Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

Bu prosedür bir izoelektrik beyin devlet sonuçlanan fizyolojik ilgili beyin durumlarında ve devam eden elektrik faaliyetlerinin tam kaldırılmasından sonra tek nöronların uzun ömürlü in vivo hücre içi kayıtları gerçekleştirir. hayvanın fizyolojik sabitleri dikkatle yapay komada durumuna geçiş sırasında izlenir.

Abstract

yolu nöronlar işlem bilgileri kendi içsel membran özelliklerine ve afferent sinaptik ağının dinamikleri hem de bağlıdır. kuvvetle uyanıklık durumunun bir fonksiyonu olarak değişmektedir özellikle endojen üretilen ağ aktivitesi, olarak, önemli ölçüde nöronal hesaplama modüle eder. Spontan serebral dinamikleri tek nöronların bütünleştirici özelliklerini nasıl etkilediğini farklı araştırmak için, sodyum pentobarbital yüksek dozda sistemik enjeksiyonu yoluyla in vivo olarak serebral aktivitesi bastırmada oluşan sıçan yeni bir deneysel strateji geliştirmiştir. Sürekli kombine elektrokortikogram (EcoG) ve hücre içi kayıtları tarafından izlenen kortikal faaliyetleri, giderek istikrarlı bir izoelektrik profiline lider, yavaşlar. derin bir koma halinde sıçan koyarak bu aşırı beyin devleti, dikkatle deneyler boyunca hayvanın fizyolojik sabitleri ölçülerek izlendi. Hücre içi recordings bize karakterize ve uyku-uyanıklık döngüsü karşılaşıldığı gibi fizyolojik ilgili kortikal dinamikleri, içine gömülü aynı nöronun bütünleştirici özelliklerini karşılaştırmak için izin ve beyin tamamen sessiz olduğu zaman.

Introduction

herhangi bir çevresel uyaranlara veya davranışsal görevlerin yokluğunda, "dinlenme" beyin elektroensefalografi (EEG) dalgalar olarak kafa derisi kaydedilebilir elektriksel aktivitenin sürekli bir akış oluşturur. Bu endojen serebral aktivitenin hücre içi korelasyon afferent ağlar 1,2 sürekli aktiviteyi yansıtan eksitatör ve inhibitör sinaptik potansiyellerin bir arada oluşur (aynı zamanda "sinaptik gürültü" olarak da bilinir) arka plan membran voltaj dalgalanmaları ile karakterizedir. Bu spontan aktivite teyakkuz farklı devletleri ile frekans ve genlik değişir. Tek nöronların eksitabilite ve cevaplılığı üzerine ağ etkinliğinin etkisini aydınlatılması sinirbilimlerden 3,4 büyük zorluklardan biridir.

Birçok deneysel ve hesaplamalı çalışmalar bütünleştirici propertie devam eden sinaptik aktivitenin fonksiyonel etkilerini araştırdınöronların s. Ancak, arka plan sinaptik gürültü etkilenen farklı nöronal parametrelerin rolü belirsiz kalır. Örneğin, membran depolarizasyon ortalama seviyesi pozitif 5,6 veya negatif 7-9 aksiyon potansiyelleri tetiklemek için algılama verilerinin yeteneği ile ilişkili bulunmuştur. Bazı araştırmalar afferent sinaptik girdi sürekli değişen akışından kaynaklanan zar potansiyeli dalgalanmalar, güçlü bir şekilde giriş-çıkış ilişkisi 3,10-13 kazancını düzenlenmesiyle tek nöronların yanıt etkilediğini düşündürmektedir oysa Ayrıca, diğerleri göstermektedir inhibisyonu şant aracılık ettiği zar girişi iletkenlikteki değişimler ne olursa olsun, membran dalgalanmalar 14,15 büyüklük nöronal kazanç modüle edilmesi için yeterli olmaktadır. Son olarak, uyanık hayvanlar üzerinde yapılan son çalışmalar, tek bir nöron duyusal bilginin işleme eleştirel uyanıklık a durumuna bağlıdır nasıl vurguladınd mevcut davranışsal talep 16,17.

son derece enterkonnekte sistemin belirli bir sürecin işlevsel rolünü aydınlatmak için bir basit strateji yokluğu özellikle sistemin işleyişini nasıl değiştirdiğini tespit etmektir. Bu yöntem geniş bir deney lezyonlar ya da farklı beyin bölgeleri 18-21 inaktivasyonunu veya spesifik iyon kanalları 22,23 farmakolojik blokajı kullanılarak, örneğin, nörolojik araştırmalarında kullanılmıştır. Özellikle, fonksiyonel bağlantı ve ağ dinamikleri tek hücre hesaplama 24-27 nasıl etkilediğini açıklayacak in vivo olarak tatbik edilmiştir. Bununla birlikte, bugüne kadar yerel manipülasyonlar nöronların ateş engellemek ve / veya kısmen etkili olabilir temel biyofiziksel özellikleri karıştırmayı amaçlanmıştır ve nispeten küçük beyin hacmi 28 ile sınırlıdır.

Bu sınırlamaları aşmak için, in vivo deneysel bir yaklaşımla yeni bir geliştirilmişSıçan tüm beyin sinaptik etkinlik 29 tamamen bastırılmasıyla sonra elde edilen belirli bir ağ, dinamik gömülü belirli bir beyin durumda kaydedilen tek nöronların, yani, elektrofizyolojik özellikleri karşılaştırma. Kontrol koşulları olarak, iki farklı kortikal dinamikleri oluşturulabilir. Uyku benzeri elektrokortikografik (ECOG) desenleri, sodyum pentobarbital orta doz enjeksiyonu ile indüklenmiştir. Seçenek olarak ise, uyanıkken (uyanık benzeri örneği) temel kortikal aktivite ile karşılaştırılabilir küçük genlikli hızlı ECoG dalgaları fentanil enjeksiyonla üretilebilir. Aynı ECoG ve hücre içi kayıt korurken Daha sonra, endojen beyin elektriksel aktivitesi tam bir susturma izoelektrik ECOG ve hücre içi faaliyetleri, özelliği, sodyum pentobarbital yüksek doz, sistemik enjeksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Böyle bir aşırı koma indüksiyon potansiyel olarak ölümcül Ardışık olabilir çünkübiyolojik fonksiyonları ces, fizyolojik değişkenlerin dikkatli ve sürekli izleme gerekliydi. Bu nedenle, biz titizlikle deneyler boyunca kalp atım frekansını, end-tidal CO 2 konsantrasyonu (EtCO 2), O 2 doygunluğu (SpO2) ve sıçan çekirdek sıcaklığını izledi.

Biz, in vivo uzun ve istikrarlı bir kayıtlar için uygundur keskin Mikroelektronlar kullanarak bu farklı durumlarında tek nöronlar özelliklerini değerlendirir. Burada tarif edilen prosedür, diğer elektrofizyolojik ve görüntüleme yaklaşımları ile kombine edilebilir ve diğer hayvan modelleri genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm işlemler Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak yapılmıştır (direktif 2010/63 / AB) ve Hayvan Deneyleri Charles Darwin Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ancak çoğu adımlar herkesin özel ihtiyaçlarına uygun şekilde adapte edilebilir, burada rutin laboratuvarda kullanmak prosedürü açıklar.

1. Cerrahi Hazırlık

Not: Tüm kesi ve basınç noktaları tekrar tekrar lokal anestezi (lidokain veya bupivakain) ile infiltre edilmelidir. aseptik hazırlanışı çeşitli modifikasyonlar uygulanmalıdır gerekli ise, bu işlem, bir terminaldir.

  1. İki yerel olarak ayrılmış intraperitonal (IP) enjeksiyon sodyum pentobarbital (40 mg / kg) ve ketamin (50 mg / kg) ile, bir sıçan anestezisi.
  2. Hayvan genel anestezi altında gitmek ve tekrar tekrar anestezi cerrahi düzlem (kısma ayak hiçbir tepki) elde doğrulamak edelim. Bir fe sıçan yerleştirinedback ısıtma battaniye ve 37 ° C civarında çekirdek sıcaklığını korumak için bir rektal prob takın.
  3. Anestezik ajanların sonraki enjeksiyon kolaylaştırmak ve tekrarlanan iğne delikleri 30 ile organları perforan önlemek için periton boşluğuna bir kateter yerleştirin.
    1. Midenin alt sağ veya sol kadran içinde yer alan bir bölgede üzerindeki alana - küçük (3 mm ~ 2) üzerinden saç klibi.
      Not: Depilasyon krem ​​de kullanılabilir.
    2. keskin bir makas veya neşter ile cilt üzerinde 3 mm kesi - 2 yapın. periton boşluğu görülmektedir kadar künt diseksiyon kullanarak, yağ ve kas tabakaları kaldırmak.
    3. boşluğunda küçük bir kateter 2 cm ve cerrahi yapıştırıcı ile yarayı kapatmak - yaklaşık 1 yerleştirin.
      (. Örneğin, 2 Fransızca - iç çapı 0.043 mm karşılık gelen) Not: çap ve kateter toplam uzunluğu en az olmalıdır ölü hacimleri azaltmak için. Poliüretan tüpler en uygundur.
    4. bir döngü ve dikiş t yapmako yere sabitlemek için cilde kateter.
  4. Suni solunum sırasında havalandırma kontrol etmek için bir trakeal tüp takın.
    1. Bir önceki adımda olduğu gibi, ilgi alanı hazırlamak (1 - sağ manubrium yukarıdaki trakea üzerinde 2 cm), saç kaldırmak ve cildi insizyon.
    2. yağ ve kasların ilk katmanları incelemek künt, sonra bir kenara tükürük bezi taşımak ve yavaşça kasların son katmanını diseksiyon ile trakea maruz kalmaktadır.
    3. Dikkatle trakea üzerinde dokuları kaldırmak ve küçük forseps kullanarak altında bir iplik kaydırın. iplik ile bir cerrahın düğümü yapmak ancak henüz sıkı değil.
    4. İki kıkırdak halkaları arasındaki trakea enine doğru İnsizyon. trakea varsa içinde Swab kan.
    5. Uygun çaplı bir trakeal tüp takın ve istikrarlı tüp güvenli parçacığının düğüm sıkın. Ek stabilite için iplik daha trakea borusunun daha yüksek bir noktasında eklenebilir.
    6. sütüre yara yakın veya cerrahi zımba kullanın. Trakeal tüp yeniden amaçlanmıştır burada cerrahi yapıştırıcı kaçının.
  5. Stereotaksik çerçeve içinde hayvan takın ve dikkatlice aşağıdaki fizyolojik değişkenleri izlemek: EcoG, SpO 2, EtCO 2, ve iç sıcaklık (elektrokardiyogram, EKG aracılığıyla) kalp hızı. Monitör ve anestezi ve fizyolojik durumu uygun bir derinlik tutmak için bu değişkenleri ayarlayın. Özellikle, sodyum pentobarbital küçük bir doz (10 mg / kg), gerekirse anestezi tamamlar.
  6. kuruma önlemek için her iki göze göz merhemi sürün. uzunlamasına bir kesi (~ 2 cm) yapmak, kafa derisi üzerinde saç klibi ve bir neşter veya küret kullanılarak kafatası örten bağ dokuları rezeksiyonu.
  7. Bir diş matkap ile ilgi bölge üzerinde küçük bir (~ 1.5 mm çap) kraniotomiye olun.
    Not: Burada, birincil somatosensoriyel korteks varil alanı hedeflenmektedir (7-8 mm anterior interaural hattına, 4.5- 5,5 mm) orta hat 31 lateral. ısıyı dağıtmak için art arda durulayın.
  8. yavaşça dura küçük bir delik yapmak için ekstra ince forseps kullanın. EcoG elektrot yerleştirmek için kranial trepanasyon içinde ~ 0,5 mm bölgesini ayırmak (sonraki adıma bakın). Kalıcı% 0.9 NaCl çözeltisi (ya da yapay beyin omurilik sıvısı) ile nemli korteks tutmak.
  9. değil menenjlerin kapsadığı kortikal bölgeyi kaçınarak, dura üzerinde düşük empedans (~ 60 kÊ) gümüş elektrot (EcoG elektrot) yerleştirin ve başın diğer tarafında bir kafa derisi kas üzerindeki referans elektrot yerleştirin.
  10. Bu aşamada (son sodyum pentobarbital enjeksiyondan sonra 30 dakika), bir IP kateter vasıtasıyla sodyum pentobarbital (10-15 mg / kg / saat) veya fentanil (3-6 ug / kg / sa) tekrarlanan enjeksiyonu ile anestezi bakımı. ikincisi desynchronized, uyanma gibi, kortikal profiline neden olur, oysa önceki yavaş salınım, uyku-benzeri, ECoG model ile sonuçlanır.
  11. yapay v ayarlayınsolunum frekansı ve hacim sıçan spontan solunum (- 115 nefes / dk 32 normal aralık 70) benzemektedir böylece entilation sistemi. Ardından, trakeal tüp mekanik ventilasyon bağlamak ve (her iki tarafta) uygun göğüs kafesi enflasyonu kontrol edin. Eğer değilse, nefes borusu ekseni havalandırma boru konumunu ayarlamak. Gerekirse, bir şırınga ya da bir vakum pompasına bağlı bir kateter ile trakea mevcut salgılanmasını emmek.
  12. 29,36 desen anestezi istikrarlı bir cerrahi uçağı yansıtan 32-35 ve EcoG tüm fizyolojik değişkenler, sıçan, 40 mg felç için her bacaktaki gallamine trietiodidi bir kas içi enjeksiyon yaparsanız / ilk enjeksiyon için kg ve daha sonra 20 mg / kg her 2 saatte 19,29,36,50.

2. Hücre içi Kayıtlar

  1. Bir ~ 0.2 mikron ucu ile bir cam mikropipet (keskin mikroelektrot) çekin gibi direnci betwee aralıkların, 50 ile 80 M? kez 2 M potasyum asetat (KAC) ile doldurulur.
  2. (Bir kafa aşamasında aracılığıyla) bir hücre içi amplifikatöre pipet çözüm bağlamak için gümüş / gümüş-klorür (Ag / AgCl) tel ile belirli bir tutucu pipet yerleştirin. sahibinin bir micromanipulator eklenmelidir. Sıçan boyun kasları üzerinde bir Ag / AgCl referans elektrodu yerleştirin.
  3. Yavaş yavaş ilgi bölgeye aşağı beyinde pipet eklemek ve mevcut adımlarla cevaben düşer gerilim izleyerek direncini doğrulayın. Gerekirse pipet temizlemek için amplifikatörün düğmesini vızıltı kullanın (ya da zap).
  4. kraniotomiye beyin hareketlerini azaltmak için silikon elastomer ya da% 4 agaroz ile kaplayıp önce (ECoG ya da hücre içi elektrotlar dokunmamaya dikkat edin) kuru pamuklu çubuklarla veya sentetik emilim üçgenleri kullanın.
  5. Bir hücre yaklaşırken direnci artar kadar 2 mikron adımda - 1 pipet indirin. Sonra PENETRA için amplifikatörün vızıltı işlevini kullanınnöron içine te.

3. Isoelectric State øndükle

  1. Aynı anda nöronun membran potansiyelini, ECoG ve fizyolojik değişkenleri izlerken bu aşamada uygun deneysel protokol (örneğin, yanıtları ateş hücre enjekte akımlar, akım-gerilim ilişkileri, duyusal uyaranlar yanıtları) gerçekleştirin.
  2. Hücre içi elektrot kayıt oturum boyunca membran potansiyeli ve aksiyon potansiyel tıbbi özellikleri metanet analizi ile hücre içinde stabil olduğundan emin olun. Değilse, sonraki adıma geçin ve kayıt stabil hale gelene kadar tekrar beklemek veya başka bir nöron için aramazlar.
  3. sodyum pentobarbital yüksek, ancak alt-ölümcül doz enjekte IP hattı ile (~ / kg 90 mg, pentobarbital, ilk durumda 35 mg / kg fentanil ilk durumuna gelen 155 mg / kg 'a kadar düşük olabilir).
    Not: 15 içinde - 20 dakika hücre içi ve EcoG waveforms geçici giderek tam bir izoelektrik duruma çöker, hangi 37,38 profil sözde "patlama-bastırma" ulaşmak için aralıklı elektrik sessizlikler ile yavaşlatmak gerekir. Kalp hızı belirgin olarak (~ 10 tarafından -% 20) yavaşlatır beklenmektedir ancak SpO2 ve EtCO 2 nispeten sabit kalmalıdır.
  4. izoelektrik devlet ulaşılamaması halinde, sodyum pentobarbital küçük bir miktar enjekte (~ adım 3.1 dozun% 10). izoelektrik devlet hala elde değilse daha fazla anestezik eklemeden önce 15 dakika bekleyin.
  5. Kaydedilen nöronun bütünleştirici özellikleri üzerine ağ dinamiklerinin etkisini karşılaştırmak için deneysel protokol tekrarlayın.
    Not: anestezik enjeksiyon kesilmesinden sonra, elektriksel beyin aktivitesi tamamen 3 ila 4 saat içinde kurtarmak gerekir.
  6. Deneyin sonunda, sodyum pentobarbitalin letal doz enjekte (200 mg / kg, ip) sıçan euthanize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uyaran ve bir izoelektrik beyin durumunu korumak in vivo deneysel prosedürde bir hassastır. Doğrudan sinirsel uyarıların ve transfer fonksiyonunun 29 kortikal ağ etkinliğinin etkisini incelemek için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Şekil 1 (Şekil 1A önce hayvanın fizyolojik durumunun ECOG ve hayati sabitleri de dahil olmak üzere çok parametreli izleme, gösterir izoelektrik devletin) ve sonra (Şekil 1B) indüksiyon.

Şekil 1
Kontrol ve izoelektrik Koşullarında Fizyolojik Parametrelerinin 1. İzleme Şekil.
A ve B, aktif kortikal devlet (A) ve subs sırasında ECOG (üst izleri) ve fizyolojik parametrelerin eş zamanlı kayıtlarıequent izoelektrik nokta (B). Çekirdek sıcaklığı (Temp.), EtCO 2 ve SpO 2 deney boyunca esasen stabildir. Kalp atım sayısı, aksine, giderek izoelektrik devletin indüksiyon takip azalır (382 349 atım / dk dan), EKG'de görüldüğü gibi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kontrol oturumları sırasında, fizyolojik parametrelerin sağlıklı ve uyanık hayvanlarda 32-35 ölçülen benzerdir ve biraz yavaşlamış oldu kalp hızı (Şekil 1) hariç, izoelektrik devletin indüksiyonu sonrası etkilenmemiştir. Bu hipoksi 39 veya hiperkapni 40 belirgin bir saplama ciddi bir önyargı neden olabilir ve böylece nöronal heyecanlanma değiştirebilir ve beri önemli bir noktadır y nöronal bütünleştirici özellikleri bir beyin devlet bağımlı modülasyon keşfetmek.

Biz uyku erken evrelerinde (Şekil 2AA, sol panel) sırasında veya (Şekil 2AB, sol panel) uyanma sırasında endojen üretilen kortikal dinamikleri taklit iki farklı başlangıç ​​şartlarından izoelektrik durumunu almıştır. Bu aktif durumları ya da sodyum pentobarbital (uyku-benzeri) ya da fentanilin enjeksiyonu ile indüklenmiştir (uyanma gibi). Her iki durumda da, sodyum pentobarbital yüksek doz bir sonraki enjeksiyon ECOG spontan aktivite ve eş zamanlı olarak kaydedilen nöronlar (Şekil 2aa ve b, sağ panel), bu nedenle dönem izoelektrik bir tamamen kaldırılmasına yol açmıştır. Devam eden sinaptik etkinliği bastırılması nöronal membran potansiyeline (Şekil 2B) önemli bir sabit hiperpolarizasyonuna yol açmıştır.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> şekil 2
Şekil Potansiyel Membran Spontan Dynamics sinaptik Etkinlik Önlenmesi 2. Sonuçları.
(A) (A) ve (A b) uyanma gibi desenler (sol panel) ve karşılık gelen müteakip izoelektrik dönemini sırasında uyku gibi esnasında ECOG (üst izleri) ve hücre içi faaliyetleri (Intra, alt izleri) Eşzamanlı temsilcisi kayıtları (baskılayıcı enjeksiyondan sonra belirtilen zamanlarda, İzoelektrik, sağ paneller). EcoG sinyallerinin zaman-frekans analizi (0 enerji yoğunluğu - 50 Hz frekans aralığında) renkli ölçekler ile gösterilir. Membran potansiyeli değerleri (B) olasılık yoğunluk (P) (Vm, kutu boyutu 0,5 mV, kayıt 10 sn) Bu rakam ref 29 den, izni ile, modifiye edilmiştir paneli A'da gösterilen nöronlardan./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu aşırı beyin devletin fonksiyonel etkilerini göstermek için, izoelektrik nöronların aktif ve pasif içsel özellikleri ayıklanır ve ilgili ilk durumuna sırasında ölçülen olanlarla karşılaştırıldı. Bu stratejiyi kullanarak, nöronlar bile arka plan sinaptik aktivite (Şekil 3AA ve b, izoelektrik) tam bastırılması sonra tamamen heyecanlı kaldığını, izoelektrik devlet sırasında akım depolarizan gösteren hücre içi enjeksiyon yanıt olarak aksiyon potansiyelleri yangın olabileceğini göstermiştir. Ayrıca, biz (FI ilişkisi) yoğunluğu artan akımı depolarize adımlarla yol açtığı ateşleme frekansı ölçülerek değerlendirildi nöronların transfer fonksiyonu, işaret, başlangıçtaki aktif koşullara göre sağ kaymıştır olduğu bulunmuşturzayıf uyarıcı girişler (Şekil 3B) nöronların duyarlılığında azalma. Nöronal yani kazanç, FI eğrinin eğimini karşılık, değişmemiş veya kontrol devlet uyku-uyanma veya tipi, sırasıyla (Şekil 3B) iken düşürüldü. Şaşırtıcı bir şekilde, nöronların belirgin giriş direnci önemli ölçüde kontrol aktif koşullarında (Şekil 3AA, b) göre sinaptik sürücünün yokluğunda değiştirilmiş değildi. Popülasyon analizi ve aktif ve izoelektrik koşullarda nöronların zamansal ateşleme kalıplarının miktar dahil olmak üzere, daha fazla sonuçlar, başlangıçtaki kağıt 29 mevcuttur.

Şekil 3,
Şekil 3. Membran Özellikleri ve Girdi-çıktı İlişkileri Üç Kortikal Etkinlik Desenler Karşılaştırmalı Etkisi.
(A) voltajlı uyku gibi esnasında depolarizan somatosensoriyel kortikal nöronların ve hiperpolarizan akım darbeleri (alt izleri) e tepkiler (orta izleri) (A) ve (A b) uyanma gibi EcoG desenleri (üst kayıtları) ve sinaptik aktivite yoksunluğu sonra (İzoelektrik ). Membran giriş direnci (R m değerleri gösterilir) hiperpolarize akım darbe enjeksiyonu (-0.4 NA) ile indüklenen gerilim damla (gri izleri, 20 çalışmaların ortalama) ölçüldü. (B) Panel (A) gösterilen nöronların transfer fonksiyonunu sağlayan Sorumlu FI eğrileri. ateşleme hızı artan yoğunluğunun akım darbeleri (200 msn süre) depolarizan tepki olarak ölçüldü. Her akım şiddeti 20 kez uygulandı ve ilgili ateşleme oranları ortalaması alınmıştır. Kesik çizgiler (A) 'da gösterilen hücre yanıtlarını göstermektedir. Bu rakam ref 29 den, izni ile, modifiye edilmiştir./ 53576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "upload> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz burada ağ ve hücresel düzeydeki in vivo spontan serebral elektriksel aktivitenin içinde bastırmak için yeni bir yöntem tarif. Bu prosedür, izoelektrik koma 41 olarak bilinen bir aşırı beyin durumuna yol açar. görünümünde bir klinik açıdan bakıldığında, böyle bir elektroserebral hareketsizlik EEG görülebilir en ağır anormallik olduğunu. Çoğunlukla ya ölüyor ya da kalıcı bitkisel 42 devam tüm hastalarla, geri dönüşü olmayan bir koma ile ilişkili, ancak (örneğin tiyopental gibi) merkezi sinir sistemi depresan ilaçlar ile bir zehirlenme nedeniyle zaman en azından kısmen, bir kaza sonucu hipotermi tersine çevrilebilir 42 ya da asfeksi kardiyak arrest 43. Bizim deneysel örnekte, izoelektrik durumu giderek daha sonra ilk hızlı ECoG frekans içeriği bir azaltılmasını sağlamıştır yüksek dozda sodyum pentobarbital sistemik enjeksiyonu, bir "patlama bastırma" modunda elde edilir41,42, tamamen düz bir ECOG nihayet lider. hücre içi düzeyde, spontan aktivite ortadan kalkması Depolarizan eş zamanlı azaltılması ve hiperpolarizan membran potansiyeli dalgalanmalara benzer bir zaman bir seyir izlemektedir. Bu durumda, sodyum pentobarbital enjeksiyonu ilk aktivitesi ateş kortikal nöronlar azalmaya neden sinaptik inhibitör iletim artar varsayıldı edilebilir son olarak izoelektrik ECOG ve hücre içi faaliyetleri 29,44 sonuçlanır uyarıcı ve inhibitör sinaptik iletim aşamalı kaldırılması. Izoelektrik ECoG desen aktif den benzer geçişler Ketamine (Kişisel gözlem) ya da izofluran 45,46 gibi diğer anestetik maddelerin uygulanmasından sonra elde edilebilir.

prosedür oldukça basit görünebilir. Ancak, son derece derin koma içinde temel fizyolojik değişkenler koruyarak kaynaklı nedeniyleNormal aralıkları deney başarısı için büyük önem taşımaktadır. EtCO 2 dalgalanmalar değişiklikler trakea oluşturan bir mukus tıkaç sonucu olabilir. Böyle bir durumda, ventilatör kesilir ve mukus hızla aspire veya trakeal tüp aracılığıyla dışarı silinmelidir. Ayrıca, preparatın, mekanik stabilite, hücre içi kayıtlar için çok önemlidir. Böylece, özel çabaları ve craniotomy agaroz uygulayarak veya silikon elastomer tarafından uygun bir trakea tüp hizalama korurken dikkatle kafa hayvanın vücut akrabası ayarlayarak, damar ve solunum darbelerini azaltmak için yapılmalıdır. Felç maddenin enjekte edilmesi ile kendiliğinden kas kasılmaları önlemek için de gereklidir. Son olarak, çevresel titreşimler ve elektriksel gürültü mümkün olduğu kadar düşük olmalıdır. Diğer yayınlar detay kararlı hücre içi veya yama-kelepçe sağlayan in vivo hazırlanmasında optimum için gerekli adımları kimLe-hücre kayıtları 29,47-50.

nöronal içsel membran özellikleri ve ağlar dinamikleri ayrışmaya yeteneği bireysel nöronlar onların son derece bağlı bir ortamda bilgiyi işleme hangi mekanizma ile incelemek esastır. Giriş bölümünde belirtildiği gibi, temel nörobilimlerdeki bu merkezi konuya adamış önceki çalışmalar sonunda, in vivo hazırlıkları vs in vitro dahil, kısmen nöronlar ve incelenen ağlar ve çeşitli deneysel koşullar belirli özelliklerine, çelişkili sonuçlara yol kullanılan farklı anestezik prosedürleri (örneğin 29,36,51 için bakınız). Biz, bu yaklaşım, doğrulamak ve muhtemelen uzlaştırmak için kullanılabilir in vivo deneyler, in vitro hazırlama ve indirgenmiş elde edilen bulgular önerilmektedir. Gerçekten de, doğrudan incelenmesi ve aynı nöron ve aynı deney prosedürü esnasında karşılaştırma sağlaruyanma gibi dinamiklerden afferent sinaptik girdilerin farklı desen etkisi, canlı bir hayvanda nöronal bütünleştirici özelliklerine, hareketsizlik tamamlamak için.

Bu protokolün biri ayırt edici özelliği, çok boyutlu araştırmak için, bu tür çoklu yüzey ve derinlik EEG kayıtları, soruşturma temelli genetik olarak kodlanmış floresan göstergeler ve beynin hatta hemodinamik ve metabolik görüntüleme gibi diğer deneysel teknikleri ile kombine edilebilir, bir zamanlar hakim olmasıdır izoelektrik beyin özellikleri. Klinik ve teşhis bakış açısı olarak, nöronlar de kalıcı izoelektrik koma sırasında uyarılabilir olduğunu göstermiştir, çünkü beyin Böyle bir hastalık durumu dalmış hasta ve hayvan modellerinde, örneğin, duyu bilgi işleme kortikal işlevlerini test etmek için uygun olacağını hareketsizlik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma Fondation de France, Institut National de la Sante Et de la Recherche MEDICALE, Pierre & Marie Curie Üniversitesi ve programın 'Investissements d'avenir' ANR-10-IAIHU-06 hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

Tags

Nörobilim Sayı 109 hücre içi kayıtları, Heyecanlanma sinaptik aktivite EcoG izoelektrik serebral korteks koma fizyolojik sabitler
Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için<em&gt; İn Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S.,… More

Altwegg-Boussac, T., Mahon, S., Chavez, M., Charpier, S., Schramm, A. E. Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo. J. Vis. Exp. (109), e53576, doi:10.3791/53576 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter