Protocol
Alle forskningsprotokoller beskrevet er gjennomgått av University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Informert samtykke ble innhentet fra hver pasient før operasjonen og studien ble godkjent av University of Chicago IRB. En biologisk sikkerhetskabinett type 2 og hansker bør brukes ved håndtering av menneskelig vev for beskyttelse og for å redusere risikoen for å forurense celler.
1. Isolering og Culture of Primary untransformed stromaceller
- Menneskelig vev samling og forberedelser.
- Innhente prøver av human omentum, 2 cm 3, fjernes under en abdominal kirurgi, og umiddelbart dyppe vev i RT fosfatbufret saltløsning (PBS) (figur 2A). Et stykke omentum 3 cm x 2 cm vanligvis gir 1 million primære humane mesothelial celler (HPMC) og 200.000 primære humane fibroblaster eller normale omentfaktorene fibroblaster (NOF).
- Spinne ned PBS vevet ble nedsenket i 0.5 xg for tremin så snart som mulig etter samling (<2 timer i PBS) og overføre vev i frisk 20 ml PBS i et 50 ml konisk rør. Skjær opp vevet inn 5mm 3 stykker av hakking med skalp i en 15 cm diameter, steril kultur tallerken (figur 2B).
- Primære humane mesothelial celle isolasjon 8
- For å isolere HPMC, overføre hakket vevet i 50 ml koniske rør og vent 1 minutt for å få de faste stykker til å flyte til toppen (figur 2C og D). HPMC og røde blodceller (RBC) vil være tilstede i væsken på bunnen. Bruke en pipette for å fjerne væsken fra bunnen av røret og inn i en ny konisk rør. Spinn væsken ned til 0,5 x g i 3 minutter og supernatanten aspireres fra HPMC / RBC-pellet.
- Gjenta prosessen tre ganger: legg 20 ml PBS til kvernet vev, la vev å stige, fjerne væske fra bunnen med en pipette og inn i HPMC / RBC tube, spinne ned, og fjernsupernatant. Etter at alle spinn er fullført og supernatanten suges vil pellet inneholde HPMC og RBC.
- Plate alle celler fra pelleten til en 75 cm2 kolbe i 15 ml komplett vekstmedium (DMEM med 10% føtalt bovint serum [FBS], 1% MEM vitaminer [93 mg / L], 1% MEM ikke-essensiell aminosyrer [81.4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin]).
- Utfør en sekundær PBS vask for å isolere ekstra HPMCs.
- For den sekundære PBS vaske, riste gjenværende faste vev ved 200 rpm, 37 ° C i 10 min i 20 ml PBS, og deretter vente 1 min for vev for å flyte opp til toppen. Fjern væsken fra bunnen av røret inn i et nytt rør, sentrifuger ved 0,5 x g i 3 minutter, og aspirer supernatanten.
- Plate alle HPMC / RBC fra den sekundære PBS vaskes i et separat 75 cm2 kolbe i 15 ml komplett vekstmedium.
- For å isolere noen remaining HPMC, rist hakket vev ved 200 rpm, 37 ° C ° i 10 minutter i 20 ml av en 1: 1 0,25% trypsin 25 mM EDTA: PBS-løsning i volum. Tillat vevet til å stige, samler væsken i bunnen av røret i en ny 50 ml rør, og spinne ned ved 0,5 gx 3 min.
- Aspirer supernatanten og plate alle HPMC / RBC i en separat 75 cm2 kolbe i 15 ml komplett vekstmedium.
- Culture de pletterte celler ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig miljø. Strøm belagt celler ved å tilsette 15 ml full vekst media på dag 3 og 5 uten å fjerne de brukte media. HPMC kan bli dyrket i 5-7 dager før splitting.
