture dishes BD Biosciences 353025
Glass flask ? ?
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine Corning 10-013-CV
MEM Vitamins Corning 25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids Corning 25-025-CI
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Shaker  Thermo-Fisher MaxQ 4450
Centrifuge Eppendorf 5702
Incubator Thermo-Fisher Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%) Corning 25-053-CI
Hyaluronidase Worthington Biochemical LS002592
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
T-175 Flasks BD Biosciences 353112
Pipet tips Rainin P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips Corning Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter Invitrogen Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10313
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Collagen Type I (Rat Tail) BD Biosciences 354236
96 well plate, clear bottom, black BD Biosciences 353219
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet Eppendorf Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Plate reader Molecular Devices Minimax
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well) BD Biosciences 353097
Cotton swabs Q-tips cotton swabs
Microscope Zeiss Axiovert 200m
Cell Profiler public domain
24 well plate BD Biosciences 353047
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 EMD Millipore MAB1976
Beta 1  Oncosynergy OS2966
Alpha 5 [CD49e] ID Pharmingen 555615
Beta 4 [CD104] EMD Millipore MAB 2058

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References

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चिकित्सा अंक 106 सूक्ष्म या गर्भाशय के कैंसर आसंजन आक्रमण प्रसार 3 डी संस्कृति मॉडलिंग मॉडल
मानव peritoneal गुहा की एक Organotypic संस्कृति में डिम्बग्रंथि के कैंसर के प्रसार के प्रारंभिक चरणों मॉडलिंग
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Peters, P. N., Schryver, E. M.,… More

Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).

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