Introduction
Humant immunbristvirus 1 (HIV-1) invaderar hjärnan under den akuta fasen av virusinfektion, och produktivt infekterar både mikroglia och hjärna residenta makrofager, vilket leder till deras aktivering - och frisättningen av både värdhärledda inflammatoriska mediatorer och löslig HIV-1 virotoxins såsom Tat och gp120 (ses över 1,2). Som en följd av detta blir ett kroniskt neuroinflammatoriska tillstånd etablerade i CNS, som är tänkt att bidra till patogenesen av HIV-1 associerad neurokognitiva Disorders (hand) 3-5.
Kronisk överuttryck av HIV-1 Tat eller interleukin (IL) -17A inom CNS hos möss har visat sig resultera i mikrovaskulära förtunning 6,7. Detta ökar möjligheten att kronisk neuroinflammation kan bidra till patogenesen av HAND genom effekter på den cerebrala vaskulaturen. För att ytterligare undersöka denna fråga, har vi utvecklat metoder för att kvantifiera cerebral vaskulär struktioner.
Detta dokument beskriver en metod för att kvantifiera antalet kapillär noder, kapillära segment, menar segmentlängd, total segmentlängd, menar kapillär diameter och total kapillär volym med in vivo avbildning av kapillära nätverk genom en tunn skalle kortikal fönster (modifierad från tidigare beskrivits protokoll) 8,9, såväl som ex vivo-avbildning av hjärnsektioner med användning av två-foton-mikroskopi. Denna kombinerade metod ger en helhets kvantifiering av cerebral vaskulär parametrar, eftersom in vivo tunna skallen kortikal fönster gör det möjligt att bevara den cerebrala miljön, medan ex vivo avbildning av kapillära nätverk i hjärnan skivor möjliggör återuppbyggnad av kompletta, tredimensionell kapillära nätverk - som sedan kan kvantifieras med hjälp av kommersiellt tillgängliga program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of Rochester University kommittén för djurs Resources godkänt alla granskningsåtgärder som vidtas i detta dokument.
1. Pre-kirurgisk beredning (och möss)
- Förbered operationsområdet med all nödvändig utrustning. Sterilisera alla verktyg som används under förfarandet i förväg med hjälp av 70% etanol. Du kan också använda en glaspärla autoklav eller autoklaveras för att sterilisera verktygen.
- Placera musen i en isofluran induktionskammare ansluten till en isofluran förångare. Ställ isofluran nivåerna till 4% med en hastighet av 1 l / min.
Obs: för experimenten som rapporteras här, möss med doxycyklin (DOX) inducerbara HIV-1 Tat transgen drivs av astrocyternas specifika gliafibrillärt protein (GFAP) promotor (HIV Tat-Tg möss) 10 användes för att undersöka effekten av HIV -1 inducerad neuroinflammation på cerebral vaskulär struktur, såsom tidigare beskrivits 7,10. - Tippa försiktigt induktionskammare för att observera mus &# 39; s rätande reflex. När rätande reflex har varit undertryckt, ställ isofluran nivå 2% och omdirigera luftflödet från induktionskammare till noskonen på kirurgiska bänken.
- Snabbt flytta musen från induktionskammare till vattnet infunderas värmedyna. Fortsätta att tillämpa isofluran (1,5-2%) genom noskonen. Justera anestesi enligt enskild mus tolerans bedöms genom andningsfrekvens (RR) övervakning.
Obs: sänkning av RR kan störa fysiologiska gasparametrar förändrar cerebralt blodflöde och bedömning kärldiametern. Försök att hålla RR mellan 55-65 andetag per minut. Hjärtfrekvens (HR) kan också användas bedöma djupet av anestesi; hålla HR mellan 300-450 slag per minut för att förhindra fysiologiska förändringar fartyg diameter. Typiskt kommer anestesi vara tillräckliga mellan 1,5-2,0% isofluran vid en l / min för en given mus. - Utför en tå nypa för att ytterligare kontrollera anestesidjupet. Om musen inte svarar, commENCE de kirurgiska förfaranden.