- Bruk lav-passasje HPMC (opp til passasje 2) i alle forsøk for å minimalisere dedifferentiation og modifikasjon av original fenotype. Bruk en bred-feltet mikroskop fortrinnsvis med et 20x objektiv med plast differensialkontrast interferens evner eller 4-20x Målet med fase kontrast capabilities (fase kontrast filtre på mikroskopet) for å ta alle bildene av celler, og et 10x objektiv () i lyse feltet for å analysere immunohistokjemisk 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) flekker.
- Bekreft at HPMC er cuboidal og uttrykke cytokeratin 8 og vimentin ved å utføre immunhistokjemi 8 (figur 3A, C, E).
- For å isolere HPMC, overføre hakket vevet i 50 ml koniske rør og vent 1 minutt for å få de faste stykker til å flyte til toppen (figur 2C og D). HPMC og røde blodceller (RBC) vil være tilstede i væsken på bunnen. Bruke en pipette for å fjerne væsken fra bunnen av røret og inn i en ny konisk rør. Spinn væsken ned til 0,5 x g i 3 minutter og supernatanten aspireres fra HPMC / RBC-pellet.
- NOF isolasjon 8
- Forbered 10 ml av et lager av kollagenase type III-løsning (10x) ved å kombinere en 1: 1: 1 blanding av 100x Pen-Strep: 1500 enheter aktivitet / ml kollagenase type III: 714 enheter aktivitet / ml hyaluronidase i PBS.
- Rist hakket omentum vevet som blir igjen etter at HPMC isolert ved 200 rpm, 37 ° C i 6 timer i 10 ml av 10x kollagenase type III oppløsning fortynnet i serumfritt medium (DMEM med 1% MEM vitaminer [93 mg / l], 1% MEM ikke-essensiell aminosyrer [81,4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin]). Fordøyd vev vil se ugjennomsiktig og kan ha noen fiber rusk (figur 2E).
- Sentrifuger løsning som inneholder NOFs celler i suspensjon på 0,5 x g i 3 minutter ved RT, Aspirer supernatanten og plate pelleten i en 75 cm2 kolbe i 13 ml komplett vekstmedium.
- Fjern gamle medier og erstatte med 15 ml frisk full vekst media etter 24 timer. NOF kan dyrkes i 1-3 dager før splitting. Note spredning av NOF vil opphøre når cellene når confluency.
- Bekrefte at de primære humane fibroblaster er flate, langstrakte celler og uttrykke vimentin, men ikke cytokeratin 8 ved å utføre immunhistokjemi 8 (figur 3B, D, F). Bruk lav-passasjen NOF for eksperimenter (helst før passering 3) for å minimere dedifferentiation og modifikasjon av original fenotype. Bruk en bred-feltet mikroskop med 20x objektiv med plast DIC evner for å ta alle fase bilder av celler,og et 10x objektiv i lyse feltet for å analysere immunohistokjemisk DAB farging.
2. Plating den organotypiske Kultur 8
- Frigjøring NOF fra 75 cm kulturflaske ved skylling med 10 ml PBS etterfulgt av 3 ml av 0,25% trypsin / 25 mM EDTA i ikke mer enn 5 min. Nøytraliser trypsin med minst 3 ganger volumet av hele vekstmedier.
- Overfør trypsinisert celler i et 50 ml konisk rør og spinne ned ved 0,5 gx 3 min. Fjern supernatant og bringe cellene tilbake opp i 5 ml full vekst media. Bruke en celleteller for å telle cellene gjenvunnet fra kulturflaske.
- Fortynn cellene i passende volum av full vekstmedier til platen 2000-4000 NOF per 100 ul på en svart, klarbunnet 96-brønns plate. Tilsett 0,5 ug / 100 ul rotte-hale collagen I til celleblandingen før utplating. La cellene sitter ved 37 ° C i 5% CO2 i en fuktig miljø i minst fire timer, eller inntil celleneå følge plateoverflaten.
- Slipp HPMC fra kulturflaske ved bruk av de samme metoder som er beskrevet i trinn 2.1 og 2.2. Fortynn cellene i passende mengde av full vekstmedier til platen 10000-20000 HPMC per 50 pl på toppen av NOF som allerede er belagt med kollagen I i 96-brønners plater. La cellene sitter ved 37 ° C i 5% CO2 i en fuktig miljø i minst 18 timer før begynnelsen eksperimenter.
- Kultur grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing HeyA8 eggstokkreft kreftceller i full vekst media. HeyA8 eggstokkreft kreftceller er fluoresceinmerket av uttrykk for en lentiviral vektor uttrykker hoppekreps cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 eggstokkkreftceller bør være 80-90% konfluent på bruksdagen (logaritmisk vekstfase). Slipp-celler fra kulturplaten og telle ved å bruke de samme metodene som beskrevet i trinn 2,1-2,2 for primære celler.
- Tillat eggstokkreft celler for å komme i full vekst medium i 15-20 minutter ved 37 ° C i enkonisk rør med lokket løst forseglet.
3. Adhesjon Assay 8
- Etter utvinning, pellet eggstokkreft celler ved å spinne i 3 min på 0,5 xg og fjern supernatanten og fortynne cellene i passende volum av serum-frie medier for å oppnå en konsentrasjon på 50.000 celler / 100 mL.
- Invertere 96-brønners plater med HPMC / NOF organotypiske kulturer for å fjerne brukt medium, og tilsett 100 ul av kreftcelle-suspensjon i serumfritt medium til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 5% CO2 i en fuktig miljø i 30 minutter til 4 timer.
- Invertere 96-brønners plate for å fjerne mediet og ikke-adherente celler. Bruk en flerkanals pipette på lav effekt for å nøye og forsiktig pipettér 100 mL PBS i hver brønn, og invertere plate igjen. Gjenta PBS vaskes en gang til.
- Invertere for å fjerne PBS og tilsett 100 ul 4% paraformaldehyd til hver brønn. La maskinen stå i 20 min å fikse cellene. Etter 20 min snus platen og tilsett 100 mL PBS.
- Legg merke til at den totale fluorescens av brønner kan rapporteres eller antallet celler kan kvantifiseres. For kvantifisering, første plate en standardkurve i duplikat ved å bruke HeyA8-celler ved en konsentrasjon på 1 million celler / ml.
- Gjør standardkurven ved å spinne ned 1 million celler, fjerne media, og gi dem muligheten til å sitte i en ml 4% paraformaldehyde i 20 min.
- Spin celler igjen og få opp i 1 ml PBS (recount celler for å bekrefte 1 million / ml konsentrasjon). Plate 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, og 0-cellene i hver brønn i duplikat, og legge til PBS i et sluttvolum på 50 total ul i hver brønn.
- Bottom lese kultur plate på en fluorescerende plate leser (eksitasjon = 488 nm, emisjon = 528 nm), skalering høye brønner (50.000 på standardkurve). Bruk standardkurven for å beregne hvor mange eggstokkreft celler festet til organotypic kultur i hver brønn (Figur 4A-C).
4. Proliferation Assay 10
- Etter at eggstokkkreftceller gjenvinne (se trinn 2.5 og 2.6 ovenfor), pellet cellene ved å spinne i 3 minutter ved 0,5 x g, og deretter fortynne cellene i passende volum av 1% FBS medium (DMEM med 1% FBS, 1% MEM vitaminer [93 mg / L], 1% MEM ikke-essensielle aminosyrer [81,4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin]) for å oppnå en konsentrasjon på 4000 celler / 150 pl.
- Invertere 96-brønns plate med HPMC / NOF organotypiske kulturer for å fjerne brukt medium, og tilsett 150 ul av kreftcellesuspensjon i 1% FBS medium til hver brønn. Inkuber platen ved 37 ° C i 5% CO2 i en fuktig miljø i 72 timer.
- Bunn les dyrkingsplaten på en fluorescerende plateavleseren en gang om dagen (eksitasjon = 488 nm, emisjon = 528 nm) for å evaluere den relative spredningav celler. Fortsett analysen i 96 timer, endring av mediet ved 48 timer (figur 5A-C). Vær forsiktig med å forstyrre den kulturen ved skifte media (snu platen er å foretrekke).
5. Invasion Assay 8
- Før plating 3D-kulturen, tilsett 7,5 ug rotte-hale kollagen I i 200 ul PBS til en 24-brønners dyrkingsplate innsatsen (8 um porestørrelse). La platen inkubatet O / N, deretter forsiktig fjerne PBS med en pipette umiddelbart før plating den HPMC / NOF organotypiske kultur på kollagen-belagt inserts (trinn 2 ovenfor).
- Forbered eggstokkreft celler som i trinn 3.1. Til plate de eggstokkreft celler på de organotypiske kulturer på innleggene, bruker nøye en pipette for å fjerne overflødig utskriftsmateriale fra toppen av innleggene. Tilsett 100 ul av eggstokkreft cellesuspensjonen i serum-fritt medium til hver brønn.
- Legg 750 mL av full vekst media inn i brønnen under innsatsen for å indusere kreft celle ivasion inn i organotypiske kulturer. Inkuber platen ved 37 ° C i 5% CO2 i en fuktig miljø i 24 timer.
Merk: Ovarian kreftceller som invaderer organotypiske kultur vil krysse innsatsen og forbli på undersiden av innsatsen. - Etter 24 timer, ta tak innsatsen med tang og kort skyll den i et beger med PBS, og deretter flytte innsatsen inn i en tom også. Skrubb toppen av hver innsats med begge sider av en bomullspinne for totalt 1 min. Raskt å plassere innsatsen i en plate inneholdende 750 ul 4% paraformaldehyd i hver brønn. La hver innsats å sitte i paraformaldehyde i 10 min før du overfører innleggene i brønner fylt med 750 mL PBS.
- Vise de invaderte celler (klebet, og er festet til bunnen av innsatser) med et mikroskop ved forstørrelse 2.5x. Når hele brønnen er innenfor synsfeltet, juster til 10x forstørrelse og ta 5 bilder, en i nærheten av midten og en i hver kvadrant av brønnen, unngåtar bilder som er for nær kantene. Følger samme mønster for hver brønn.
- Bruk produsentens program for å telle antall celler i hvert bilde for å få et gjennomsnittlig antall celler invaderte hvert felt i hver brønn (figur 6A-C) i henhold til deres fremgangsmåte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den organotypiske kultur ble satt sammen ved først å blande primære humane fibroblaster med kollagen type I og deretter overliggende dette kultur med 5 ganger antallet mesothelial celler. Kulturen ble inkubert i minst 18 timer før eggstokkreft celler ble tilsatt for å studere adhesjon, invasjon eller proliferasjon. Hvert forsøk ble gjentatt med flere (n = 3-5) 3D kulturer oppnådd fra forskjellige pasienter og en rekke brønner ble testet i hver tilstand for adhesjon (n = 5), proliferasjon (n = 5) og invasjons assays (n = 3) . Eggstokkreft celler festet til 3D organotypiske kultur etter 4 timers (figur 4), proliferated på kultur etter 72 timer (6 ganger HeyA8 celle dobling tid) (figur 5), og invaderte etter 24 timer (figur 6). Vedheft, spredning og invasjonen av HeyA8 eggstokkreft celler var inteavhengige (figur 4-6). Spesielt, den RGD peptidet og blokkering Antibodies til a 5 -integrin, β en -integrin og α v β 3 -integrin hemmet ovarian cancer celle adhesjon til organotypiske kultur, mens RAD-peptid, kontroll-antistoff og p 4 -integrin antistoffet ikke (figur 4) 10. I proliferasjonsanalyse, den RGD peptidet og blokkerende antistoffer til a 5 - og p en -integrin inhiberte ovariecancer celleproliferasjon på organotypiske kultur, mens RAD-peptid, kontroll-antistoff, α v ß 3 -integrin antistoff og P 4 -integrin antistoffet ikke (figur 5). I invasjonen analysen, til RGD peptidet og blokkerende antistoffer 5 a - og p en -integrin hemmet, mens α v β 3 -integrin antistoff forbedret eggstokkreft celle invasjon gjennom 3D-organotypiske kulturen. RAD-peptid, kontroll-antistoff, og β4 -integrin-antistoff ikke påvirker invasjon (figur 6). Sjelden vil disse assays bli un-tolkbare (dvs. α 5 -integrin blokkerende antistoff vil ikke hemme adhesjon, spredning eller invasjon sammenlignet med kontroll-antistoff). Tidligere er det funnet at visse organotypiske kulturer vil vaske bort ved endring av mediet eller PBS vasking under analysene. I tillegg, hvis eggstokkreft celler er døde eller ikke gjenvinnes lenge nok fra trypsin fordøye å re-uttrykke integriner, vil analysene ikke fungere. Derfor er det alltid viktig å ha en positiv og negativ kontroll i hvert forsøk, slik at kvaliteten av organotypiske kultur og eggstokk-kreft-celleanalyse kan vurderes. Som vist her, den RGD peptidet, a 5 -integrin og p en -integrin blokkerende antistoffer inhiberte all eggstokkreft celleadhesjon, invasjon og proliferasjon til organotypiske kulturen og kan brukes som positive controller i framtidige analyser. Likeledes β 4 -integrin blokkerende antistoff ikke påvirker ovarial cancer celle adhesjon, invasjon og proliferasjon til organotypiske kultur og kan bli brukt som en negativ kontroll i senere analyser.
Figur 1. Histologi av humant omental metastasering. Hematoxylin og eosin flekk av (A) normal human omentum (MC, mesothelial celler, Fib, fibroblaster, Adi, adipocytter) og (B) ovarian cancer omental metastase (Met, eggstokk-kreft metastase). Bar i paneler = 100 mikrometer i lengde. (C) Skjematisk av 3D organotypiske modell av eggstokkreft metastase hermet tidlig eggstokkreft celle metastaser til overflaten av den menneskelige omentum. Klikk her for å se et større version av dette tallet.
Figur 2. Isolering av primære humane celler omentfaktorene. (A) Et stykke av omentum oppsamles ved kirurgi i PBS og transportert til laboratoriet. Vevet blir pelletert ved 0,5 xgx 3 min og overført til frisk PBS. (B) den del av omentum blir overført til en 10 cm petriskål, vasket med PBS, og skalpeller brukes til å skjære omentet i små stykker (0,5 cm 3 ). (CD) Vevet stykkene er samlet ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette og overført til et 50 ml konisk rør for isolering av HPMC. PBS er fjernet fra røret og HPMC er pelletert fra PBS en 0,5 x g ved 37 ° C. (MC, mesothelial celler, RBC, røde blodlegemer, Fib, fibroblaster) (E) NOF er isolert fra remaini ng omental vev etter inkubering med hyaluronidase og kollagenase type III. Bildet viser vev etter en 6- til 12-timers fordøyelsen. NOF er pelletert ved å spinne på 0,5 xg ved RT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Karakterisering av HPMC og NOF isolert fra humant vev omentum. Bilder Fase-kontrast av (A) mesothelial celler (HPMC) og (B) fibroblaster (NOF) etter isolering fra omentum vev. Menneskelig HPMC farget for (C) cytokeratin 8 og (E) vimentin. Menneskelig NOF farget for (F) vimentin, men gjorde ikke skam for (D) cytokeratin 8. Bar = 100 mikrometer, gjelder for alle paneler.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ovariekreft celle adhesjon til organotypiske kultur er integrin-avhengig. (A) Adhesjonen Analysen ble utført med 50000 fluoresceinmerkede eggstokkreft celler, HeyA8 celler, som beskrevet i protokoll delen. Den samlede fluorescens i hver brønn er rapportert. Kontroll-antistoffet er muse-IgG. Hver søyle representerer middelverdien +/- standard feil gjennomsnittet. Representative (B) fase-kontrast og (C) fluorescerende bilder av ovarial cancer celle adhesjon til organotypiske kulturen. Bar = 100 mikrometer, gjelder begge panelene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Ovariekreft celleproliferasjon på organotypiske kultur er integrin-avhengig. (A) proliferasjonsanalyse ble utført med 4000 fluoresceinmerkede eggstokkreft celler, HeyA8 celler, som beskrevet i protokoll delen. Det totale antall celler er rapportert. Kontroll-antistoffet er muse-IgG. Hver søyle representerer middelverdien +/- standard feil gjennomsnittet. Fusjonerte fase-kontrast og fluorescerende bilder av ovariecancer celleproliferasjon på organotypiske kulturen ved (B) og 24 (C) 96 timer. Bar = 100 mikrometer, gjelder begge panelene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
Figur 6. Ovariekreft invasjon gjennom organotypiske kulturen er integrin-avhengig. (A) invasjonen Analysen ble utført med 40000 fluoresceinmerkede eggstokkreft celler, HeyA8 celler, som beskrevet i protokoll delen. Antallet invaderende celler (beveget seg gjennom 3D-kulturen til bunnen av innsatsen) er rapportert. Kontroll-antistoffet er muse-IgG. Hver søyle representerer middelverdien +/- standard feil gjennomsnittet. (B) Fase-kontrast og (C) fluorescerende bilder av eggstokkreft celler som invaderte gjennom organotypiske kultur. Bar = 100 mikrometer, gjelder for alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En organotypiske modell av peritoneal mikromiljøet ble etablert for å vurdere individuell og kollektiv funksjon (er) av både de cellulære og medfødte komponenter i mikromiljøet i eggstokkreft formidling. De spesifikke protokoller for plating og tilpasse 3D organotypiske kultur for å undersøke eggstokkreft celle adhesjon, spredning, og invasjonen er gitt. Primære humane omentfaktorene mesothelial celler og fibroblaster ble isolert fra pasienter og brukes på et tidlig passasje for å opprettholde normal morfologi og pasientvariasjon. I denne modellen ble omentfaktorene normale fibroblaster og ECM (typisk kollagen type I), lagvis med en primær human mesothelial celle monolag. Denne modellen histologisk ligner peritoneal fôr, og tillater oss å gjenskape og undersøke viktige hendelser i eggstokkreft metastase inkludert eggstokkreft celle adhesjon, spredning, og invasjonen 8,27.
Tidligere begrenset 3D-modeller harer etablert for å undersøke eggstokkreft interaksjoner med mikromiljøet 13,14,21-25, mens denne 3D organotypiske modellen er den første til å gjenskape byggingen av mesothelial-slimhinnen i bukhulen. Den menneskelige omentum er samlet inn fra pasienter som varierer i alder og helsetilstand. Helsen til vevet direkte påvirker mesothelial celle- og fibroblast isoleringsmetoder. Den sunnere vev vises lysere i fargen med svært små lobules (1-3 mm) sammenlignet med vev som er mer oransje i fargen med store lobules stede (> 5 mm). Flertallet av HPMC Slough off i den innledende PBS som vevet føres fra kirurgi til laboratoriet. Sunnere vevet imidlertid mer elastisk HPMC skal fjernes, og ytterligere PBS-vaskinger, og 1: 1 PBS: trypsin digest kan resultere i en blandet kultur av HPMC og NOF celler. I sunnere vev, kan noen HPMC overleve 6-timers kollagenase fordøye, og et sammendrag O / N i 1x kollagenaseoppløsning i sin helhetvekstmedier er anbefalt for å oppnå en ren NOF kultur. Legg merke til omentum må plasseres umiddelbart i PBS ved fjerning eller ingen HPMCs vil bli utvunnet fra vev. Videre, hvis vevet er lagret i PBS i en lengre tidsperiode (> 2 timer) ved romtemperatur eller i et kjøleskap, antallet levedyktige HPMCs isolerte er betydelig redusert.
En 1: 5-forhold på fibroblaster til mesothelial celler er belagt for å etterligne forhold av fibroblaster til mesothelial celler in vivo 8. Det er viktig å merke seg at størrelsen av isolerte mesothelial celler varierer fra pasient til pasient, og dette kan kreve justering av pletteringsgrad. Mesothelial celler av noen pasienter er mye mindre; i disse tilfellene, vi plate dobbelt så mange mesothelial celler (20.000). I tillegg er de primære cellene alltid brukt på et tidlig (1-2) passasje for å bevare morfologien. Mesothelial celler kan være cuboidal eller spinkle, og cuboidal mesothelial celler blir mer spinkelsom de er passert, eller med større eksponering mot kondisjonert medium fra eggstokkreft celler eller behandling med TGFp 10.
Eggstokkreft celler kan forholde seg til og invadere gjennom mesenchymale mesothelial cellene mer effektivt enn de epiteliale mesothelial celler fra samme eller forskjellige pasienter. Vanligvis setter vi opp organotypiske kultur i 18 timer før du starter de funksjonelle analyser med eggstokkreft celler. De lengre mesothelial celler og fibroblaster dyrkes sammen, jo mer tid de har til å skille ut forskjellige proteiner inkludert ECM proteiner, som kan påvirke atferden til eggstokkreft celler. En annen viktig faktor å ta hensyn til ved utførelse av disse analyser er differensialformeringshastigheten og ekspresjonsnivå av proteiner forbundet med øket adhesjon, invasjon og / eller proliferasjon, herunder griner, proteaser, og vekstfaktorer, i hvert kreftcellelinje eller primære humane cancercelletyper.Tiden og antall kreftceller anvendt i hver av de funksjonelle analyser med organotypiske kulturen må optimaliseres for hver kreftcellelinje eller type av primær kreftcellen. For eksempel, i den beskrevne adhesjonsassayet, kan eggstokkreft celler være invaderer kulturen i løpet av denne tiden.
Det er tydelig at dette organotypiske modellen inneholder alle komponentene i den normale peritoneale mikromiljøet som immun, endoteliale og adipocyttuttrykte celler. I tillegg avhenger av modell på tilgjengelighet og tilgjengelighet av primær menneskelig vev, som den primære celler brukes bare i løpet av de tre første passasjer. Imidlertid har modellen mange fordeler i bruken av primære humane celler og inkorporering av flere celletyper som er blitt demonstrert å spille en viktig rolle i metastasering. Denne modellen er blitt brukt til å undersøke genet og proteinet regulering i de enkelte celletyper (dvs. kreftceller, normal mesothelial eller fibroblast-celler) etterko-kulturen. Spesielt rollene til c-Met-28, MMP-2 9,29, E-cadherin 30, β en -integrin 10, p 3 -integrin 16, a 5 -integrin 10,31, og fibronektin 10 tidlig metastaser har blitt utforsket. I tillegg har modellen potensial til å utvides til å omfatte flere celletyper, slik som inkorporering av adipocytter 6. Modellen har blitt endret og miniatyrisert for bruk i high-throughput screening for å identifisere små molekyl hemmere av eggstokkreft celle adhesjon / invasjon til peritoneal mikro 27. Fremtidige anvendelser av denne modellen vil omfatte inkorporering av immunceller i analysen, inkludert makrofager for mekanistiske undersøkelser og high-throughput screening. Oppsummert gir organotypiske cellekultur en nyttig modell for å vurdere samspillet mellom det menneskelige peritoneal mikromiljøet og eggstokkreft celler, med goal belyse viktige molekylære mekanismer for formidling og sykdomsutvikling, og identifisere potensielle terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A.
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E.
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
