Protocol
Alle forskningsprotokoller beskrevne er blevet behandlet af University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Informeret samtykke blev opnået fra hver patient før operationen, og undersøgelsen blev godkendt af University of Chicago IRB. Et biologisk sikkerhed kabinet type 2 og handsker bør anvendes ved håndtering af humant væv for beskyttelse og for at mindske risikoen for kontaminering celler.
1. isolering og dyrkning af primære Utransformerede stromacellers
- Humant væv indsamling og forberedelse.
- Opnå prøver af human omentum, 2 cm3, fjernes under en abdominal kirurgi, og straks fordybe væv i RT phosphatbufret saltvand (PBS) (figur 2A). Et stykke af omentum 3 cm x 2 cm giver typisk 1 million primære humane mesotelceller (HPMC) og 200.000 primære humane fibroblaster eller normale oment fibroblaster (NOF).
- Spin ned PBS vævet blev nedsænket i 0.5 xg for 3min snarest muligt efter indsamling (<2 timer i PBS) og overføre vævet til frisk 20 ml PBS i et 50 ml konisk rør. Opskæres vævet ind 5mm 3 stykker ved hakning med skalpeller i en diameter på 15 cm, steril dyrkningsskål (figur 2B).
- Primære humane mesothelial celleisolering 8
- For at isolere HPMC, overføre det hakkede væv i 50 ml koniske rør og vent 1 min for de faste stykker til at flyde til toppen (figur 2C & D). HPMC og røde blodlegemer (RBC) vil være til stede i væsken på bunden. Brug en pipette til at fjerne væsken fra bunden af røret og ind i en ny konisk rør. Spin væsken ned 0.5 x g i 3 minutter og aspireres supernatanten fra HPMC / RBC pellet.
- Gentag processen tre gange: der tilsættes 20 ml PBS til det hakkede væv, tillader væv at stige, fjerne væske fra bunden med en pipette og ind i HPMC / RBC rør, spin ned, og fjernsupernatant. Efter alle spin er afsluttet, og supernatanten aspireres, vil pelleten indeholde HPMC og RBC.
- Plate alle celler fra pelleten i en 75 cm2 kolbe i 15 ml komplet vækstmedium (DMEM med 10% føtalt bovint serum [FBS], 1% MEM-vitaminer [93 mg / L], 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer [81,4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin]).
- Udfør en sekundær vask med PBS for at isolere yderligere HPMC'er.
- For den sekundære PBS vaske, ryste resterende faststof væv ved 200 rpm, 37 ° C i 10 minutter i 20 ml PBS, derefter vente 1 min for vævet at flyde til toppen. Fjern væsken fra bunden af røret i et nyt rør, centrifugeres ved 0,5 x g i 3 minutter, og supernatanten aspireres.
- Plate alle HPMC / RBC fra det sekundære PBS vask i en separat 75 cm2 kolbe i 15 ml komplet vækstmedium.
- For at isolere enhver remaining HPMC, ryste det hakkede væv ved 200 rpm, 37 ° C grader i 10 minutter i 20 ml af en 1: 1 0,25% trypsin 25 mM EDTA: PBS-opløsning efter volumen. Tillad vævet til at stige, opsamling af væsken ved bunden af røret i en ny 50 ml rør og spin ned på 0,5 gx 3 min.
- Aspirer supernatanten og pladen hele HPMC / RBC i en separat 75 cm2 kolbe i 15 ml komplet vækstmedium.
- Kultur de udpladede celler ved 37 ° C og 5% CO2 i en befugtet miljø. Feed udpladede celler ved tilsætning af 15 ml komplet vækstmedium på dag 3 og 5 uden at fjerne de brugte medier. HPMC kan dyrkes i 5-7 dage før opdelingen.
- Brug lav passage HPMC (op til passagen 2) i alle eksperimenter for at minimere dedifferentiering og ændring af originale fænotype. Brug en bred felt mikroskop helst med en 20x mål med plastik differentiale kontrast interferens kapaciteter eller 4-20x mål med fase kontrast capabilities (fase kontrast filtre på mikroskop) for at tage alle billeder af celler, og en 10x målsætning () i lyse felt til at analysere immunhistokemisk 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) farvning.
- Bekræft, at HPMC er terningformet og udtrykke cytokeratin 8 og vimentin ved at udføre immunhistokemi 8 (figur 3A, C, E).
- For at isolere HPMC, overføre det hakkede væv i 50 ml koniske rør og vent 1 min for de faste stykker til at flyde til toppen (figur 2C & D). HPMC og røde blodlegemer (RBC) vil være til stede i væsken på bunden. Brug en pipette til at fjerne væsken fra bunden af røret og ind i en ny konisk rør. Spin væsken ned 0.5 x g i 3 minutter og aspireres supernatanten fra HPMC / RBC pellet.
- NOF isolation 8
- Forbered 10 ml af en bestand af collagenase type III opløsning (10x) ved at kombinere et 1: 1: 1 blanding af 100x Pen-Strep: 1.500 enheder aktivitet / ml collagenase type III: 714 enheder aktivitet / ml hyaluronidase i PBS.
- Ryst det hakkede omentum væv, der er tilbage efter HPMC isolation ved 200 rpm, 37 ° C i 6 timer i 10 ml 10x collagenase type III opløsning fortyndet i serumfrie medier (DMEM med 1% MEM-vitaminer [93 mg / l], 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer [81,4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin]). Nedbrudt væv vil se uigennemsigtige og kan have nogle fibrøse debris (Figur 2E).
- Centrifugeres opløsningen indeholdende NOF celler i suspension ved 0,5 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, aspireres supernatanten og pladen pellet i en 75 cm2 kolbe i 13 ml komplet vækstmedium.
- Fjern gamle medier og erstatte med 15 ml frisk fuld vækstmedier efter 24 timer. NOF kan dyrkes i 1-3 dage før opdelingen. Bemærk spredning af NOF vil ophøre, når cellerne flyder sammen.
- Bekræfter, at de primære humane fibroblaster er flade, aflange celler og udtrykke vimentin, men ikke cytokeratin 8 ved at udføre immunohistokemi 8 (figur 3B, D, F). Brug lav passage NOF til eksperimenter (ideelt set før passagen 3) for at minimere dedifferentiering og ændring af originale fænotype. Brug en bred felt mikroskop med en 20x mål med plast DIC kapaciteter til at tage alle fase billeder af celler,og en 10x mål i lyse felt til at analysere immunhistokemisk DAB farvning.
2. Plating den Organotypiske Kultur 8
- Frigivelse NOF fra 75 cm dyrkningskolben ved skylning med 10 ml PBS efterfulgt af 3 ml 0,25% trypsin / 25 mM EDTA for ikke mere end 5 min. Neutraliseres trypsin med mindst 3 gange volumenet af fuld vækstmedier.
- Overfør trypsinerede celler i en 50 ml konisk rør og spin ned på 0,5 gx 3 min. Fjern supernatanten og bringe cellerne tilbage op i 5 ml komplet vækstmedium. Brug en celletæller at tælle cellerne udvundet fra kulturen kolben.
- Fortynd celler i det passende volumen af fuld vækst medier til pladen 2,000-4,000 NOF pr 100 pi på en sort, klar bund, 96-brønds plade. Tilsæt 0,5 ug / 100 pi rotte-hale collagen I til celleblandingen før udpladning. Lad celler sidder ved 37 ° C i 5% CO2 i en fugtig miljø i mindst 4 timer, eller indtil cellerneat holde sig til pladens overflade.
- Slip HPMC fra dyrkningskolben under anvendelse af de samme metoder som beskrevet i trin 2.1 og 2.2. Fortynd celler i passende mængde fuldt vækstmedium til pladen 10.000-20.000 HPMC pr 50 pi oven på NOF allerede belagt med kollagen I i 96-brønds plader. Lad cellerne sidde ved 37 ° C i 5% CO2 i en fugtig miljø i mindst 18 timer før påbegyndelse af eksperimenterne.
- Kultur grønt fluorescerende protein (GFP) udtrykkende HeyA8 ovariecancer celler i fuldt vækstmedium. HeyA8 ovariecancer celler fluorescensmærket ved ekspression af et lentiviral vektor der udtrykker copepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 ovariecancer celler bør være 80-90% konfluente på dagen for anvendelse (logaritmiske vækstfase). Slip celler fra kulturen plade og tælle ved hjælp af de samme metoder, der er beskrevet i trin 2.1-2.2 for primære celler.
- Tillad ovariecancerceller at inddrive i fuld vækst medier til 15-20 min ved 37 ° C i enkonisk rør med låget løst forseglet.
3. adhæsionsanalysen 8
- Efter inddrivelsen, pelletere ovariecancerceller ved spinning i 3 min ved 0,5 xg og derefter fjerne supernatanten og fortyndes cellerne i passende volumen af serum-frie medier for at opnå en koncentration på 50.000 celler / 100 ul.
- Vend 96-brønds plader med HPMC / NOF organotypiske kulturer for at fjerne brugte medier, og der tilsættes 100 pi af cancercellen suspension i serumfrit medium til hver brønd. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5% CO2 i en fugtig miljø i 30 minutter til 4 timer.
- Vend plade med 96 brønde at fjerne mediet og ikke-adhærente celler. Brug en multikanal pipette ved lav effekt til omhyggeligt og forsigtigt Pipettér 100 pi PBS i hvert hul, og vend pladen igen. Gentag PBS vask en gang mere.
- Vend at fjerne PBS, og der tilsættes 100 pi 4% paraformaldehyd til hver brønd. Lad pladen til at sidde i 20 min at fastsætte cellerne. Efter 20 minutter vendes pladen, og der tilsættes 100 pi PBS.
- Bemærk, at den samlede fluorescens brønde kan rapporteres eller antallet af celler kan kvantificeres. Til kvantificering, første plade en standardkurve i to eksemplarer ved hjælp HeyA8 celler i en koncentration på 1 million celler / ml.
- Gør standardkurven ved nedspinning 1 million celler, fjernelse af mediet og tillader dem at sidde i 1 ml 4% paraformaldehyd i 20 minutter.
- Spin celler igen og opdrage i 1 ml PBS (optælling celler til at bekræfte 1 million / ml koncentration). Plade 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, og 0-celler i hver brønd in duplo, og tilføj PBS i en endelig samlet volumen på 50 pi i hver brønd.
- Nederst læse kultur plade på en fluorescenspladelæser (excitation = 488 nm, emission = 528 nm), skalering høje brønde (50.000 om standardkurve). Brug standardkurven til at beregne, hvor mange ovariecancerceller klæbet til organotypic kultur i hver brønd (figur 4A-C).
4. proliferationsassav 10
- Efter ovariecancer celler inddrive (se trin 2.5 og 2.6 ovenfor), pelletere cellerne ved centrifugering i 3 minutter ved 0,5 xg og derefter fortyndes cellerne i passende volumen af 1% FBS medier (DMEM med 1% FBS, 1% MEM vitaminer [93 mg / L], 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer [81,4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin]) for at opnå en koncentration på 4.000 celler / 150 pi.
- Vend plade med 96 brønde med HPMC / NOF organotypiske kulturer for at fjerne brugte medier og tilføje 150 pi af cancercellen suspension i 1% FBS medier til hver brønd. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5% CO2 i en fugtig miljø i 72 timer.
- Nederst læse kultur plade på en fluorescenspladelæser en gang om dagen (excitation = 488 nm, emission = 528 nm) for at evaluere den relative proliferationaf celler. Fortsæt analysen for 96 timer, ændrer mediet ved 48 timer (figur 5A-C). Pas på ikke at forstyrre kulturen ved skift medier (vende pladen er at foretrække).
5. Invasion Assay 8
- Før udpladning 3D kultur, tilsættes 7,5 ug rotte-hale collagen I i 200 pi PBS til en 24-brønds dyrkningsplade insert (8 um porestørrelse). Lad pladen inkubatet O / N, så forsigtigt fjerne PBS med en pipette umiddelbart før plating den HPMC / NOF organotypisk kultur ind på kollagen-coatede skær (trin 2 ovenfor).
- Forbered ovariecancerceller som i trin 3.1. Til plade af ovariecancerceller på de organotypiske kulturer på indsatsene, forsigtigt bruge en pipette til at fjerne overskydende medie fra toppen af indsatserne. Tilsættes 100 pi af ovariecancer cellesuspension i serumfrie medier til hver brønd.
- Tilføj 750 pi fuld vækst mediet i et godt stykke under indsatsen for at inducere cancercelle ivasion i organotypiske kulturer. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5% CO2 i en fugtig miljø i 24 timer.
Bemærk: Æggestokkræftceller at invadere organotypisk kultur vil krydse indsatsen og forbliver på undersiden af indsatsen. - Efter 24 timer, tage fat i indsatsen med tang og kort skylle det i et bæger PBS, derefter flytte indsatsen i en tom brønd. Skrubbe toppen af hver indsats med begge sider af en vatpind til i alt 1 min. Hurtigt placere indsatsen i en plade indeholdende 750 pi 4% paraformaldehyd i hver brønd. Lad hver indsats for at sidde i paraformaldehyd i 10 min, før du overfører indsatserne i brønde fyldt med 750 pi PBS.