2. Beredning av tunn skallen Kraniell fönster
- Ge konstgjord tår gel för ögonen på musen. Helt ta bort hår från huvudsvålen av musen med användning av sax eller en elektrisk rakapparat.
- Sterilisera hårbotten genom applicering povidon-jodlösning; låt torka. Därefter, under ett ljusmikroskop, ta bort huden från hårbotten av musen, helt utsätta parietalben, stjärtfenan pannben och Bregma märkning.
- Applicera en liten mängd av ett 10% järnkloridlösning till skallen för att torka membranen för enkel borttagning. Ta bort de torkade membranen med # 5/45 pincett genom att försiktigt skrapa skallen.
- Applicera ett tunt lager lim runt huvudplattan fönstret. Tryck försiktigt huvudplattan mot skallen av musen, hålla intresseområdet i mitten av fönstret. Applicera en droppe av dentalcement till huvudplattan för att polymerisera limmet.
- Applicera ett tunt lagerav lim längs kanten av huvudplattan fönstret för att skapa en reservoar, i vilken för att hålla saltlösning. När limmet har torkat, skruva huvudplattan i musen huvudplattan sele.
Obs: musen huvudplattan kabelnätet som används i detta förfarande är en struktur med en metallbas och två metall kolumner. På varje kolumn finns en fjäder och en vingmutter. Huvudplattan är placerad på toppen av fjädern, och vingmuttern dras åt tills huvudet är plan och rör sig inte. - Ta bort eventuella lim från huvudplattan fönstret med en borrkrona fäst vid en Microtorque borrmaskin inställd på 6000 rpm. Stoppa varje 10-15 sekunder för att förhindra överhettning av mus kranium som kan leda till strukturella skador på fartyg.
- Med hjälp av en ny borrkrona, placera Microtorque borren 1,5 mm i sidled från mittlinjen (en tredjedel av diametern hos huvudplattan fönster). Börja tunna skallen runt denna plats på 4000 rpm. Flytta borren försiktigt över skallen med någon direkt press nedåt.
- Upphör drilLing var 10-15 sekunder för att förhindra överhettning musen kranium. Under denna tid, ta bort den ackumulerade skallen damm med en trycklufts kapsel.
- Använd droppar RT koksaltlösning för att kyla kraniet för 5-10 sek. Försiktigt bort all vätska med en mjuk vävnad för att fortsätta skallen gallring.
- För den slutliga gallring av skallen, placera en liten volym saltlösning i huvudplattan reservoaren och lätt sopa en tandmikro över området av intresse tills små fartyg är klart synliga.
3. Övervakning av fysiologiska parametrar
- När skallen är helt förtunnas, ur musen från hållaren och placera den på ryggen. Tejpa försiktigt ned båda bakbenen att tydligt exponera mediala lår.
- Ta bort hår över både mediala lår med sax eller en elektrisk rakapparat. Desinficera den kirurgiska platsen genom att täcka låren med povidon-jod.
- Nyp huden på den mediala högra låret ovanför lårbensvenenoch artär med hjälp av # 5 pincett. Dra försiktigt ut huden uppåt och använda sax för att klippa och ta bort huden.
Obs: vänster lår är reserverad vid kirurgiska komplikationer (vaskulära anomalier, brustna kärl). - Applicera ca 3-5 droppar 0,9% koksaltlösning till operationsområdet. Detta möjliggör större förstoring av fartyg, samt att hålla webbplatsen återfuktad och förhindra torkning av fartygen. Separera lårbensvenen från artär genom att rakt på sak dissekera i lårbens neurovaskulära knippet med två # 5/45 pincett.
- Placera två, tre cm bitar av kirurgisk sutur under lårbensartären ca 1 cm mellanrum. Vrid övre suturen medurs för att skapa en vaskulär kompressor som kommer att bidra till att förhindra överdriven blodförlust under kateterisering.
- Gör ett litet snitt i lårbensartären med hjälp av fjäder sax. Placera katetern i artären genom snittet och avancera tills katetern är säkert inuti artären.
