Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Induktion av en Isoelectric hjärntillstånd för att undersöka inverkan av endogen Synaptic aktivitet på neuronala retbarhet Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

Denna procedur utför långvariga intracellulära inspelningar in vivo från enskilda nervceller under fysiologiskt relevanta cerebrala tillstånd och efter fullständigt avskaffande av pågående elektriska aktiviteter, vilket resulterar i en isoelektrisk hjärntillstånd. De fysiologiska konstanter av djuret övervakas noggrant under övergången till den konstgjorda koma tillstånd.

Abstract

Vägen nervceller bearbeta information beror både på deras inneboende membranegenskaper och på dynamiken i den afferenta synaptiska nätverk. Framför allt endogent genererade nätverksaktivitet, som starkt varierar som en funktion av tillståndet av vaksamhet, modulerar neuronal beräkning avsevärt. För att undersöka hur olika spontana cerebral dynamik påverka enskilda nervceller "integrativa egenskaper har vi utvecklat en ny experimentell strategi hos råtta som består i att undertrycka in vivo alla hjärnaktivitet med hjälp av en systemisk injektion av en hög dos av natrium pentobarbital. Kortikala aktiviteter, kontinuerligt övervakas genom kombinerad electrocorticogram (ECOG) och intracellulära inspelningar gradvis långsammare, vilket leder till en stadig isoelektrisk profil. Denna extrema hjärntillstånd, sätta råtta i en djup koma, var noga med att mäta fysiologiska konstanterna djuret under experimenten. intracellulär recordings tillät oss att karakterisera och jämföra integrerande egenskaperna hos samma neuron inbäddad i fysiologiskt relevanta kortikala dynamik, såsom de som förekommer i sömn-vakenhetscykeln, och när hjärnan var helt tyst.

Introduction

I avsaknad av miljö stimuli eller beteende uppgifter, genererar "vilande" hjärna en kontinuerlig ström av elektrisk aktivitet som kan spelas in från hårbotten, som elektroencefalografiska (EEG) vågor. Den intracellulära korrelat av detta endogena cerebral aktivitet karakteriseras av bakgrundsmembranspänningsvariationer (även känd som "synaptiska brus"), som består av en kombination av excitatoriska och hämmande synaptiska potentialer som återspeglar den pågående aktiviteten hos afferenta nätverk 1,2. Denna spontana aktivitet varierar i frekvens och amplitud med olika lägen vaksamhet. Belysa effekterna av nätverksaktivitet på retbarhet och lyhördhet enskilda neuroner är en av de största utmaningarna för neurovetenskap 3,4.

Många experimentella och beräknings studier har undersökt den funktionella effekten av pågående synaptisk aktivitet på integrativ properties från neuroner. Dock kvarstår den roll som olika neuronala parametrar påverkas av bakgrunds synaptiska buller svårfångade. Till exempel har den genomsnittliga nivån på membrandepolarisering visat positivt 5,6 eller negativt 7-9 korrelerad med förmågan hos sensoriska ingångar för att utlösa aktionspotentialer. Dessutom, medan vissa undersökningar tyder på att variationer i membranpotentialen, till följd av en kontinuerligt varierande ström av afferenta synaptiska ingångar, starkt påverkar känsligheten hos enskilda nervceller genom att modulera förstärkningen av deras input-output relation 3,10-13, andra tyder på att ändringar i membraninmatnings konduktans medierade av shuntning inhibering är tillräckliga för att modulera neuronal förstärkning oavsett omfattningen av membranfluktuationer 14,15. Slutligen, nya studier utförda på vakna djur betonade hur behandlingen av sensorisk information i en enda neuron beror kritiskt på tillståndet av vaksamhet ennd nuvarande beteende efterfrågan 16,17.

En enkel strategi för att belysa den funktionella rollen av en viss process i en mycket sammanlänkat system är att avgöra hur dess frånvaro förändrar specifikt systemets funktion. Denna metod har använts i stor utsträckning i neurovetenskaplig forskning, till exempel med hjälp av experimentella skador eller inaktivering av olika hjärnområden 18-21, eller farmakologisk blockad av specifika jonkanaler 22,23. Särskilt har det använts in vivo för att avslöja hur funktionella anslutnings och nätverksdynamik påverkar enda cell beräkning 24-27. Men hittills lokala manipulationer avsedd att blockera avfyrandet av neuroner och / eller störa deras grundläggande biofysikaliska egenskaper kan vara delvis effektiva och är begränsade till relativt små hjärnvolym 28.

För att övervinna dessa begränsningar, har vi utvecklat en ny in vivo experimentella tillvägagångssättråttan att jämföra elektrofysiologiska egenskaperna hos enskilda nervceller som spelats in i en given hjärntillstånd, det vill säga, inbäddade i ett visst nätverk dynamisk, till dem som erhållits efter fullständig undertryckande av hela hjärnan synaptisk aktivitet 29. I kontrollförhållanden, skulle två skilda kortikala dynamik genereras. Sömnliknande electrocorticographic (ECOG) mönster inducerades genom injektion av måttliga doser av natrium pentobarbital. Alternativt kan snabba ECOG vågor av små amplitud kan jämföras med kortikala aktiviteten som ligger bakom vaket tillstånd (vakna liknande mönster) framställas genom injektion av fentanyl. Därefter, under bibehållande av samma ECOG och intracellulär inspelning, en komplett tystande av endogen hjärnans elektriska aktivitet erhölls genom systemisk injektion av en hög dos av natriumpentobarbital, kännetecknad genom isoelektrisk ECOG och intracellulära aktiviteter. Eftersom induktion av en sådan extrem koma skulle kunna ha dödlig consequences på biologiska funktioner, var nödvändigt med en noggrann och kontinuerlig övervakning av fysiologiska variabler. Därför följde vi noggrant hjärtslag frekvens, slut tidvatten CO 2 koncentration (EtCO 2), O 2 mättnad (SpO 2) och kärntemperatur på råtta under hela experimenten.

Vi utvärderar enskilda neuroner egenskaper under dessa olika tillstånd med hjälp av vassa mikroelektroder, som är särskilt lämpade för långa och stabila inspelningar in vivo. Det förfarande som beskrivs här, kan kombineras med andra elektrofysiologiska och avbildningsmetoder och skulle kunna utvidgas till andra djurmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes i enlighet med riktlinjerna från Europeiska unionen (direktiv 2010/63 / EU) och godkännas av Charles Darwin etisk nämnd djurförsöks. Vi beskriver här det förfarande som vi använder rutinmässigt i vårt laboratorium, men de flesta stegen kan anpassas för att matcha allas specifika behov.

1. Kirurgisk förberedelse

Obs: Alla snitt och tryckpunkter bör upprepat infiltrerade med lokalbedövning (lidokain eller bupivakain). Det nuvarande förfarandet är terminal, om en aseptisk förberedelse krävs flera ändringar bör genomföras.

  1. Söva en råtta med natriumpentobarbital (40 mg / kg) och ketamin (50 mg / kg) i två lokalt separerade intraperitoneala (IP) injektioner.
  2. Låt djuret gå under narkos och upprepade gånger kontrollera att en kirurgisk plan av anestesi uppnås (ingen reaktion på tå nypa). Placera råttan på en feedback värmefilt och infoga en rektal sond för att bibehålla kärntemperatur runt 37 ° C.
  3. Placera en kateter i den peritoneala håligheten för att underlätta efterföljande injektion av anestesimedel och för att undvika perforering organ genom upprepade nålstick 30.
    1. Klippa håret över en liten (~ 2-3 mm) ovanför ett område som ligger i magens nedre högra eller vänstra kvadranten.
      Notera: Hårborttagnings kräm kan också användas.
    2. Gör en 2-3 mm snitt på huden med vass sax eller en skalpell. Med hjälp av dissektion, ta bort fett och muskler lager tills bukhålan observeras.
    3. Infoga omkring 1 - 2 cm av en liten kateter i kaviteten och stänga såret med kirurgiskt lim.
      (. T.ex. två franska - vilket motsvarar 0,043 mm innerdiameter): Obs diameter och den totala längden av katetern bör vara minimal för att minska döda volymer. Polyuretan rör är mest lämpade.
    4. Gör en ögla och sutur than kateter på huden för att säkra det på plats.
  4. Installera en trakealtub att styra ventilation under konstgjord andning.
    1. När det gäller den föregående steg, förbereda intresseområde (1 - 2 cm över luftstrupen precis ovanför manubrium), ta bort hår och incisionsfilm huden.
    2. Blunt dissekera de första lager av fett och muskler, sedan flytta spottkörteln undan och exponera luftstrupen genom att försiktigt dissekera det sista lagret av muskler.
    3. Försiktigt bort vävnaderna över luftstrupen och skjut en tråd under den med små pincett. Gör en kirurgknut med tråden men inte tätt det ännu.
    4. Incisionsfilm trakea transversellt mellan två broskringar. Svabb blod i luftstrupen om något.
    5. Sätt en trakealtub med lämplig diameter och dra åt tråden knut för att säkra röret stadigt. För ytterligare stabilitet tråden vidare kan fästas vid en högre punkt i endotrachealtub.
    6. Suture såret nära eller använda kirurgiska häftklamrar. Undvika kirurgiskt lim här om trakealtuben är avsett att återanvändas.
  5. Installera djuret i en stereotaxisk ram och noggrant övervaka följande fysiologiska variabler: ECOG, SpO 2, ETCO 2, hjärtfrekvens (via en elektrokardiogram, EKG) och inre temperatur. Övervaka och justera dessa variabler för att hålla en riktig djup anestesi och fysiologiska tillstånd. Specifikt, komplettera anestesin med en liten dos (10 mg / kg) av natriumpentobarbital vid behov.
  6. Applicera ögonsalva på båda ögonen för att undvika uttorkning. Klippa håret över hårbotten, gör en längsgående snitt (~ 2 cm) och resekera bindväv liggande skallen med en skalpell eller en kyrett.
  7. Göra en liten (~ 1,5 mm i diameter) kraniotomi över regionen av intresse med en dentalborr.
    Obs: Här är pipan fält primära somatosensoriska cortex riktade (7-8 mm främre till den interaurala linjen, 4,5- 5,5 mm lateralt om mittlinjen 31). Skölj upprepade gånger för att avleda värme.
  8. Använd extra fin pincett för att försiktigt göra ett litet hål i dura. Reservera en mm region ~ 0,5 inom hjärn trepanation att placera ECOG elektroden (se nästa steg). Permanent hålla cortex fuktigt med 0,9% NaCl-lösning (eller artificiell cerebro-spinalvätska).
  9. Placera en låg impedans (~ 60 kQ) silverelektrod (den ECOG elektrod) på dura, undvika den kortikala regionen som inte omfattas av hjärnhinnorna, och placera referenselektroden på en hårbotten muskler på den andra sidan av huvudet.
  10. I detta skede (30 minuter efter den sista natriumpentobarbital injektion), upprätthålla anestesi genom upprepade injektioner av natriumpentobarbital (10-15 mg / kg / h) eller fentanyl (3-6 | j, g / kg / timme) via IP-katetern. Den förstnämnda kommer att resultera i en långsam oscillerande, sömn-liknande, ECOG mönster medan den senare kommer att resultera i en desynchronized, vakna-liknande, kortikal profil.
  11. Justera den konstgjorda ventilation systemet så att den respiratoriska frekvens och volym är liknande till de av råttans spontana andning (normalt område 70-115 andetag / min 32). Anslut sedan den mekaniska ventilationen till trakealtuben och kontrollera den rätta bröstkorgen inflation (på båda sidor). Om inte, justera läget för ventilationsslangen i trakeal axeln. Om nödvändigt, suga upp utsöndringen närvarande i luftstrupen med en kateter som är ansluten till en spruta eller en vakuumpump.
  12. Om alla fysiologiska variabler 32-35 och ECOG 29,36 mönster återspeglar en stabil kirurgisk plan av anestesi, göra en intramuskulär injektion av gallamin trietiodid i varje ben för att lamslå råtta, 40 mg / kg för den första injektionen och sedan 20 mg / kg varje 2h 19,29,36,50.

2. Intracellulära Record

  1. Dra ett glas mikropipett (skarp mikro) med en ~ 0,2 um spets såsom dess motstånd varierar between 50 och 80 MQ en gång fylld med 2 M kaliumacetat (KAc).
  2. Placera pipetten i en viss innehavare med en silver / silver-klorid (Ag / AgCl) kabel för att ansluta pipetten lösning till en intracellulär förstärkare (via en huvudet scenen). Hållaren ska bifogas en mikromanipulator. Placera en Ag / AgCl-referenselektrod på råttans nackmuskler.
  3. Långsamt in pipetten i hjärnan ner till regionen av intresse och verifiera dess motståndskraft genom att övervaka spänningen sjunker till följd av nuvarande steg. Använd telefonen (eller zappa) knappen på förstärkaren för att rensa pipetten om det behövs.
  4. Använd tops eller syntetiska absorption trianglar att torka kraniotomi (vara noga med att inte röra ECOG eller intracellulära elektroder) innan du täcker den med silikon elastomer eller 4% agaros för att minska hjärn rörelser.
  5. Sänk pipetten 1 - 2 um steg tills dess motstånd ökar när man närmar sig en cell. Använd sedan surr funktion på förstärkaren till inträngningente in i nervcellen.

3. inducera Isoelectric staten

  1. Utför lämplig försöksprotokoll (t.ex. bränning svar på intracellulärt inducerad ström, ström-spänning relationer, sensoriska stimuli svar) i detta skede samtidigt övervaka neuron membran potential, ECOG och fysiologiska variabler.
  2. Se till att den intracellulära elektroden är stabil i cellen genom att analysera stabilitet av både membranpotentialen och aktionspotentialen egenskaper under inspelningen. Om inte, gå till nästa steg och vänta tills inspelningen blir stabil igen eller söka efter en annan neuron.
  3. Injicera en hög men infra dödlig dos av natriumpentobarbital (~ 90 mg / kg, kan vara så låg som 35 mg / kg från pentobarbital initialtillstånd och upp till 155 mg / kg från fentanyl initialt tillstånd) via IP-linjen.
    Obs: Inom 15-20 minuter den intracellulära och ECOG waveforms bör sakta ner med intermittenta elektriska tystnad till övergående nå den så kallade "burst-suppression" profilera 37,38, som gradvis kollapsar till en komplett isoelektrisk tillstånd. Det förväntas att hjärtfrekvensen saktar betydligt ner (vid ~ 10-20%) men SpO 2 och EtCO 2 bör vara relativt stabil.
  4. Om den isoelektriska tillståndet inte har nåtts, injicera en liten mängd av natriumpentobarbital (~ 10% av steg 3,1 dosen). Vänta 15 minuter innan du lägger mer bedövningsmedel om den isoelektriska tillståndet fortfarande inte uppnåtts.
  5. Upprepa det experimentella protokollet för att jämföra effekterna av nätverksdynamiken på den inspelade neuron integrerande egenskaper.
    Obs: Efter upphörande av anestesi injektioner, bör den elektriska hjärnaktivitet återhämta sig helt inom 3-4 timmar.
  6. Vid slutet av experimentet, injicera en dödlig dos av natriumpentobarbital (200 mg / kg, IP) för att avliva råttan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion och upprätthålla en isoelektrisk hjärntillstånd är en känslig in vivo experimentella förfarande. Det har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att direkt undersöka effekterna av kortikala nätverk aktivitet på neuronala retbarhet och överföringsfunktionen 29. Figur 1 visar flera parametrar övervakning, inklusive ECOG och vitala konstanter, av djurets fysiologiska tillstånd före (Figur 1A ) och efter (Figur 1B) induktion av den isoelektriska tillståndet.

Figur 1
Figur 1. Övervakning av de fysiologiska parametrarna i Kontroll och Isoelectric villkor.
A och B, samtidiga inspelningar av ECOG (övre spår) och fysiologiska parametrar under aktiv kortikal tillstånd (A) och subsequent isoelektriska period (B). Kärntemperatur (Temp.), EtCO 2 och SpO 2 är i huvudsak stabil under hela experimentet. Hjärtfrekvens, däremot minskar successivt efter induktion av den isoelektriska tillståndet (från 382 till 349 slag / min), som kan ses på EKG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Under kontrolltillfällen, de fysiologiska parametrar liknade dem som uppmätts hos friska och vakna djur 32-35 och förblev opåverkade efter induktion av den isoelektriska tillståndet, med undantag för hjärtfrekvensen som var något långsammare (figur 1). Detta är en viktig punkt, eftersom hypoxi 39 eller hyperkapni 40 markant kan förändra neuronala retbarhet och därmed kan införa en allvarlig bias i en stud y utforska en hjärntillstånd beroende modulering av neuronala integrativa egenskaper.

Vi fick den isoelektriska status från två olika initiala villkor som härmar de kortikala dynamik endogent genererade under de tidiga stadierna av sömn (Figur 2AA, vänster) eller under uppvaknandet (Figur 2AB, vänstra panelen). Dessa aktiva tillstånd antingen inducerad genom injektion av natrium pentobarbital (sömnliknande) eller fentanyl (vakna-liknande). I båda fallen, den efterföljande injektion av en hög dos av natrium pentobarbital resulterade i en fullständigt avskaffande av spontan aktivitet i ECOG och samtidigt inspelade nervceller (Figur 2AA och B, höger paneler), därav uttrycket isoelektrisk. Trycka pågående synaptisk aktivitet resulterade i en signifikant stadig hyperpolarisation av det neuronala membranpotential (Figur 2B).

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 2
Figur 2. Konsekvenser av synaptisk aktivitet bekämpande på den spontana Dynamics of membranpotential.
(A) Samtidiga representativa inspelningar av ECOG (övre spår) och intracellulära aktiviteter (Intra, botten spår) under sömnen liknande (Aa) och vakna liknande (A b) mönster (vänster paneler) och under motsvarande efterföljande isoelektriska epoker (vid de tider som anges efter undertryckande injektionen, Isoelectric, höger paneler). tid-frekvensanalys av ECOG signaler (energitäthet för 0 - Hz frekvensområdet 50) skildras av färgskalor. (B) Sannolikhets densiteter (P) av membranpotentialvärden (Vm, bin storlek 0,5 mV, 10 sek inspelning) från nervceller som visas i panel A. Denna siffra har ändrats, med tillåtelse, från ref 29./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att illustrera den funktionella effekten av denna extrema hjärntillstånd, vi extraherade passiva och aktiva inneboende egenskaper isoelektriska nervceller och jämfört dem med de som uppmätts under motsvarande initialtillstånd. Med hjälp av denna strategi, har vi visat att nervceller kunde skjuta aktionspotentialer som svar på intracellulär injektion av depolariserande ström under den isoelektriska tillståndet, vilket visar att de förblev helt excitable även efter fullständig hämning av bakgrunds synaptisk aktivitet (Figur 3AA och b Isoelectric). Dessutom fann vi att överföringsfunktionen av nervceller, genom att mäta den skottfrekvens induceras av stegen depolariserande ström av ökande intensitet (FI relation), var höger skiftat jämfört med de ursprungliga aktiva förhållanden, vilket indikeraren minskning av känsligheten av neuroner till svaga excitatoriska ingångar (figur 3B). Motsvarande neuronal förstärkning, dvs lutningen på FI kurvan, oförändrade eller minskade när styrtillståndet var sömn eller vaknar typ, respektive (Figur 3B). Överraskande, var den skenbara ingångsresistans av nervceller inte signifikant modifierad i frånvaro av synaptiska enhet jämfört med kontroll aktiva tillstånd (figur 3AA, b). Fler resultat, inklusive befolkning analys och kvantifiering av tids bränning mönster av nervceller i de aktiva och isoelektriska villkor, finns i vår ursprungliga papper 29.

Figur 3
Figur 3. Jämförande effekterna av de tre kortikala aktivitetsmönster på membranegenskaper och Input-output Relations.
(A) Voltag e svar (mitten traces) av somatosensoriska kortikala neuroner att depolariserande och hyperpolarizing strömpulser (botten traces) under sömnen liknande (Aa) och vakna liknande (A b) ECOG mönster (bästa poster) och efter berövande av synaptisk aktivitet (Isoelectric ). Membraningångsmotstånd (R m, värden anges) mättes från spänningsfall (grå spår, medelvärden av 20 försök) inducerade av hyperpolarizing strömpulsinjektioner (-0,4 nA). (B) Motsvarande FI kurvor, som ger överföringsfunktionen av neuronerna som visas i panel (A). Eldhastighet mättes som svar på depolariserande strömpulser (200 ms varaktighet) med ökande intensitet. Varje strömstyrka tillämpades 20 gånger och motsvarande bränning priser var i genomsnitt. De streckade linjerna indikerar de cellsvar som visas i (A). Denna siffra har ändrats, med tillåtelse, från ref 29.ladda / 53.576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver här en ny metod för att undertrycka in vivo spontan cerebral elektrisk aktivitet vid både nätverk och cellulära nivåer. Detta förfarande leder till en extrem hjärntillstånd, känd som isoelektrisk koma 41. Ur klinisk synvinkel är en sådan electrocerebral inaktivitet den allvarligaste abnormitet som kan ses på EEG. Det är främst förknippad med en irreversibel koma, med alla patienter antingen dör eller fortsätter i en ihållande vegetativt tillstånd 42, men kan åtminstone delvis reverseras när som orsakas av en förgiftning med centrala nervsystemet depressiva läkemedel (t.ex. tiopental), en oavsiktlig hypotermi 42 eller en asphyxial hjärtstillestånd 43. I vår experimentella paradigm är isoelektrisk tillstånd gradvis uppnås genom en systemisk injektion av natrium pentobarbital vid höga doser, som först snabbt inducerar en reduktion av frekvensen innehåll ECOG, sedan en "burst-suppression" -läge41,42, vilket leder slutligen till en helt platt ECOG. På den intracellulära nivån följer försvinnandet av spontan aktivitet en liknande tidsförlopp med åtföljande minskning av depolariserande och hyperpolariserande membran potentiella fluktuationer. Det kan således vara en hypotes om att injektionen av natrium pentobarbital först ökar synaptiska hämmande transmission som leder till en minskning av kortikala neuroner skjuter aktivitet, en gradvis avveckling av retande och hämmande synaptisk transmission som slutligen resulterar i isoelektrisk ECOG och intracellulära aktiviteter 29,44. Liknande övergångar från aktiv till isoelektriska ECOG mönster kan erhållas efter administrering av andra anestesimedel såsom ketamin (personlig observation) eller isofluran 45,46.

Proceduren kan verka relativt enkelt. Men på grund av den extremt djup koma inducerad med bibehållande av de grundläggande fysiologiska variabler inomnormala värden är av avgörande betydelse för att lyckas med experimentet. Förändringar i EtCO 2 fluktuationer kan vara resultatet av en slempropp bildas i luftstrupen. I en sådan situation bör ventilatorn frånkopplas och slem snabbt sugs eller torkas ut genom trakealtuben. Dessutom är avgörande för intracellulära inspelningar den mekaniska stabiliteten av beredningen. Därför bör särskilda ansträngningar göras för att minska kärl och respiratoriska pulsationer, genom att försiktigt justera djurets kropp i förhållande till huvudet samtidigt upprätthålla en lämplig luftrör rör anpassning, och genom att tillämpa agaros eller silikonelastomer på kraniotomi. Det är också nödvändigt att undvika spontana muskelsammandragningar genom injektion av en förlamande agent. Slutligen bör vibrationer miljön och elektriska störningar minskas så mycket som möjligt. Övriga publikationer detalj de viktigaste stegen för en optimal in vivo preparat som möjliggör stabil intracellulär eller patch-clamp somle-cell inspelningar 29,47-50.

Förmågan att frikoppla neuronala inneboende membranegenskaper och nätverk dynamik är viktigt att dissekera de mekanismer genom vilka enskilda nervceller bearbeta information på sitt mycket ansluten miljö. Såsom anges i inledningen, tidigare studier ägnas åt denna centrala frågan om de grundläggande neurovetenskap lett till motstridiga resultat, delvis på grund av de särdrag nervceller och nätverk undersökta och de olika experimentella förhållanden, inklusive in vitro vs in vivo förberedelser och slutligen den olika anestesi används (se till exempel 29,36,51). Vi föreslår att den nuvarande strategin kan användas för att validera och eventuellt förena resultaten erhållna från minskad in vitro-beredning och från in vivo experiment. I själva verket gör det möjligt att direkt undersöka och jämföra i samma neuron och under loppet av samma experimentella procedureffekterna av distinkta mönster av afferenta synaptiska inmatningar, från att vakna-liknande dynamik för att slutföra inaktivitet, på de neuronala integrerande egenskaper i ett levande djur.

Kännetecknande för detta protokoll är att, en gång bemästrat, det kan kombineras med andra experimentella tekniker, såsom flera platser yt- och djup EEG inspelningar, genetiskt kodade fluorescerande indikatorer baserade undersökningar och även hemodynamiska och metaboliska avbildning av hjärnan, att undersöka den flerdimensionella egenskaperna hos den isoelektriska hjärnan. Kliniska och diagnostiska perspektiv, eftersom vi visat att nervceller fortfarande excitable under ihållande isoelektriska koma, skulle det vara relevant att testa kortikala funktioner, till exempel behandling av sensorisk information, patienter och djurmodeller nedsänkta i ett sådant patologiskt tillstånd av hjärnan inaktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från Fondation de France, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Pierre & Marie Curie University och programmet "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

Tags

Neurovetenskap intracellulära inspelningar, upphetsning synaptisk aktivitet ECOG isoelektriska cerebral cortex koma fysiologiska konstanter
Induktion av en Isoelectric hjärntillstånd för att undersöka inverkan av endogen Synaptic aktivitet på neuronala retbarhet<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S.,… More

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter