Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحريض دولة ISOELECTRIC الدماغ المعنية بالتحقيق في أثر الذاتية متشابك آخر على العصبية استثارة Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

هذا الإجراء يؤدي طويلة الأمد في الجسم الحي تسجيلات داخل الخلايا من الخلايا العصبية واحدة خلال الدول الدماغية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وبعد الإلغاء التام للأنشطة الكهربائية المستمرة، مما أدى إلى حالة الدماغ كهرساوي. تتم مراقبتها الثوابت الفسيولوجية للحيوان بعناية خلال الانتقال إلى حالة غيبوبة اصطناعية.

Abstract

تعتمد معالجة المعلومات بطريقة الخلايا العصبية على حد سواء على خصائص الغشاء الجوهرية وعلى ديناميات شبكة متشابك وارد. ولا سيما، نشاط الشبكة ولدت التطور الطبيعي، الذي يختلف بقوة بوصفها وظيفة من حالة اليقظة، ينظم بشكل كبير العصبية حساب. للتحقيق في مدى اختلاف تؤثر ديناميات الدماغية عفوية الخصائص التكاملية الخلايا العصبية واحدة "، وضعنا استراتيجية التجريبية الجديدة في الفئران التي تتكون في قمع المجراة عن النشاط الدماغي عن طريق الحقن النظامية من جرعة عالية من الصوديوم بنتوباربيتال. وتباطأ الأنشطة القشرية، المراقبة المستمرة من قبل مخطط كهربية قشر الدماغ جنبا إلى جنب (ECoG) والتسجيلات داخل الخلايا تدريجيا إلى أسفل، مما أدى إلى الملف الشخصي كهرساوي ثابت. هذه الدولة الدماغ المتطرفة، ووضع الفئران في غيبوبة عميقة، تم رصدها بعناية عن طريق قياس الثوابت الفسيولوجية للحيوان في جميع أنحاء التجارب. ص الخلايايسمح ecordings لنا لتوصيف ومقارنة خصائص متكاملة من نفس الخلايا العصبية جزءا لا يتجزأ في ديناميات القشرية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، مثل تلك التي واجهتها في دورة النوم واليقظة، وعندما كان الدماغ صامت تماما.

Introduction

في غياب أي محفزات البيئية أو المهام السلوكية، و "يستريح" الدماغ يولد تيار مستمر من النشاط الكهربائي التي يمكن تسجيلها من فروة الرأس، كما الكهربي (EEG) الأمواج. يتميز المضاهاة بين الخلايا من هذا النشاط الدماغي الذاتية بتقلبات غشاء خلفية الجهد (المعروف أيضا باسم "الضوضاء متشابك")، التي تتكون من مزيج من إمكانات متشابك مثير والمثبطة التي تعكس النشاط المستمر للشبكات وارد 1،2. يختلف هذا النشاط العفوي في التردد والسعة مع دول مختلفة من اليقظة. توضيح تأثير نشاط الشبكة على استثارة واستجابة الخلايا العصبية واحدة هي واحدة من التحديات الرئيسية في العلوم العصبية 3،4.

واستكشفت العديد من الدراسات التجريبية والحسابية تأثير وظيفي من النشاط متشابك المستمر على ممتلكاتهم التكامليالصورة من الخلايا العصبية. ومع ذلك، فإن دور المعلمات العصبية المختلفة التي تأثرت الضوضاء الخلفية متشابك لا يزال بعيد المنال. على سبيل المثال، تم العثور على مستوى متوسط ​​من الاستقطاب غشاء إيجابيا أو سلبيا 5،6 7-9 المترابطة مع القدرة المدخلات الحسية لتحريك إمكانات العمل. وعلاوة على ذلك، في حين تشير بعض التحقيقات التي تقلبات غشاء المحتملة الناتجة عن تيار متفاوتة بشكل مستمر من مدخلات متشابك وارد، تؤثر بقوة على استجابة الخلايا العصبية واحدة عن طريق تحوير كسب العلاقة بين المدخلات والمخرجات الخاصة 3،10-13، والبعض الآخر يشير إلى أن التغييرات في تصرف غشاء المدخلات بوساطة تحويلة تثبيط كافية لتعديل ربح العصبية بغض النظر عن حجم التقلبات غشاء 14،15. وأخيرا، أكدت دراسات حديثة أجريت على الحيوانات المستيقظة كيفية معالجة المعلومات الحسية في الخلايا العصبية واحدة يعتمد بشكل حاسم على حالة من اليقظة لالثانية السلوكي الحالي 16،17 الطلب.