- Injicera 10 il heparin (100 IU / ml) genom katetern för att förhindra blodproppar. Stäng sedan kirurgiskt höger lår genom att sy ihop huden med en 4-0 sutur i en enkel avbruten mönster.
- Injicera 50 ul av uretan (1,2 mg / g) intraperitonealt i den högra nedre kvadranten. Fem minuter senare upprepa med en annan 50 ul injektion till den vänstra undre kvadranten för totalt 100 pl av intraperitoneal uretan. Sakta minska isofluran nivåerna till ca 0,25%, medan samtidigt upprepning av kontrollen musen för anestesidjupet.
Obs: Håll nålen ytliga i bukhålan längs den bakre bukväggen så att det inte perforera tarmen. Detta kan åstadkommas genom att klämma den abdominala rectus muscles bort från inälvor och sedan injicera. - Med användning av ett kapillärrör, samla ett prov 40 | al av arteriellt blod från katetern. Fäst katetern till blodtrycksomvandlare utrustad med en saltlösningsfylld fyra-vägs avstängningskran och heparin fylld spruta.
- Tape omvandlare blodtrycket till den kirurgiska anordningen för att förhindra oavsiktlig borttagning av katetern. Börja övervakning av medelartärtryck.
- Sätt i blod fyllda kapillärröret i en blod gasanalysator ingångsöppningen. När allt blod har utvunnits, ta bort kapillärröret från ingångsöppningen. O 2 och CO 2 blod gasnivåer visas på ett papper som skrivs ut från blod gasanalysatorn.
4. Injektion av det fluorescerande färgämnet
- Nyp huden på den mediala vänster lår med hjälp av # 5 pincett. Dra försiktigt ut huden uppåt och använda sax för att klippa och ta bort huden. Förbered dextran konjugerade röda avger rodaminfärgämne(70 kDa) (10 mg / kg löst i koksaltlösning).
- Leta reda på lårbens vein.Using en 1 ml spruta med en 30 G nål fäst, rita en tidigare framställd lösning av ett fluorescerande färgämne lämplig för avbildning till 130 pl linje sprutan. Ta bort alla luftbubblor genom att dra färgen helt i sprutan och stadigt snärta sprutan väggen.
- Böj 30 G nål på en cirka 30 graders vinkel genom att trycka den mot en hård yta avfasning uppåt. Fyll nålen med färgämnet och kassera överflödig vätska, som lämnar ett prov 100 | il.
- Injicera provet av färgämnet 100 pl långsamt i femoralvenen. Efter avlägsnande av nålen, applicera stadig, försiktigt tryck mot injektionsstället för att stoppa blödning. Låt färgen att cirkulera under 5 minuter.
Obs: alternativt kan den högra femoralvenen användas i stället för det fluorescerande färgämnet injektion för att förhindra ytterligare blodförlust genom att skapa en annan operationsområdet. Dessutom, om dendjur blöder okontrollerat från operationsområdet, kan detta vara en indikation på att alltför mycket heparin gavs för att spola katetern. Om det inte finns någon koagulering inom 10-15 minuter och musen är fortfarande blöder, överväga att starta experimentet med en ny mus. - Stäng den vänstra låret genom att sy ihop huden med en 4-0 sutur, sedan försiktigt vända musen på sin mage, och placera den i musen huvudplattan sele.
5. In vivo Två Photon Imaging
- Flytta den kirurgiska apparaten till två-photon mikroskop och se till att upprätthålla kontinuerliga anestesinivåer. Placera en liten mängd av 0,9% saltlösning i huvudplattan reservoaren och sänk mikroskopobjektivet, så att det kommer i kontakt med saltlösningen. Lokalisera området av intresse med hjälp av ljusfält-visning mål
- Ställ in två-foton-laserexcitering till en våglängd lämplig för det fluorescerande färgämnet. Börja två-photon avbildning med 25x oÅL.
Observera att vi i dessa experiment använde en dextran konjugerad till en röd emitterande rodaminfärgämne som exciterades vid en våglängd av 780 nm. En 607/36 bandpassemissionsfilter för att detektera fluorescens från färgämnet, och ett 480/20 bandpassemissionsfilter användes för att detektera artär autofluorescens - Leta upp en kapillär säng på vyn skärmen och förstora det här området med hjälp av optiska zoom 2. Förvärva bilder av kapillärerna som använder två-foton bildprogram.
- Efter bildbehandling är klar, offra musen genom halsdislokation följt av halshuggning.
6. Ex vivo Två Photon Imaging
- Med användning av de extra fina saxar, göra ett snitt i hårbotten från interparietal ben till de främre benen hos musen. Fäst huden till sidorna av skallen med pekfinger och tumme.
- Placera extra fina sax under den mediala interparietal ben och skär skallen längs sagittala suturen. Sluta skära skallen ca 3 mm efter bregma märkning.
Obs: Applicera ett tryck uppåt när du skär skallen för att förhindra att skära hjärnan. - Använda # 5 pincett, separera skallen från hjärnan och försiktigt bort eventuella hjärnhinnorna från ytan av hjärnan. Återstående meninger kan oavsiktligt SARGA hjärnan; extrem försiktighet bör vidtas för att undvika detta. Skjut försiktigt # 5 pincett under hjärnan framåt sakta framåt tills hjärnan är fritt från skallen.
Observera: att nedåtriktat tryck bör användas för att undvika punktering av hjärnan. - Placera hjärnan i en hjärna sektione verktyg specifikt för möss. Tvätta hjärnan genom att applicera droppar av artificiell cerebrospinalvätska över hjärnan.
- Ta bort en 2 mm koronalt avsnitt av hjärnan från bregma 0 till bregma -2. Placera den koronala sektionen på en konkav glasskiva innehållande artificiell cerebrospinalvätska med 0 bregma (mest kraniala delen av sektionen) vänd uppåt. Försiktigt täcka hjärnan slis med en glaskupa halka.
Obs: Undvik att trycka glaset en gång placerats på hjärnan avsnittet eftersom detta kan deformera kärl arkitektur. - Överför bilden till mikroskop scenen och placera en liten mängd av 0,9% koksaltlösning på locket halka. Sänk mikroskop målet tills den kommer i kontakt med koksaltlösning. Leta reda på mittlinjen av hjärnan med hjälp av brightmålet.
- Börja två-photon avbildning och lokalisera mittlinjen igen med hjälp av 25x mål. Åstadkomma detta genom att leta efter den längsgående spricka på kortikala ytan av coronal sidan. Placera den högra kanten av bildskärmen på mittlinjen och flytta betraktaren skärm över sidled tre kompletta ramar (cirka 1,5 mm från mittlinjen).
Observera att i dessa experiment, bildparametrar var identiska med dem som nämns i noten i steg 5.2. - Leta reda på djupet där kapillärerna knappt syns på skärmen Visa. Sänk fokalplanet ytterligare 20xm för att bestämma början av z-stack.
- Ställ in bildtjockleken till 1 | im. Sänk visa skärmen för 100 pm och justera lasereffekt i hela så att mindre än 1% av bildpunkterna är övermättad.
Anmärkning: z-stack bilder sammanställs från en serie av 100 rad 500x500x1 um bilder. Ju större z-stack de mer exakta efterbehandlingen beräkningar kommer att ha. I allmänhet försöker samla in en z-bunt med 100 | j, m eller större. - Tryck på ikonen XY Repeat följt av intilliggande XY-ikonen. När z-stack är klar, tryck på ikonen serien Klar och spara filen.
7. Data Processing
- Öppna en in vivo kapillär bild i ImageJ programvara. Manuellt ställa in pixel distansförhållande bygger på värden som erhållits från de två-fotonen programvara.
- Välj * raka * ikonen från verktygsmenyn. Rita en linje som sträcker sig från en kapillär väggen till OPPOsite kapillärväggen, och registrera längden från ImageJ.
Notera att det kan vara nödvändigt att zooma in bilden för att tydligt visualisera kanter kapillärväggarna. - Upprepa steg 7.1.1 vid olika ställen längs kapillären, liksom för flera kapillärer i bilden.
- Välj * raka * ikonen från verktygsmenyn. Rita en linje som sträcker sig från en kapillär väggen till OPPOsite kapillärväggen, och registrera längden från ImageJ.
- Öppna z-stack filen till den analytiska program som Amira. Välj Tråd Editor ikonen från under verktygsfältet
- Ställ in tittaren tjockleken till ungefär 20. Flytta betraktaren att antingen toppen eller botten av z-stack.
- Välj ikonen Trace och flytta markören över den inlästa bilden. Placera noder på kapillärerna vid platser som beskrivs i figur 2C; segment visas automatiskt mellan angränsande noder. Trace kapillärer genom hela z-stack.
Notera: det kommer att bli nödvändigt att placera noder mellan ändpunkterna och förgreningspunkter i syfte att spåra kapillärerna thrOughout z-stacken. - För att ta bort dessa noder genom att klicka på Ta bort Mellan ikonen.
Obs: Detta kan skapa felaktiga sling segment som måste tas bort manuellt genom att välja slingan med hjälp av Select Single ikonen och sedan klicka på ikonen Ta bort markerade. Om loopar fortsätter att visas i samma område under spårning, är det troligt att noderna placerades på olika kapillärer. - När spårning är klar väljer du Graph Info ikonen för att öppna ett kalkylblad som innehåller de automatiskt extraherade vaskulära parametrar. Antalet noder och segment finns på huvudvyn skärmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tunna skallen kortikal fönster möjliggör in vivo två-photon avbildning av kortikala kapillärer (figur 1). Ett lämpligt område att bilden visar många, olika kapillärer (figur 1A). I samma synfält, det finns ingen artärcellväggs autofluorescens, och det kan finnas andra fluorescerande signaler, såsom kollagen fluorescens, som induceras av andra harmoniska generationen 11 (Figur 1B).
När framställningen av hjärnan skiva är klar, en avbildning område ca 1,5 mm från mittlinjen är belägen (Figur 2A). En 100 pm z-stack ger en tredimensionell bild som används för analys i Amira analytiska programvara (Figur 2B). Det kapillära nätverket sedan manuellt spåras genom att placera noder i början och slutet av en kapillär eller någon plats där en kapillär Brancher till en annan (figur 2C). Detta ger en helt skeletonized bild som morfologiska parametrar automatiskt extraheras (figur 2D). Antalet kapil noder, segment, betyder segmentlängden, totala segmentlängden, och total kapillär volym kan extraheras med användning av två-foton-ex vivo-avbildning av mus hjärnan skivor (figur 2).
Figur 3 visar representativa resultat som erhållits med användning av förfarandet som presenteras i detta dokument. I detta experiment var en transgen musmodell av HIV neuroinflammation används 10. Produktion av HIV virotoxin Tat inducerades i Tat + möss genom doxycyklin-infunderas mat under 12 veckor. Kontrollgruppen bestod av tat- samma kull livnärde samma mat. Det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad mellan Tat + och tat- möss i något av de kapillära parametrar som mäts. Således, 12 veckors exponering av hjärnan tisstämma till HIV-1 Tat är otillräcklig för att orsaka förtunning av hjärnan mikrovaskulaturen. Däremot våra tidigare publicerade data visar att mer långvarig (20 veckor) kronisk CNS uttryck av Tat resulterar i förtunning av cerebral kärl 7. Således, de som uppges här (Figur 3) ger värdefull ny information när det gäller kinetiken av Tat-inducerad kärlremodellering inom CNS hos möss.
Figur 1. Förvärv av kortikal kapillärdiameter. (A) Efter en tunn-skalle kortikal fönster förberedelse och intravenös fluorescerande färgämne injektion var två-photon mikroskopi för att bilden cerebral kärlsystemet. I våra experiment använde vi en dextran konjugerad till en röd emitterande rodaminfärgämne som exciterades vid 780 nm och fluorescens visualiserades genom ett 607/36 bandpassemissionsfilter.
Figur 2. Generering av skeletonized kapillära nätverk. (A) Möss injicerades intravenöst med ett fluorescerande färgämne och avlivades. En 2 mm koronala delen av hjärnan togs mellan bregma 0 och bregma -2, och avbildning utfördes vid 0 bregma ca 1,5 mm från mittlinjen. en representativ bild av kortikala plats som valts för avbildning (svart låda) från en C57BL / 6 mus visas. Denna region, SOMatosensory cortex, valdes eftersom vi tidigare har visat att dysreglering av cerebral blod kan ske på denna plats i Tat + möss 12. (B) Representational tredimensionella z-stack bilder av kapillärnäten. (C) Diagram över den metod som används för att manuellt spåra kapillärer under fartygets kvantifiering. (D) representativ bild av skeletonized z-stack bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kvantifiering av cerebral vaskulär arkitektur i tat- möss kontra möss som exponerats för kandidaten HIV virotoxin Tat for 12 veckor. Möss med en doxycyklin (DOX) inducerbar HIV-1 Tat-transgenen driven av astrocyt specifika gliafibrillärt protein (GFAP) promotor (HIV-Tat--Tg-möss) användes för att undersöka effekten av HIV-1-inducerad neuroinflammation på cerebral vaskulär struktur, som beskrivs 7. Dessa möss (Tat +, n = 3) exponerades för en kronisk (12 vecka) regim av Tat-induktion (dvs.., 12 veckors DOX). Tat- möss (n = 4) användes som åldersmatchade kontroller (dessa möss motsvarar icke-transgena kullsyskon i Tat + möss, och därför inte uttrycker HIV-1 Tat). Liksom Tat + möss, de tat- mössen fick också 12 veckors DOX exponering. I de möss som exponerats för Tat under 12 veckor (Tat +), jämfört med dem som inte exponerats för Tat (tat-), fanns det ingen statistiskt signifikant skillnad i antalet noder (A), antalet segment (B), medelvärde segmentlängd (C), eller total kapillärlängd (D), kapillär diameter (förTAT + möss, analyserade vi 14 kapillärer i 6 avbildningsområden; för tat- möss, analyserade vi 7 kapillärer i 4 avbildnings områden) (E), eller total kapillär volym (F). Eftersom uppgifterna inte var normalfördelade (bestämd enligt Shapiro-Wilk test), var exakt Wilcoxon rangsummetest används för att beräkna statistisk signifikans (bestämd i detta fall P <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här kan användas för att analysera hjärn mikrovaskulära strukturer i ett brett spektrum av experimentella modeller / inställningar. För att lyckas med denna metod, måste tre kritiska steg bemästras. För det första måste den tunna skallen fönstret inte skadar skallen eller underliggande hjärnan. Det är lätt att punktera skallen vid gallring, eller orsaka värme vaskulär läckage. Detta kan störa avbildning som det fluorescerande färgämnet kommer att läcka in i fokalplanet och skymma kapillärerna. Om skallen bryter ofta under den tunna skallen förberedelser, är det sannolikt orsakas av för stort tryck nedåt. Håll Microtorque borren så nära som möjligt till Burr möjliggör större taktil kontroll som kommer att minska trycket nedåt på skallen.
För det andra bör arteriell katetrisering inträffa så snabbt som möjligt efter det att artären har skurits. Underlåtenhet att föra in katetern snabbt kan orsaka överdriven blodförlust som kommer compromise den fysiologiska integriteten hos musen. Svårt att sätta i katetern är oftast på grund av den relativt stora storleken på katetern i förhållande till lårbensartären. Det kan vara nödvändigt att sträcka katetern i syfte att minska dess diameter. Dessutom kan spetsarna på # 5 pincett kan användas för att fånga och förstora öppning i artären för att underlätta i placeringen av katetern.
Tredje bör varaktigheten av de in vivo-kirurgiska förfaranden minimeras så att den uretan anestesi kan administreras så snart som möjligt. Den isoflurananestesi kan orsaka vasodilation av cerebrala blodkärl 13, vilket sneddata kapillär diameter.
Det bör erkännas att Amira analytiska programvara automatiskt kan extrahera radier manuellt spåras fartyg; Men när man använder denna funktion för att analysera z-stack bilder ex vivo hjärnor, är värdet felaktig. Detta beror på att, after avlägsnande av hjärnan, hjärn kapillärerna inte längre tryck, och kan bli morfologiskt förvrängd. Mätning in vivo kapillärdiameter kringgår detta problem eftersom kapillärerna är trycksatta under normala, fysiologiska förhållanden.
Det skall också noteras att denna metod inte är utan begränsningar. Först betydande utbildning som krävs för att behärska vivo imaging beredningen i. En forskare måste lära sig att effektivt utföra två tekniskt utmanande tekniker (tunna skallen kortikal fönster och arteriell kateterisering); ett fel i någon teknik kan äventyra experimentet och ogiltiga data. För det andra, är analys av ex vivo z-stackar tidskrävande. Den skeletonization av ett z-stack bild kan ta upp till 2,5 timmar. Dessutom är det lämpligt att denna analys kompletteras med en erfaren forskare för att säkerställa samstämmigheten i skeletonization processen (som innefattar en noggrann manuell trHANTERA av blodkärl).
När alla aspekter av detta protokoll behärskas de uppgifter som erhålls ge en mer djupgående och fysiologiskt korrekt kvantifiering av vaskulära parametrar i jämförelse med andra traditionellt använda metoder som visar kapillärtäthet som kapillärer per volymenhet, eller kapillärer per synfält. In vivo imaging teknik möjliggör för studier av andra parametrar, bland annat, men inte begränsat till, röda blodkroppar hastighet, arteriole utvidgning, och röda blodkroppar flux 7,12, vilket också kan ha möjlighet att prövas i longitudinella studier. Dessutom kan den lätt anpassas och modifieras för att studera frågeställningar relaterade till hjärnan mikrovaskulära struktur. Sådana studier kan omfatta kvantifiering patogena förändringar i kapillär morfologi i andra neurokognitiva sjukdomar, eller mäta åldersrelaterade förändringar i kapillärtäthet. Därför är den metod som presenteras i detta dokument ett mångsidigt och kraftfullt verktyg för quantitative analys av cerebral vaskulär arkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica Microscope | Leica Inc. | MZ8 | |
| High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner | 180 | |
| Heating Pad | Stryker | TP3E | |
| T/PUMP | Gaymar Industries, Inc. | TP-500 | |
| TEC-4 Isoflurane Vaporizer | Datex Ohmeda | 447 | |
| Artificial Tear Gel | Butler AHS | 7312 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 52380-1855-9 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Ferric Chloride Solution | Ricca Chemical Company | 3120-16 | |
| Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel | Henkel | 45404 | |
| Dental Cement | Stoelting | 51459 | |
| Microtoruqe II Handpiece Kit | Pearson Dental | R14-0002 | |
| 005 Burr for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Norland Blade (Dental Microblade) | Salvin Dental | 6900 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Group 2B Carcinogen |
| Braided Suture | Ethicon | 735G | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Arterial Catheter | SAI Infusion Technologies | MAC-01 | The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. |
| Blood Pressure Moniter | World Precision Intruments | SYS-BP1 | |
| Blood Pressure Transducer and Cable | World Precision Intruments | BLPR2 | |
| RAPIDLab Blood Gas Analyzer | Siemens | 248 | |
| 40 μl Capillary Tube | VWR | 15401-413 | |
| Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) | Invitrogen | D-1830 | |
| Adult Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope | Olypmus | FV-1000 MPE | |
| MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Spectra-Physics | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health (NIH) | Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Amira Software | Visage Imaging |
References
- Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
- Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28 (2006).
- Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).
- Clifford, D. B., Ances, B. M.
- Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).
- Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8 (2), e57307 (2013).
- Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).
- Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).