- Se de invaderede celler (klæbet og fastgjort til bunden af indsatse) med et mikroskop ved 2,5x forstørrelse. Når hele brønden er inden for synsfeltet, justere forstørrelsen til 10x og tage 5 billeder, en nær midten og 1 i hver kvadrant af brønden, så man undgårtage billeder, der er for tæt på kanterne. Følg samme mønster for hver brønd.
- Brug producentens program til at tælle antallet af celler i hvert billede for at få et gennemsnitligt antal celler pr invaderede felt i hver brønd (figur 6A-C) ifølge deres protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den organotypisk kultur blev samlet ved først at blande primære humane fibroblaster med collagen type I og derefter overlejring denne kultur med 5 gange antallet af mesotelceller. Kulturen blev inkuberet i mindst 18 timer før ovariecancerceller blev tilsat for at studere vedhæftning, invasion eller proliferation. Hvert assay blev gentaget med flere (n = 3-5) 3D kulturer opnået fra forskellige patienter og mange brønde blev testet i hver tilstand for friktion (n = 5), proliferation (n = 5) og invasion assays (n = 3) . Ovariecancerceller klæbet til 3D organotypisk kultur efter 4 timer (figur 4), prolifererede på kulturen efter 72 timer (6 gange HeyA8 celle fordoblingstid) (figur 5), og invaderede efter 24 timer (figur 6). Vedhæftning, spredning og invasion af HeyA8 ovariecancerceller var integrin-afhængig (figur 4-6). Specifikt RGD peptid og blokering ANTIBodies til a 5 -integrin, β 1 -integrin og α mod β 3 -integrin inhiberede ovariecancer celleadhæsion til organotypisk kultur, mens RAD peptid, kontrol-antistof og p 4 -integrin antistof gjorde ikke (Figur 4) 10. I proliferationsassayet RGD peptid og blokerende antistoffer til a 5 - og p 1 -integrin inhiberet ovariecancer celleproliferation på organotypisk kultur, mens RAD peptid, kontrol-antistof, α mod p 3 -integrin antistof og p 4 -integrin antistof gjorde ikke (Figur 5). I invasionen assay til RGD peptid og blokerende antistoffer a 5 - og p 1 -integrin inhiberet, medens α β v 3 -integrin antistof forøget ovariecancer invasion kræftcelle gennem 3D organotypisk kultur. RAD peptid, kontrol-antistof, og β4 -integrin antistof påvirkede ikke invasion (figur 6). Sjældent vil disse assays un-fortolkelige (dvs. α 5 -integrin blokerende antistof vil ikke inhibere adhæsion, proliferation eller invasion sammenlignet med kontrolgruppen antistof). Tidligere har vi fundet, at visse organotypiske kulturer vil vaske væk ved ændring af mediet eller PBS vask i assayene. Desuden, hvis de ovariecancerceller er døde eller ikke har genvundet længe nok fra trypsinnedbrydningsprodukt at re-express integriner, vil analyserne ikke. Derfor er det altid vigtigt at have en positiv og negativ kontrol i hvert assay så kvaliteten af organotypisk kultur og ovariecancercelle assay kan vurderes. Som vist her, RGD peptid, a 5 -integrin og p 1 -integrin blokerende antistoffer inhiberede alle ovariecancer celleadhæsion, invasion og proliferation til organotypisk kultur og kan anvendes som positive conkontroller i fremtidige analyser. Ligeledes β 4 -integrin blokerende antistof påvirkede ikke ovariecancer celleadhæsion, invasion og proliferation til organotypisk kultur og kan anvendes som en negativ kontrol i fremtidige assays.
Figur 1. Histologi af human oment metastase. Hematoxylin og eosinfarve af (A) normal human omentum (MC, mesotelceller, Fib, fibroblaster, Adi, adipocytter) og (B) ovariecancer oment metastase (Met, ovariecancer metastase). Bar i paneler = 100 um i længden. (C) Skematisk af 3D organotypiske model af kræft i æggestokkene metastaser efterligne tidlig ovariecancer celle metastase til overfladen af den menneskelige omentum. Klik her for at se et større verdelse af dette tal.
Figur 2. Isolering af primære humane celler oment. (A) Et stykke omentum opsamles ved kirurgi i PBS og transporteres til laboratoriet. Vævet pelleteret ved 0,5 xgx 3 min og overført til frisk PBS. (B) Stykket af omentum overføres til en 10 cm petriskål, vasket med PBS, og skalpeller bruges til at skære omentum i små stykker (0,5 cm 3 ). (CD) Vævsstykkerne opsamles under anvendelse af en 25 ml serologisk pipette og overføres til en 50 ml konisk rør til isolering af HPMC. PBS fjernes fra røret og HPMC pelleteres fra PBS en 0,5 x g ved 37 ° C. (MC, mesotelceller, RBC, røde blodlegemer, Fib, fibroblaster) (E) NOF isoleres fra remaini ng oment væv efter inkubation med hyaluronidase og collagenase type III. Billedet viser vævet efter en 6- til 12-timers fordøjelse. NOF er pelleteret ved centrifugering ved 0,5 xg ved stuetemperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Karakterisering af HPMC og NOF isoleret fra humant væv omentum. Fasekontrast billeder af (A) mesotelceller (HPMC) og (B) fibroblaster (NOF) efter isolering fra omentum væv. Human HPMC farvet for (C) cytokeratin 8 og (E) vimentin. Menneskelig NOF farvet for (F) vimentin, men ikke plette for (D) cytokeratin 8. Bar = 100 um, gælder for alle paneler.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ovariecancer celleadhæsion til organotypisk kultur er integrin-afhængig. (A) Bindingsanalysen blev udført med 50.000 fluorescens-mærkede ovariecancerceller, HeyA8 celler, som beskrevet i protokol afsnittet. Den totale fluorescens i hver brønd er rapporteret. Kontrol antistof er muse-IgG. Hver søjle repræsenterer middelværdien +/- standardfejl middelværdi. Repræsentant (B) fase-kontrast og (C) fluorescerende billeder af æggestokkene kræftcelle vedhæftning til organotypisk kultur. Bar = 100 um, gælder for begge paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Ovariecancer celleproliferation på organotypisk kultur er integrin-afhængig. (A) Proliferationsassayet blev udført med 4.000 fluorescens-mærkede ovariecancerceller, HeyA8 celler, som beskrevet i protokol afsnittet. Det totale antal celler rapporteres. Kontrol antistof er muse-IgG. Hver søjle repræsenterer middelværdien +/- standardfejl middelværdi. Fusionerede fase-kontrast og fluorescerende billeder af ovariecancer celledeling på organotypisk kultur på (B) 24 og (C) 96 timer. Bar = 100 um, gælder for begge paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
Figur 6. æggestokkene cancerinvasion gennem organotypisk kultur er integrin-afhængig. (A) invasion assay blev udført med 40.000 fluorescens-mærkede ovariecancerceller, HeyA8 celler, som beskrevet i protokol afsnittet. Antallet af invaderende celler (bevæges gennem 3D kulturen til bunden af indsatsen) rapporteres. Kontrol antistof er muse-IgG. Hver søjle repræsenterer middelværdien +/- standardfejl middelværdi. (B) Fase-kontrast og (C) fluorescerende billeder af ovariecancerceller der invaderede gennem organotypisk kultur. Bar = 100 um, gælder for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organotypisk model af peritoneal mikromiljø blev etableret for at vurdere individuelle og kollektive funktion (er) af både de cellulære og medfødte komponenter i mikromiljøet i æggestokkene formidling cancer. De specifikke protokoller for plating og tilpasse 3D organotypisk kultur for at undersøge kræft i æggestokkene celleadhæsion, proliferation og invasion er forudsat. Primære humane oment mesotelceller og fibroblaster blev isoleret fra patienter og anvendes på et tidligt passage at bevare normal morfologi og variation. I denne model, blev den normale oment fibroblaster og ECM (typisk kollagen type I) lag med en primær human mesotelial cellemonolag. Denne model histologisk efterligner den peritoneal foring, og giver os mulighed for at genskabe og undersøge vigtige begivenheder i æggestokkræft metastase, herunder kræft i æggestokkene celleadhæsion, proliferation og invasion 8,27.
Tidligere begrænsede 3D modeller harblevet nedsat for at undersøge ovariecancer interaktioner med mikromiljøet 13,14,21-25, mens denne 3D organotypisk model er den første til at genskabe opførelsen af mesothelial-foring af bughulen. Den menneskelige omentum er indsamlet fra patienter, der varierer i alder og helbred. Sundheden for vævet påvirker direkte mesothelial celle- og fibroblast isolation teknikker. Den sundere væv vises lysere i farven med meget små lobules (1-3 mm) i forhold til væv, der er mere orange farve med store lobules stede (> 5 mm). Størstedelen af HPMC ham ud i den indledende PBS som vævet udføres fra kirurgi til laboratoriet. Den sundere vævet imidlertid mere modstandsdygtig HPMC er fjernelse og yderligere gange vask med PBS og 1: 1 PBS: trypsinnedbrydningsprodukt kan resultere i en blandet kultur af HPMC og NOF celler. I de sundere væv, kan nogle HPMC overleve 6-timers collagenase fordøje og en digest O / N i 1x collagenase opløsning i fuldanbefales vækstmedier at opnå en ren NOF kultur. Bemærk omentum skal placeres umiddelbart i PBS ved fjernelse eller ingen HPMC'er vil blive inddrevet fra væv. Hvis endvidere Vævet opbevares i PBS i en længere periode (> 2 timer) ved stuetemperatur eller i køleskab, antallet af levedygtige HPMC'er isoleret reduceres betydeligt.
En 1: 5-forhold af fibroblaster til mesotelceller udplades at efterligne forholdet mellem fibroblaster til mesotelceller in vivo 8. Det er vigtigt at bemærke, at størrelsen af isolerede mesotelceller varierer fra patient til patient, og dette kan kræve justering af klædningen forholdet. Mesothelial celler af nogle patienter er meget mindre; i disse tilfælde, vi plade fordoble antallet af mesotelceller (20.000). Desuden er de primære celler altid brugt på et tidligt (1-2) passage at bevare morfologi. Mesotelceller kan være kubisk eller tynde, og cuboide mesotelceller bliver mere rangletsom de er passage, eller med større eksponering for konditioneret medie fra ovariecancerceller eller behandling med TGF 10.
Ovariecancerceller kan klæbe til og invadere gennem mesenkymale mesotelceller mere effektivt end de epiteliale mesotelceller fra samme eller forskellige patienter. Typisk vi oprettet organotypisk kultur for 18 timer, før de starter de funktionelle assays med ovariecancerceller. Jo længere mesotelceller og fibroblaster dyrkes sammen, jo mere tid, de har til at udskille forskellige proteiner, herunder ECM-proteiner, som kan påvirke adfærden hos ovariecancerceller. En anden vigtig faktor at tage i betragtning, når udfører disse assays er forskellen proliferationshastighed og ekspressionsniveauet af proteiner associeret med forøget adhæsion, invasion og / eller proliferation, herunder integriner, proteaser og vækstfaktorer, i hvert cancercellelinie eller primære humane cancercelletyper.Den tid og antal af cancerceller anvendt i hver af de funktionelle assays med organotypisk kultur skal optimeres for hver cancercellelinie eller type af primær kræftcelle. For eksempel i den beskrevne adhæsion assay kunne ovariecancerceller være invaderer kulturen i dette tidsrum.
Det er klart, går denne organotypisk model indeholder ikke alle komponenter i den normale peritoneal mikromiljø såsom immunrespons, endotel- og adipocyt celler. Derudover afhænger den model på tilgængelighed og tilgængeligheden af primære humane væv, som de primære celler kun anvendes inden for de første tre passager. Men modellen har mange fordele i anvendelsen af primære humane celler og inkorporering af flere celletyper, som har vist sig at spille en vigtig rolle i metastase. Denne model har været brugt til at undersøge gen og protein regulering i de enkelte celletyper (dvs., kræftceller, normal mesothelial eller fibroblastceller) efterco-kultur. Især roller c-Met 28, MMP-2 9,29, E-cadherin 30, β 1 -integrin 10, p 3 -integrin 16, a 5 -integrin 10,31 og fibronectin 10 i begyndelsen af metastaser har blevet udforsket. Derudover modellen har potentiale til at udvide til at omfatte flere celletyper, såsom indarbejdelse af adipocytter 6. Modellen er blevet ændret og miniaturiseret til brug i high-throughput screening til at identificere småmolekyleinhibitorer af ovariecancer celleadhæsion / invasion til peritoneal mikromiljø 27. Fremtidige anvendelser af denne model omfatter inkorporering af immunceller i assayet, herunder makrofager for mekanistiske undersøgelser og high-throughput screening. Sammenfattende organotypisk cellekultur giver en nyttig model til at vurdere samspillet mellem den menneskelige peritoneal mikromiljø og ovariecancerceller, med goal belyse vigtige molekylære mekanismer i formidling og sygdomsprogression, og identificere potentielle terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A.
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E.
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