استراتيجية واضحة لإلقاء الضوء على الدور الوظيفي للعملية معينة في نظام مترابط للغاية في تحديد كيف غيابها يغير وجه التحديد أداء النظام. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع في الأبحاث علم الأعصاب، على سبيل المثال باستخدام الآفات التجريبية أو تعطيل للمناطق الدماغ المختلفة 18-21، أو الحصار الدوائي من القنوات الأيونية محددة 22،23. والجدير بالذكر، وقد تم تطبيقه في الجسم الحي لكشف النقاب عن الكيفية التي تؤثر بها وظيفية الاتصال وشبكة ديناميكية خلية واحدة حساب 24-27. ومع ذلك، لتاريخ التلاعب المحلية تهدف إلى منع إطلاق الخلايا العصبية و / أو التشويش على الخصائص الفيزيائية الحيوية الأساسية يمكن أن تكون فعالة جزئيا وتقتصر على كميات الدماغ صغيرة نسبيا (28).

للتغلب على هذه القيود، وضعنا الجديد في المنهج التجريبي المجراة فيالفئران على مقارنة الخصائص الكهربية للخلايا العصبية واحدة سجلت في حالة دماغية معينة، أي جزءا لا يتجزأ من شبكة معينة ديناميكية، لتلك التي حصلت بعد القضاء الكامل علي كامل الدماغ النشاط متشابك 29. في الظروف السيطرة، يمكن أن تتولد اثنين ديناميات القشرية متميزة. استميلت أنماط مثل النوم electrocorticographic (ECoG) عن طريق الحقن جرعات معتدلة من بنتوباربيتال الصوديوم. بدلا من ذلك، موجات ECoG سريعة من السعة صغيرة مقارنة بالنشاط القشرية الكامنة وراء حالة اليقظة (مثل الاستيقاظ نمط) يمكن أن تنتج عن طريق الحقن من الفنتانيل. وفي وقت لاحق، مع الحفاظ على نفس ECoG وتسجيل داخل الخلايا، تم الحصول على إسكات كاملة من الذاتية نشاط الدماغ الكهربائي عن طريق الحقن النظامية من جرعة عالية من الصوديوم بنتوباربيتال، وتتميز ECoG كهرساوي والأنشطة داخل الخلايا. لأن تحريض مثل هذه غيبوبة المتطرفة يحتمل أن يكون consequen قاتلةالمجال الاقتصادي الموحد على الوظائف البيولوجية، وكان الرصد الدقيق والمستمر من المتغيرات الفسيولوجية الأساسية. لذلك، تابعنا بدقة وتيرة ضربات القلب، وCO 2 تركيز نهاية المد والجزر (اتكو 2)، تشبع O 2 (مكتب التخطيط الاستراتيجي 2) ودرجة الحرارة الأساسية من الفئران في جميع أنحاء التجارب.

نحن تقييم خصائص الخلايا العصبية واحدة خلال هذه الدول مختلفة باستخدام الميكروية حادة، والتي هي مناسبة بشكل خاص للتسجيلات طويلة ومستقرة في الجسم الحي. الإجراء الموضح هنا، يمكن الجمع بين النهج الكهربية والتصوير الأخرى، ويمكن أن تمتد إلى النماذج الحيوانية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي) والتي وافقت عليها اللجنة الأخلاقية تشارلز داروين في التجارب على الحيوانات. نحن هنا وصف الإجراء نستخدمها بشكل روتيني في مختبرنا، ولكن معظم الخطوات التي يمكن تكييفها لتتناسب مع الاحتياجات المحددة الجميع.

1. إعداد الجراحي

ملاحظة: جميع نقاط شق والضغط يجب أن تسلل مرارا مع مخدر موضعي (ليدوكائين أو بوبيفكين). الإجراء الحالي هو محطة، إذا كان مطلوبا لإعداد العقيم وينبغي تنفيذ العديد من التعديلات.

  1. تخدير الفئران مع بنتوباربيتال الصوديوم (40 ملغ / كلغ) والكيتامين (50 ملغ / كلغ) في اثنين داخل الصفاق فصل محليا الحقن (IP).
  2. السماح للحيوان يذهب تحت التخدير العام وبشكل متكرر تحقق من أن طائرة من التخدير الجراحي يتم تحقيق (أي رد فعل حتى أخمص القدمين معسر). وضع فأر على الحديدedback التدفئة بطانية وإدراج التحقيق المستقيم للحفاظ على درجة الحرارة الأساسية حول 37 درجة مئوية.
  3. وضع القسطرة في التجويف البريتوني لتسهيل الحقن لاحق وكلاء مخدر وتجنب تثقيب الأجهزة التي كتبها ثقوب الإبر المتكررة 30.
    1. مقطع الشعر على مدى صغيرة (~ 2-3 ملم) منطقة فوق المنطقة التي تقع داخل المربع السفلي الأيمن أو الأيسر من المعدة.
      ملاحظة: يمكن أيضا كريم مزيل الشعر يمكن استخدامها.
    2. جعل 2 - ملم شق 3 على الجلد مع مقص حاد أو مشرط. عن طريق تشريح حادة، وإزالة طبقات الدهون والعضلات حتى لوحظ التجويف البريتوني.
    3. إدراج حول 1-2 سم من قسطرة صغيرة في تجويف وإغلاق الجرح مع الغراء الجراحية.
      (. على سبيل المثال، 2 الفرنسية - الموافق 0.043 مم داخل القطر): ملاحظة قطر ويبلغ طول القسطرة يجب أن يكون الحد الأدنى للحد من كميات الميتة. أنابيب البولي يوريثين هي الأكثر ملاءمة.
    4. جعل حلقة وخياطة رانه القسطرة لالجلد لضمان الحصول عليها في المكان.
  4. تثبيت أنبوب القصبة الهوائية للسيطرة على التهوية أثناء التنفس الاصطناعي.
    1. أما بالنسبة للخطوة السابقة، وإعداد مجال الاهتمام (1-2 سم خلال القصبة الهوائية الحق فوق المقبض)، وإزالة الشعر وشق الجلد.
    2. بلانت تشريح الطبقات الأولى من الدهون والعضلات، ثم نقل الغدة اللعابية جانبا وفضح القصبة الهوائية عن طريق تشريح بلطف الطبقة الأخيرة من العضلات.
    3. بعناية إزالة الأنسجة على القصبة الهوائية، وحرك الخيط أدناه باستخدام ملقط صغير. جعل عقدة الجراح مع موضوع ولكن لا ضيق حتى الآن.
    4. شق القصبة الهوائية عرضيا بين حلقتين الغضروفية. الدم مسحة في القصبة الهوائية إن وجدت.
    5. ادخال انبوب في القصبة الهوائية مع القطر المناسب وتشديد عقدة الخيط لتأمين أنبوب ثابت. للاستقرار إضافية للموضوع يمكن كذلك تعلق في أعلى نقطة من أنبوب القصبة الهوائية.
    6. Suturه الجرح قريب أو استخدام الدبابيس الجراحية. تجنب الغراء الجراحية هنا إذا كان الغرض من أنبوب القصبة الهوائية لإعادة استخدامها.
  5. تثبيت الحيوان في إطار التجسيمي وترصد بدقة المتغيرات الفسيولوجية التالية: ECoG، مكتب التخطيط الاستراتيجي 2، اتكو 2، معدل ضربات القلب (عن طريق رسم القلب، تخطيط القلب) ودرجة الحرارة الداخلية. مراقبة وضبط هذه المتغيرات للحفاظ على عمق مناسب من التخدير والحالة الفسيولوجية. على وجه التحديد، تكملة التخدير بجرعة صغيرة (10 ملغ / كلغ) من الصوديوم بنتوباربيتال إذا لزم الأمر.
  6. تطبيق مرهم العين في كلتا العينين لتجنب جفاف. مقطع الشعر على فروة الرأس، وجعل شق طولي (~ 2 سم) وبتر الأنسجة الضامة التي تغمر الجمجمة باستخدام مشرط أو مجرفة.
  7. جعل صغيرة (~ مم 1.5) حج القحف على المنطقة في المصالح مع حفر الأسنان.
    ملاحظة: هنا، مجال برميل من القشرة الحسية الجسدية الأولية يستهدف (7-8 ملم الأمامي إلى خط interaural، 4.5- 5.5 مم الوحشي على خط الوسط 31). شطف مرارا وتكرارا لتبديد الحرارة.
  8. استخدام ملقط خارج غرامة لجعل بلطف ثقب صغير في الجافية. حجز المنطقة ~ 0.5 مم في كسر الجمجمة لوضع القطب ECoG (راجع الخطوة التالية). تبقى بشكل دائم القشرة رطبة مع 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم (أو الاصطناعي السائل الدماغي الشوكي).
  9. وضع مقاومة منخفضة (~ 60 أوم) الفضة القطب (القطب ECoG) على الجافية، وتجنب المنطقة القشرية وليس من قبل السحايا تغطيتها، ووضع القطب إشارة على عضلة فروة الرأس على الجانب الآخر من الرأس.
  10. في هذه المرحلة (30 دقيقة بعد حقن بنتوباربيتال الصوديوم الماضي)، والحفاظ على التخدير عن طريق الحقن المتكرر للبنتوباربيتال الصوديوم (10-15 ملغ / كغ / ساعة) أو الفنتانيل (3-6 ميكروغرام / كغ / ساعة) عن طريق القسطرة IP. السابق سوف يؤدي إلى بطء متذبذبة،، نمط ECoG مثل النوم في حين أن هذا الأخير سوف يؤدي إلى غير متزامن، والاستيقاظ مثل، لمحة القشرية.
  11. ضبط الخامس الاصطناعينظام entilation ذلك أن وتيرة التنفس والحجم هي مماثلة لتلك التي من الفئران في التنفس التلقائي (المعدل الطبيعي 70-115 التنفس / دقيقة 32). ثم، ربط التهوية الميكانيكية إلى أنبوب القصبة الهوائية والتحقق من التضخم القفص الصدري الصحيح (على الجانبين). إن لم يكن، وضبط الموقف من أنابيب التهوية في محور القصبة الهوائية. إذا لزم الأمر، تمتص إفراز الحالي في القصبة الهوائية مع قسطرة متصلة حقنة أو مضخة فراغ.
  12. وإذا كان كل المتغيرات الفسيولوجية 32-35 وECoG 29،36 أنماط تعكس طائرة الجراحية مستقرة التخدير، لا الحقن العضلي من triethiodide غالامين في كل ساق على شل الفئران، 40 مغ / كغ للالحقنة الأولى ثم 20 ملغ / كغ ، كل 2HR 19،29،36،50.

2. بين الخلايا تسجيلات

  1. سحب micropipette الزجاج (مسرى مكروي حاد) مع ~ 0.2 ميكرومتر غيض مثل مقاومته تتراوح بين هذا وذاكن 50 و 80 MΩ شغل مرة واحدة مع 2 M خلات البوتاسيوم (شركة الخطوط الجوية الكويتية).
  2. وضع ماصة في حامل خاص مع الفضة / الفضة كلوريد (حج / أجكل) سلك ربط الحل ماصة للمكبر للصوت داخل الخلايا (عن طريق مرحلة الرأس). يجب أن يرفق صاحب لmicromanipulator. وضع القطب المرجعية حج / أجكل على عضلات الرقبة وفأر.
  3. إدراج ببطء ماصة في الدماغ وصولا الى المنطقة من اهتمام والتحقق من المقاومة عن طريق مراقبة الجهد قطرات ردا على الخطوات الحالية. استخدام الطنانة (أو انطلق) زر مكبر للصوت لمسح ماصة إذا لزم الأمر.
  4. استخدام قطعة قطن أو مثلثات امتصاص الاصطناعية لتجف حج القحف (الحرص على عدم لمس ECoG أو الأقطاب داخل الخلايا) قبل تغطي مع المطاط الصناعي السيليكون أو 4٪ الاغاروز للحد من تحركات الدماغ.
  5. انخفاض ماصة في 1-2 ميكرون الخطوات حتى زيادة مقاومته عندما تقترب من الخلية. ثم استخدم وظيفة شرب حتى الثمالة من مكبر للصوت لpenetraالشركة المصرية للاتصالات في الخلايا العصبية.

3. الحث على الدولة ISOELECTRIC

  1. أداء بروتوكول تجريبي المناسب (على سبيل المثال، والتيارات اطلاق الردود على حقن داخل الخلية، والعلاقات الجهد الحالي، والاستجابات المحفزات الحسية) في هذه المرحلة في وقت واحد في حين رصد إمكانات غشاء العصبون، وECoG والمتغيرات الفسيولوجية.
  2. تأكد من أن القطب داخل الخلايا مستقرة في الخلية من خلال تحليل ثبات كل من غشاء المحتملة والعمل الخصائص المحتملة في جميع أنحاء تسجيل الدورة. إن لم يكن، لا تذهب إلى الخطوة التالية وانتظر حتى يصبح تسجيل مستقرة مرة أخرى أو البحث عن الخلايا العصبية آخر.
  3. حقن جرعة عالية ولكن الأشعة تحت قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم (~ 90 مغ / كغ، يمكن أن تكون منخفضة مثل 35 مغ / كغ من الشرط الأولي بنتوباربيتال وتصل إلى 155 ملغ / كغ من الشرط الأولي الفنتانيل) عبر خط IP.
    ملاحظة: في غضون 15-20 دقيقة من داخل وECoG وايجب veforms تبطئ مع الصمت الكهربائية المتقطعة للوصول عابر ما يسمى ب "انفجار-قمع" ملف 37،38، الذي ينهار تدريجيا إلى حالة تساوي الكهربية كاملة. ومن المتوقع أن معدل ضربات القلب تبطئ بشكل كبير (من قبل ~ 10-20٪) ولكن مكتب التخطيط الاستراتيجي (2) واتكو 2 يجب أن تبقى ثابتة نسبيا.
  4. إذا لم يتم التوصل إلى حالة تساوي الكهربية، حقن كمية صغيرة من الصوديوم بنتوباربيتال (~ 10٪ من الجرعة خطوة 3.1). انتظر 15 دقيقة قبل أن يضيف المزيد من مخدر إذا كان لا يزال لم تحقق الدولة كهرساوي.
  5. كرر بروتوكول تجريبي لمقارنة تأثير ديناميات الشبكة على الخصائص التكاملية الخلايا العصبية المسجلة في.
    ملاحظة: بعد وقف حقن التخدير، يجب على نشاط الدماغ الكهربائي يتعافى تماما في غضون 3 إلى 4 ساعات.
  6. في نهاية التجربة، وضخ جرعة قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم (200 ملغ / كغ، IP) إلى الموت ببطء الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حمل والحفاظ على حالة الدماغ كهرساوي هو حساسة في الجسم الحي إجراء التجارب. وقد ثبت أن تكون أداة قوية لدراسة مباشرة لتأثير نشاط الشبكة القشرية على استثارة الخلايا العصبية وظيفة نقل 29 الشكل 1 يدل على مراقبة متعددة المعلمة، بما في ذلك ECoG والثوابت الحيوية، من الحالة الفسيولوجية للحيوان قبل (الشكل 1A ) وبعد (الشكل 1B) تحريض الدولة كهرساوي.

الشكل 1
الشكل 1. رصد المعلمات الفسيولوجية في مراقبة والشروط ISOELECTRIC.
ألف وباء والتسجيلات في وقت واحد من ECoG (أعلى آثار) والقياسات الفسيولوجية أثناء حالة نشطة القشرية (A) والغواصاتفترة كهرساوي equent (B). درجة الحرارة الأساسية (درجة الحرارة)، اتكو 2 ومكتب التخطيط الاستراتيجي 2 مستقرة أساسا في كافة مراحل التجربة. معدل ضربات القلب، في المقابل، يقلل تدريجيا بعد تحريض الدولة كهرساوي (382-349 نبضة / دقيقة)، كما نشاهد في تخطيط القلب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خلال جلسات السيطرة، وكانت المعلمات الفسيولوجية مماثلة لتلك التي تقاس في الحيوانات السليمة ومستيقظا 32-35 وظلت تتأثر بعد تحريض الدولة كهرساوي، باستثناء معدل ضربات القلب الذي تباطأ قليلا إلى أسفل (الشكل 1). هذا هي نقطة مهمة منذ نقص الأكسجة 39 أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم 40 يمكن أن يغير بشكل ملحوظ استثارة الخلايا العصبية وبالتالي يمكن أن يعرض وجود تحيز خطير في استيلاد ذ استكشاف التشكيل الدولة التي تعتمد على الدماغ من الخصائص التكاملية العصبية.

حصلنا على الوضع كهرساوي من نوعين مختلفين من الشروط الأولية محاكاة ديناميات القشرية ولدت-التطور الطبيعي خلال المراحل المبكرة من النوم (الشكل 2AA، لوحة اليسار) أو أثناء اليقظة (الشكل 2AB، غادر لوحة). وكانت هذه الدول النشطة سواء الناجم عن حقن بنتوباربيتال الصوديوم (النوم مثل) أو الفنتانيل (الاستيقاظ مثل). في كلتا الحالتين، أدى حقن لاحق من جرعة عالية من الصوديوم بنتوباربيتال في القضاء التام على النشاط العفوي في ECoG والخلايا العصبية سجلت في نفس الوقت (الشكل 2AA وب، ​​لوحات اليمين)، وبالتالي ISOELECTRIC المدى. قمع النشاط متشابك المستمر أدى إلى فرط ثابت كبير من إمكانات غشاء الخلايا العصبية (الشكل 2B).

ر "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 2
الشكل 2. عواقب قمع آخر متشابك على حيوية عفوية من غشاء المحتملة.
(A) التسجيلات التمثيلية في وقت واحد من ECoG (أعلى آثار) والأنشطة داخل الخلايا (داخل وآثار أسفل) أثناء النوم مثل (A أ) والاستيقاظ مثل (A ب) أنماط (لوحات اليسار)، وخلال العهود كهرساوي اللاحقة المقابلة (في الأوقات المحددة بعد الحقن القمعية، ISOELECTRIC، لوحات اليمين). ويصور بقشور اللون - تحليل وقت التردد إشارات ECoG (هرتز نطاق تردد 50 كثافة الطاقة لل0). الكثافة (ب) احتمال (P) للقيم المحتملة الغشاء (VM، حجم الصندوق 0.5 فولت و 10 ثانية من التسجيل) من الخلايا العصبية هو موضح في لوحة A. لقد تم تعديل هذا الرقم، بإذن من المرجع 29./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتوضيح تأثير وظيفي لهذه الدولة الدماغ القصوى فإننا نرى استخراج الخصائص الذاتية السلبية والإيجابية للخلايا العصبية كهرساوي وقارنوها بتلك التي قيست خلال الشرط الأولي المقابلة. باستخدام هذه الاستراتيجية، لقد أظهرنا أن الخلايا العصبية ويمكن اطلاق النار إمكانات العمل ردا على حقن الخلايا من depolarizing الحالية أثناء حالة تساوي الكهربية، مما يدل على أنها لا تزال منفعل تماما حتى بعد القضاء الكامل علي خلفية النشاط متشابك (الشكل 3AA وب، ​​ISOELECTRIC). وعلاوة على ذلك، وجدنا أن وظيفة نقل الخلايا العصبية، وتقييمها، من خلال قياس وتيرة اطلاق الناجم عن خطوات depolarizing الحالي لزيادة كثافة (العلاقة FI)، كانت على حق-تحولت بالمقارنة مع ظروف نشط الأولية، مشيرا إلىانخفاض في حساسية الخلايا العصبية إلى ضعف المدخلات مثير (الشكل 3B). الربح العصبية، أي انحدار منحنى FI المقابل، بقي دون تغيير أو تم تخفيض عندما كانت الدولة تحكم من sleep- أو الاستيقاظ من نوع، على التوالي (الشكل 3B). والمثير للدهشة، لم يكن تعديل المقاومة مساهمة واضحة من الخلايا العصبية بشكل كبير في غياب محرك متشابك بالمقارنة مع سيطرة الظروف النشطة (الشكل 3AA ب،). المزيد من النتائج، بما في ذلك التحليل السكاني وتقدير من أنماط اطلاق الزمنية من الخلايا العصبية في ظروف نشط وتساوي الكهربية، وتتوفر في ورقتنا الأولية 29.

الشكل (3)
الشكل 3. مقارنة تأثير أنماط ثلاثة القشرية آخر على خصائص الغشاء والعلاقات المدخلات والمخرجات.
(A) الفولت ردود ه (آثار الوسطى) من العصبونات القشرية الحسية الجسدية لdepolarizing والبقول الحالية hyperpolarizing (آثار أسفل) أثناء النوم مثل (A أ) والاستيقاظ مثل (A ب) أنماط ECoG (أعلى السجلات) وبعد الحرمان من النشاط متشابك (ISOELECTRIC ). وقد تم قياس غشاء المقاومة الإدخال (R م، يشار إلى القيم) من قطرات الجهد (آثار الرمادية، متوسطات 20 تجارب) الناجم عن الحقن نبض الحالية hyperpolarizing (-0.4 غ). (ب) منحنيات FI المقابلة، وتوفير وظيفة نقل الخلايا العصبية هو موضح في لوحة (A). وقد تم قياس معدل إطلاق النار ردا على depolarizing البقول الحالية (200 ميللي ثانية مدتها) لزيادة كثافة. تم تطبيق كل شدة التيار 20 مرة، وبلغ متوسط ​​معدلات اطلاق المقابلة. الخطوط المتقطعة تشير إلى استجابات الخلايا هو مبين في (A). تم تعديل هذا الرقم، بإذن من المرجع 29.تحميل / 53576 / 53576fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا وصف طريقة جديدة لقمع المجراة عفوية النشاط الكهربائي الدماغي في كل شبكة ومستويات الخلايا. هذا الإجراء يؤدي إلى حالة الدماغ المتطرفة، والمعروفة باسم غيبوبة كهرساوي 41. من جهة نظر سريرية، مثل هذا الخمول electrocerebral هو شذوذ الأكثر الشديد الذي يمكن أن ينظر إليه على EEG. ويرتبط في الغالب مع غيبوبة لا رجعة فيها، مع جميع المرضى إما الموت أو الاستمرار في حالة غيبوبة مستمرة 42، ولكن يمكن عكسه جزئيا على الأقل عندما الناجم عن التسمم بالأدوية نظام اكتئاب العصبي المركزي (مثل ثيوبنتال)، وانخفاض حرارة الجسم عرضي 42 أو الاختناقية السكتة القلبية 43. في النموذج التجريبي لدينا، ويتحقق الدولة كهرساوي تدريجيا عن طريق الحقن النظامية من بنتوباربيتال الصوديوم في الجرعات العالية، والتي يدفع بسرعة لأول مرة انخفاضا في محتوى تردد ECoG، ثم "انفجر قمع" واسطة41،42، مما يؤدي في النهاية إلى ECoG مسطحة تماما. على مستوى الخلايا، واختفاء النشاط العفوي يتبع دورة زمنية مماثلة مع تخفيض ما يصاحب ذلك من depolarizing وغشاء hyperpolarizing التقلبات المحتملة. وبالتالي، فإنه يمكن الافتراض أن حقن بنتوباربيتال الصوديوم أولا يزيد من انتقال المثبطة متشابك مما يؤدي إلى الحد من العصبونات القشرية اطلاق النشاط، والإلغاء التدريجي للانتقال متشابك مثير والمثبطة التي تؤدي في نهاية المطاف في ECoG كهرساوي والأنشطة داخل الخلايا 29،44. التحولات مماثلة من نشطة إلى أنماط ECoG كهرساوي يمكن الحصول على إثر إدارة وكلاء مخدر الأخرى مثل الكيتامين (الملاحظة الشخصية) أو الأيزوفلورين 45،46.

قد تظهر إجراءات واضحة نسبيا. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى غيبوبة عميقة جدا التي يسببها، والحفاظ على المتغيرات الفسيولوجية الأساسية فينطاقات العادية هو أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. التغييرات في اتكو 2 تقلبات قد يكون نتيجة لأحد المكونات مخاط تشكيل في القصبة الهوائية. في مثل هذه الحالة، يجب فصل جهاز التنفس الصناعي والمخاط يستنشق بسرعة أو محوها من خلال أنبوب القصبة الهوائية. وعلاوة على ذلك، فإن الاستقرار الميكانيكي للإعداد أمر بالغ الأهمية للتسجيلات داخل الخلايا. وبالتالي، ينبغي بذل جهود خاصة للحد من الأوعية الدموية ونبضات الجهاز التنفسي، من خلال تعديل بعناية جسم الحيوان بالنسبة للرئيس مع الحفاظ على التوافق القصبة الهوائية أنابيب المناسبة، وتطبيق الاغاروز أو المطاط الصناعي سيليكون على حج القحف. ومن الضروري أيضا لتجنب انكماش العضلات العفوية عن طريق الحقن وكيل الشلل. وأخيرا، الاهتزازات البيئية والضجيج الكهربائي ينبغي تخفيض قدر الإمكان. منشورات أخرى بالتفصيل الخطوات الضرورية لالأمثل في إعداد الجسم الحي السماح داخل الخلايا مستقرة أو التصحيح، المشبك الذيالتسجيلات لو خلية 29،47-50.

القدرة على فصل الخلايا العصبية خصائص الغشاء الجوهرية والشبكات ديناميات أمر ضروري لتشريح الآليات التي الخلايا العصبية الفردية معالجة المعلومات في بيئتهم مرتبطة إلى حد كبير. كما جاء في المقدمة، أدت الدراسات السابقة المكرسة لهذه القضية المركزية العلوم العصبية الأساسية إلى نتائج متضاربة، ويرجع ذلك جزئيا إلى ميزات محددة من الخلايا العصبية والشبكات التحقيق وظروف تجريبية مختلفة، بما في ذلك في المختبر مباراة في الجسم الحي الاستعدادات و، في نهاية المطاف، و إجراءات التخدير المختلفة المستخدمة (انظر على سبيل المثال 29،36،51). نقترح أن النهج الحالي يمكن استخدامها للتحقق من صحة، وربما المصالحة، والنتائج التي تم الحصول عليها من انخفاض في إعداد المختبر ومن التجارب في الجسم الحي. في الواقع، فإنه يسمح لدراسة مباشرة ومقارنة بنفس العصبية وخلال نفس الإجراء التجريبيتأثير أنماط متميزة من مدخلات متشابك وارد، من ديناميات الاستيقاظ مثل لاستكمال الخمول، على الخصائص التكاملية العصبية في الحيوانات الحية.

واحدة سمة مميزة لهذا البروتوكول هي أنه يتقن مرة واحدة، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات تجريبية أخرى، مثل السطح وEEG عمق تسجيلات متعددة المواقع، المؤشرات الفلورية المرمزة وراثيا تحقيقات استنادا والتصوير حتى الدورة الدموية والأيض في المخ، للتحقيق في متعددة الأبعاد خصائص الدماغ كهرساوي. كما وجهات النظر السريرية والتشخيصية، منذ أثبتنا أن الخلايا العصبية لا تزال منفعل خلال غيبوبة كهرساوي الثابتة، سيكون من المهم اختبار وظائف القشرية، على سبيل المثال معالجة المعلومات الحسية من المرضى والنماذج الحيوانية منغمسين في مثل هذه الحالة المرضية من الدماغ الخمول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة فرنسا، والمعهد الوطني للسانتيه إت للبحوث ميديكال، وجامعة بيير وماري كوري وبرنامج "INVESTISSEMENTS دي AVENIR" وكالة الاستخبارات الوطنية-10-IAIHU-06.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

Tags

علم الأعصاب، العدد 109، تسجيلات داخل الخلايا،
تحريض دولة ISOELECTRIC الدماغ المعنية بالتحقيق في أثر الذاتية متشابك آخر على العصبية استثارة<em&gt; في فيفو</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S.,… More

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter