Summary
هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل المرتبطة MTOC في البويضات.
Introduction
الانقسام الاختزالي هو عملية تقسيم الفريدة التي تحدث في الأمشاج (البويضات والحيوانات المنوية) وينطوي على قسمين متتالية دون التدخل تخليق DNA لفصل الكروموزومات المتماثلة والصبغيات الشقيقة خلال الانقسام الاختزالي-I والانقسام الاختزالي الثاني على التوالي 1. أخطاء في كروموسوم العزل خلال الميتوزي في البويضات يمكن أن يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات، وهي التي ورثها الجنين أثناء الإخصاب. ومن الجدير بالذكر أن حدوث عدم توازن الصبغيات في الأجنة النامية يزيد مع تقدم عمر الأم وسبب رئيسي من العيوب الخلقية، فضلا عن فقدان الحمل في النساء 1،2، وبالتالي، مما يؤكد حاجة مهمة لفهم الأساس الجزيئي لعدم توازن الصبغيات أثناء الانقسام الانتصافي .
أثناء انقسام الخلية، الصبغي الفصل يعتمد بشكل حاسم على تجميع جهاز أنيبيب المغزل وإنشاء مستقرة التفاعلات كروموسوم أنيبيب لمرفق الصحيح لالمغزل المعاكسالقطبين. الأهم من ذلك، تشكيل المغزل الانتصافي في البويضات الثدييات يختلف من الانقسام في الخلايا الجسمية، وتنظمه مراكز تنظيم أنيبيب فريدة من نوعها (MTOCs) التي تفتقر centrioles 3،4. البروتينات الضرورية اللازمة لالتنوي أنيبيب وتنظيم توطين لMTOCs البويضة، بما في ذلك γ تويولين أن يحفز التجمع أنيبيب. بالإضافة إلى ذلك، pericentrin الوظائف باعتبارها بروتين السقالات الضروري، الذي يربط والمراسي γ تويولين فضلا عن عوامل أخرى في MTOCs 5. والجدير بالذكر أن تظهر دراستنا أن استنزاف من البروتينات الرئيسية MTOC المرتبطة يعطل منظمة المغزل الانتصافي ويؤدي إلى أخطاء كروموسوم الفصل في البويضات التي لم يتم حلها بشكل كامل من قبل حاجز الجمعية المغزل (SAC) 6،7. ولذلك، عيوب في الاستقرار المغزل، التي لا تؤدي إلى اعتقال الانتصافي، تشكل خطرا كبيرا في المساهمة في عدم توازن الصبغيات. وعلى الرغم من دورها الأساسي في التجمع المغزل والتنظيم، بروت البويضة MTOCتكوين عين وظيفة تزال غير مفهومة تماما.
اختبار وظيفة البروتينات المستهدفة المحددة في البويضات الثدييات هي صعبة، إذ تصبح الخلايا هادئة transcriptionally قبل استئناف الانقسام الاختزالي 8،9 قريبا. وبالتالي، البويضات ما قبل التبويض تعتمد على مخازن مرنا الأمهات لاستئناف الانقسام الاختزالي ودعم الميتوزي فضلا عن الانقسامات انشقاق الأولى بعد الإخصاب 10،11. وراسخة فعالية تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تدهور بوساطة من النصوص مرنا في البويضات الثدييات والرنا الأمهات تجنيدهم للترجمة خلال نضوج الانتصافي قابلة بشكل خاص لسيرنا استهداف 12-14. ولذلك، Microinjection من الرنا التدخل قصيرة (الرناوات siRNAs) إلى البويضات يوفر نهجا قيما لتستنزف من mRNAs المستهدفة للاختبار وظيفي.
هنا، نحن تصف طرق لعزل البويضات الماوس واستنزاف بوساطة سيرنا من transcri محددةنقطة لاختبار وظيفة البروتين الضروري MTOC المصاحب، pericentrin. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الظروف التحليل المناعي لتقييم تكوين المغزل الانتصافي في البويضات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة جورجيا.
1. الاستعدادات
- للثقافة بويضة أو شراء أو طازجة إعداد الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) وتكملة مع 3 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) كما هو مبين في الجدول رقم 1 ضع زجاجة البوليسترين على التوازن تحميل (الفارغة إلى الصفر). إضافة كافة الكواشف، إلا BSA، في النظام وإظهار الحجم النهائي مع MQ-المياه وزنا إلى ما مجموعه 250 غرام. قم بإضافة BSA، تسمح بحل وتصفية تعقيم.
ملاحظة: MEM المتوسطة وصفها يتطلب موازنة وحضانة خلية تحتوي على خليط الغازات الطبية من 5٪ CO 2، 5٪ O 2 و 90٪ N 2. لكن وسائل إعلام أخرى (على سبيل المثال، CZB) يمكن استخدامها التي تسمح للحضانة خلية في 5٪ CO 2 تحت الظروف الجوية. - لالبويضة microinjection، شراء أو تحضير M2 المتوسطة.
- تحضير صفرس النهج السائد في المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) إلى تركيز 5 وحدة دولية / 100 ميكرولتر.
- شراء وإعادة الأسهم سيرنا إلى تركيز العمل من 1 ميكرومتر.
2. ماوس سيت مجموعة
- DAY 1: لتحفيز التنمية جراب المبيض وزيادة عدد بصيلات ما قبل التبويض، وإدارة 5 وحدة دولية من PMSG البريتونى لإناث الفئران 48 ساعة قبل جمع البويضة.
- DAY 3: لجمع البويضة والثقافة، وإعداد أطباق ثقافة 35 ملم مع 3 مل من MEM / BSA تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل ميلرينون. يحافظ هذا المانع phosphodiesterase البويضات في الطور الأول-I اعتقال ويمنع انهيار حويصلة جرثومي (GVBD). تتوازن أطباق الثقافة في خليط الغازات الطبية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
مطلوب ميلرينون وسائل الإعلام في جميع أنحاء تستكمل جمع البويضة، وكذلك البويضة microinjection و24 ساعة الانتظار ثقافة فترة ما بعد سيرنا: مذكرة. - استرداد المبيضين من إناث الفئران باستخدام مختبر أنشئت يمارس 15 ونقل إلى صحن الثقافة الجديد مع قبل حرارة ومعايرتها MEM / BSA / ميلرينون.
- مكان الطبق الثقافة في مرحلة من مراحل stereomicroscope لجمع البويضة. الإفراج الركامية-بويضة المجمعات (COC ل) من خلال ثقب الجريبات الغارية مع 27 الإبر G يدويا. إصلاح مبيض واحد إلى أسفل الطبق الثقافة، مع إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل، واستخدام إبرة الثانية لثقب جميع المسام الكبيرة. كرر لكل المبيض.
- باستخدام إجراءات الفم pipetting لالقياسية أو غيرها من وسائل تطلع البويضة، وجمع كل البويضات التي تحيط بها 2 أو أكثر من طبقات من الخلايا الركامية المدمجة. نقل وCOC إلى طبق جديد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- بعناية إزالة الخلايا الركامية المحيطة المتكررة pipetting لطيف مع ماصة 1 مل تعيينها إلى حجم الطموح من 750 ميكرولتر. كرر الخطوة pipetting لحوالي 12 مرةوالسماح للبويضات لاسترداد لمدة 5 دقائق. تستمر بهذه الطريقة حتى كل أو قد أزيلت معظم الخلايا الركامية. نقل البويضات الجرداء إلى صحن ثقافة أخرى والسماح للتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- تخصيص البويضات الجرداء إلى ثلاث مجموعات تجريبية لاستخدامها في: (ط) Microinjection من الرناوات siRNAs محددة مقابل هدف الفائدة، (ب) Microinjection من غير محددة (مراقبة) الرناوات siRNAs، و (ج) مجموعة غير حقن السيطرة لحساب شروط الثقافة.
3. سيت Microinjection
- إعداد أطباق الثقافة مع 3 مل سائل الاعلام M2 تستكمل مع ميلرينون (1 ميكروغرام / مل) للبويضة microinjection. إعداد أطباق الثقافة التي تحتوي على MEM / BSA / ميلرينون لغسل والثقافة لاحقة من البويضات حقن.
ملاحظة: M2 المتوسطة يحتوي HEPES العازلة ويتطلب قبل الاحترار عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحت الظروف الجوية. يتطلب MEM ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وموازنة باستخدام الغازات الطبية وصفهد أعلاه. - إعداد نظام microinjection. تحميل إبرة الحقن مع 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر حل سيرنا محددة. تأمين ماصة عقد وحقن إبرة لmicromanipulators النظام microinjection وانشاء وحدة حقن مع حجم والضغط معايرة.
- وضع 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الإعلام في الداخل غطاء صحن الثقافة 3 سم وإضافة بويضة لإعداد والمواءمة بين نظام microinjection.
- باستخدام بويضة كدليل، وضبط مواقف القابضة وحقن الإبر. تطبيق الضغط السلبي على ماصة عقد لتأمين بلطف البويضة وضبط الموقف من إبرة الحقن على أوسع قطر للخلية. ضبط الإعدادات لتسمح Microinjection من حوالي 10 رر من الحل سيرنا في أي مكان في سيتوبلازم البويضة.
تعيين الرقم 1. البويضة microinjection تصل. ( - العودة غطاء لمرحلة stereomicroscope وإضافة 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من وسائل الاعلام M2 الطازجة. إضافة مجموعة من البويضات (~ 10) إلى الانخفاض الجزئي من قبل pipetting الفم، أو الطرق البديلة، ثم يعود الغطاء مع انخفاض الصغير إلى مرحلة microinjection.
- انتقل إلى microinject البويضات الفردية. تأمين بويضة واحدة مع ماصة عقد، تضاف ببطء غيض من إبرة الحقن في السيتوبلازم وطرد حجم الحقن من حل سيرنا. سحب بعناية إبرة الحقن ومولقد البويضة المحقونة إلى موضع في الجزء السفلي من الهبوط الجزئي. نقل البويضات حقن دون جدوى لوضع في الجزء العلوي من الانخفاض الجزئي.
- كرر الإجراء microinjection مع كل بويضة. للحفاظ على أفضل قابلية البويضة، microinject سوى عدد قليل من البويضات في كل مرة. تأكد من أن هذه العملية لا تستغرق أكثر من بضع دقائق لمنع درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات في الانخفاض الجزئي.
- نضح حقن بنجاح البويضات أو نقل بعناية غطاء مع انخفاض الصغير من البويضات حقن لstereomicroscope. نقل البويضات القابلة للحياة حقن من قبل pipetting الفم أو طرق بديلة، إلى ذاكرة / BSA / ميلرينون المتوسطة لغسل وتتوازن عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام مجموعة أخرى من البويضات، كرر العملية microinjection مع إبرة حقن جديدة محملة الرناوات siRNAs غير محددة لمجموعة المراقبة. غسل البويضات في MEM / BSA / ميلرينون ونقل إلى صحن الثقافة منفصل.
- ثقافة جميع فئاتالبويضات لمدة 24 ساعة في MEM / BSA / ميلرينون عند 37 درجة مئوية تحت جو من الغاز الطبي.
ملاحظة: مطلوب "كتلة ميلرينون" فترة ثقافة للهدف كفاءة نضوب مرنا / البروتين.
4. سيت الثقافة للنضوج الانتصافي
- DAY 4: لكل المجموعة التجريبية البويضات انشاء 4 أطباق الثقافة (35 ملم) مع 3 مل MEM / BSA. تكملة طبق وسائل الإعلام واحد لكل مجموعة مع 10٪ (جودة عالية) مصل بقري جنيني (FBS) لاستخدامه في نضوج البويضة. السماح لجميع الأطباق الثقافة لكي تتوازن عند 37 درجة مئوية مع خليط الغازات الطبية.
- إطلاق سراح البويضات من "كتلة ميلرينون، بالتتابع غسل البويضات ثلاث مرات في الأطباق التي تحتوي على MEM / BSA ومن ثم نقل البويضات إلى الطبق النضج تحتوي على وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. ثقافة جميع الفئات البويضة لمدة 17 ساعة على 37 درجة مئوية، لتمكين استئناف وتطور الانقسام الاختزالي.
- DAY 5: إعداد الحلول لبويضة fixaنشوئها، بما في ذلك: (ط) بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في المخزن بيم (100 أنابيب ملي [الرقم الهيدروجيني 6،9]، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم EGTA) مع 0.5٪ تريتون-X 100، و (ثانيا) تستكمل برنامج تلفزيوني مع 5 FBS٪ التي سيتم استخدامها لغسل ومنع البويضات.
ملاحظة: تتطلب هذه الحلول الاحترار مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل البويضة التثبيت. - لتثبيت البويضة (بعد ثقافة 17 ساعة)، بسرعة نقل كل مجموعة التجريبية من البويضات قبل pipetting الفم أو الأساليب البديلة في الآبار الفردية (طبق 4 جيدا) التي تحتوي على 750 ميكرولتر من قبل حرارة 4٪ PFA حل واحتضان عند 37 ° C لمدة 1 ساعة. بعد ذلك يغسل كل مجموعة من البويضات 3 مرات (15 دقيقة لكل منهما) في 750 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت تحتوي على 5٪ FBS.
- البويضات كتلة في 200 ميكرولتر PBS / 5٪ FBS O / N عند 4 درجات مئوية للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.
5. تحليل المناعي
- DAY 6:
يتم المناعية في لوحة متعددة جيدا وشركة النفط العمانية: مذكرةيتم نقل ytes متسلسل إلى الآبار متتابعة، التي تحتوي على حلول الأجسام المضادة وغسل منها. إما 48 أو 96-جيدا لوحات يمكن استخدامها، ببساطة ضبط حجم حل يقوم على حجم جيد. لوحات 96-جيدا استخدام 200 ميكرولتر لكل بئر. يتم نقل البويضات إلى حلول مختلفة في الترتيب التالي: حل الأجسام المضادة الأولية - 3 آبار غسل - حل الضد الثانوية - 3 آبار غسل. للحد من التعرض للضوء لوحة يمكن تغطيتها بورق.
إعداد الطازجة PBS / 5٪ FBS واستخدام هذا الحل لإعداد التخفيفات الأجسام المضادة (مثل أرنب المضادة للpericentrin (1/1000)، والماوس مكافحة تويولين (1/1000)). - نقل البويضات ثابتة من كل مجموعة التجريبية لالآبار الفردية التي تحتوي على 200 ميكرولتر (أو 100 ميكرولتر، إذا كانت هناك رغبة أقل حدة التخزين) من حل الأجسام المضادة الأولية وتغطية البئر مع parafilm. احتضان وفقا لشروط محددة الضد الأمثل (على سبيل المثال، 37 ° C لمدة 1 ساعة أو 4 درجات CO / N).
ملاحظة: dilutio الأجسام المضادة الأوليةن وكذلك فترة حضانة معينة ودرجة الحرارة يتطلب اختبار لتحديد الظروف المثلى لالأجسام المضادة المختلفة المستخدمة. - بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما).
- نقل البويضات في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق (على سبيل المثال، 1/1000 تخفيف المضادة للأرنب ومكافحة فأر الأجسام المضادة مترافق مع fluorochromes من أطوال موجية مختلفة). احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
- غسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما).
- بعد الخطوة غسل النهائي، ونقل البويضات على شريحة زجاجية نظيفة بلطف ونضح أي حل غسل الزائد. وهذا لشل حركة البويضات على سطح الزجاج. إضافة 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام (التي تحتوي على دابي) وتراكب بعناية وسائل الإعلام المتصاعدة مع 22 مم × 22 مم زلة تغطية. خفض ساترة ببطء لتجنب احتباس فقاعات الهواء و / أو إتلاف البويضات.
ملاحظة: بدلا من ذلك، للحفاظ على الممتلكات 3-dimentional من بويضة للتحليل المجهري متحد البؤر، إضافة كمية صغيرة من 100 الخرز الزجاجي ميكرون (مختلطة مع الفازلين) إلى زوايا من انزلاق الغطاء قبل تصاعد على الشريحة. - متجر الشرائح في 4 درجات مئوية، أو الشروع في تقييم التقدم الانتصافي وكذلك تحليل مستويات التعبير والتحت خلوية البروتين توطين باستخدام المجهر مضان مجهزة مرشحات اللازمة لتتناسب مع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوفر Microinjection من الرناوات siRNAs نهج فعال لتدهور مرنا واستنزاف البروتين لاحق في البويضات، والتي تمكن الاختبارات الوظيفية بكفاءة ومحددة للغاية من العوامل المستهدفة المختلفة في المختبر. بعد ذلك، يتم استخدام المناعي للتحليل النمط الظاهري محدد وكذلك للتحقق من صحة استنزاف البروتين في البويضات حقن سيرنا. في المثال الحالي، ووضع العلامات الفلورية من البويضات الفردية مع دابي جنبا إلى جنب مع مكافحة تويولين ومعاداة pericentrin الأجسام المضادة تمكين: (ط) تأكيد استنزاف pericentrin وكذلك (ب) إجراء تقييم شامل لكلا تكوينات لونين والمغزل الانتصافي في السيطرة و PCNT - المنضب البويضات.
وتظهر الصور المناعي تمثيلية من البويضات microinjected مع سيطرة غير محددة أو Pcnt الرناوات siRNAs في الشكل 2 7. وعقب ثقافة 17 ساعة، وصلت معظم البويضات سيطرة الأيل الطورية-IIه وتحتوي على نظم مغزل الانتصافي مع الكروموسومات الانحياز ووضع العلامات pericentrin مشرق في القطبين المغزل (الشكل 2A). والجدير بالذكر، لم يتم الكشف عن pericentrin في البويضات حقن Pcnt سيرنا، مؤكدا كفاءة البروتين ضربة قاضية في هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، ظلت أغلبية البويضات المنضب PCNT في مرحلة الطورية-I ويحمل الهياكل المغزل غير منظمة مع الكروموسومات المنحرفة (الشكل 2B). عرضت القليلة البويضات المنضب PCNT أن تقدمت إلى الطورية-II أيضا مغزل تعطلت (الشكل 2C).
الشكل 2. تحليل المناعي للمنظمة المغزل الانتصافي في البويضات الماوس صور الممثل البويضات حقن إما (A) السيطرة الرناوات siRNAs غير محددة أو (B، C) Pcnt محددة -الرناوات siRNAs. وكانت البويضات المزدوج المسمى مع anti-pericentrin (الأحمر) جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل-α تويولين للكشف عن الأنابيب الدقيقة (الخضراء). وصفت DNA مع دابي ويظهر باللون الأزرق. يظهر أقحم التكبير 2X من منطقة القطب المغزل. الأسهم تدل الكروموسومات المنحرفة. * المغزل القطب. الرصاص: الجسم القطبي الأول. شريط حجم 10 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من ما وVIVEIROS، 2014 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. وصفة لإعداد MEM. قائمة من جميع الكواشف والمبالغ المحددة اللازمة لإعداد 250 مل من MEM. وسائل الإعلام تصفية تعقيمها باستخدام 0.45 ميكرون السليلوز خلات (CA) وحدة تصفية الغشاء وتخزينها في 4 ° C لمدة أقصاها 7 أيام.
| مادة كيميائية | امونت |
| محلول ملحي متوازن ايرل (10X) | 25 مل |
| بيكربونات الصوديوم | 0.550 غرام |
| حمض البيروفيك | 0.0063 ز |
| البنسلين G | 0.0188 ز |
| الستربتومايسين كبريتات | 0.0125 ز |
| L-الجلوتامين | 0،073 ز |
| EDTA، الصوديوم ملح ثنائي الهيدرات | 0.1 ملغ |
| الأحماض الأمينية الأساسية (50X) | 5.0 مل |
| MEM فيتامين خليط (100X) | 2.5 مل |
| الفينول الحل الأحمر | 0.2 مل |
| الأبقار مصل الزلال (BSA) | 0.75 ز |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن هناك أساليب متعددة لنقل خارجي حامض النووي في الخلايا الجسدية، مثل Electroporation للوترنسفكأيشن، microinjection هو الأسلوب الأمثل للتسليم من جزيئات الحمض النووي الريبي في البويضات الماوس هادئة transcriptionally. وينص البروتوكول الحالي نهج فعال لفي المختبر استنزاف من mRNAs محددة تمكن من اختبار وظيفي من المغزل مختلفة و / أو عوامل المرتبطة MTOC في البويضات. أسفر هذا النهج في استنزاف نسخة فعال وقابل للتكيف للغاية. على الرغم استخدمت الرناوات siRNAs خصيصا لاستهداف النصوص Pcnt، يمكن استخدامها ظروف مماثلة لاستهداف أي ما يقرب من الجينات في المصالح.
عدة جوانب من هذا البروتوكول، بما في ذلك جمع البويضة والثقافة والتلاعب تتطلب الممارسة والخبرة للحفاظ على جودة البويضة وتجنب التحف الفنية. ويجب تجنب التقلبات في درجة الحموضة و / أو درجة حرارة سائل الإعلام والثقافة عن طريق البريد العملxpediently وبعناية. Microinjection من مجموعات صغيرة من البويضات، وتوافر مرحلة ساخنة في النظام microinjection سوف تحد من التغيرات في درجات الحرارة ضارة. يوصى باستخدام الرناوات siRNAs التحقق من صحتها قبل واستنزاف البروتين المستهدف الفعال يتطلب تأكيد المناعي أو النشاف الغربي. وبعض الخطوات تتطلب تعديل لاستهداف جينات مختلفة من الفائدة. على سبيل المثال، وأوصى 24 ساعة "عقد فترة 'في تستكمل ميلرينون المتوسطة فعالة لمختلف الرناوات siRNAs. ومع ذلك، قد تتطلب هذه الفترة الزمنية تعديلات لمن mRNAs وفيرة للغاية و / أو البروتينات الهدف مع نصف حياة طويلة للغاية، أو يمكن اختصارها للأهداف أقل وفرة. ومع ذلك فمن المهم أن نرى أن جودة البويضة وإمكانات الانتصافي من الأفضل الحفاظ عليها باستخدام فترات الانتظار من 24 ساعة أو أقل. وهناك حاجة أيضا الحذر مع التعامل مع البويضة أثناء التثبيت والتحليل المناعي. تثبيت البويضة عند 37 درجة مئوية يحد أنيبيب depolymerسعودة، والذي يحدث مع انخفاض درجات الحرارة، وأفضل يحافظ على بنية المغزل الانتصافي. ومع ذلك، قد تحتاج هذه الشروط التي يتعين تعديلها تبعا للبروتين الهدف من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، تحتاج أيضا الظروف المثلى لالمناعي (أي تركيز الأجسام المضادة وكذلك فترة حضانة ودرجة الحرارة) التي ستنشأ لجميع الأجسام المضادة من الفائدة، واختبارها بدقة قبل إجراء microinjection سيرنا.
هذه التقنية قد لا تستنزف بشكل فعال البروتينات وفيرة للغاية في إطار زمني معقول أن يحافظ على جودة البويضة والكفاءة للخضوع الميتوزي، وقابلية البويضة لا يمكن إلا أن تستمر لفترة محدودة في مجال الثقافة. ويمكن ملاحظة الظواهر ناقص المفعول مع ضربة قاضية جزئية من النصوص المستهدفة. ومع ذلك، وشارك في حقن morpholinos محددة يمكن استخدامها بوصفها استراتيجية موازية لتثبيط إضافية من الترجمة. هناك أيضا بعض القيود لanaly المصب المحتملةجهاز الأمن والمخابرات التي هي عمليا مع البويضات microinjected. على سبيل المثال، يمكن للمعالجة المطلوبة والثقافة بمد تحد من قدرة البويضة على الخضوع لنجاح التخصيب في المختبر (IVF) ويحول دون دراسة آثار وظيفية على تطور الجنين قبل الزرع. وعلاوة على ذلك، وأحجام عينة كبيرة من الصعب تحقيق مع هذا النهج أن هناك حاجة لبعض التطبيقات المصب، مثل immunoblotting أو فحوصات البيوكيميائية.
وعلى الرغم من بعض القيود، وهذا النهج يعزز فعالية في استنزاف المختبر من من mRNAs محددة تمكن من اختبار وظيفي من العوامل المختلفة في البويضات، وقد استخدمت بنجاح من قبل مجموعات بحثية مختلفة. الخسارة من وظيفة التحليل في البويضات وعادة ما ينطوي توليد (مشروط) بالضربة القاضية أو المعدلة وراثيا نماذج الماوس رني. كلا النهجين هي العمل والوقت كثيفة. في المقابل، في المختبر سيرنا microinjection يمكن استخدامها بسهولة لاختبار وظيفي مع كبيرالوقت والموارد أقل. وهو نهج قيمة خاصة لاكتساب المعرفة من الآثار الفنية بروتين الهدف قبل الشروع في مهمة لتوليد بالضربة القاضية / نموذج الفأر المعدل وراثيا.
مزيج من سيرنا microinjection والتحليل المناعي يوفر أداة تحليلية قوية لدراسة التعبير البروتين وأنماط التوزيع التحت خلوية خلال مراحل مختلفة من تطور الانتصافي ردا على بوساطة سيرنا استنزاف البروتين المستهدف. الاختلافات المحتملة في سيرنا فعالية من بويضة إلى بويضة يمكن التعرف عليها بسهولة، وتسمح للعلاقة دقيقة بين الناجح استنزاف البروتين المستهدف وphenotypical / التحليل الوظيفي. ومواصلة تطوير بروتوكولات للشارك في حقن جزيئات سيرنا محددة مع الرنا المرسال توج ترميز هيستون H2B-GFP الانصهار البروتينات (أو علامات أخرى fluorescently المسمى) يمكن تقييم وظيفة البروتين المستهدف في الوقت الحقيقي من خلال سل الحيةل التصوير.
باختصار، مع الظروف الأمثل، وسيرنا Microinjection لنسخة إسكات يوفر نهج الآلية قيمة لاختبار وظيفة البروتينات المستهدفة المحددة في البويضات الماوس على خلية في الأساس الخلية، وخصوصا عندما جنبا إلى جنب مع غيرها من الأدوات التحليلية القوية مثل التحليل المناعي. وقد استخدم هذا النهج جنبا إلى جنب في استنزاف بنجاح البروتينات المرتبطة MTOC وتقييم تشكيل المغزل الانتصافي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | *Recipe outlined in Table 1 | ||
| Earle's Balanced Salt Solution (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | |
| Pyruvic Acid, sodium salt | Sigma | P-5280 | |
| Penicillin G, potassium salt | Sigma | P-7794 | |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamine | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, disodium salt dihydrate | Sigma | E-4884 | |
| Essential Amino Acids (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| MEM Vitamin Mixture (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Phenol Red solution | Sigma | P-0290 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Media with Hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs targeting Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| Negative control siRNAs | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-Pericentrin (rabbit) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-acetylated a-tubulin (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Goat anti -mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Major Equipment | |||
| Stereomicroscope (SMZ 800) | Nikon | ||
| Upright Fluorescent Microscope | Leica Microsystems | ||
| Inverted Microscope | Nikon | ||
| Femtojet Micro-injections System | Eppenforf | ||
| Micro manipulators | Eppendorf | ||
| Micro-injection needles (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Holding pipettes (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 well plates | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA Filter System | Corning Life Sciences | 430768 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes. J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).
- Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance. Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).
- Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes. Dev Biol. 339 (439-450), (2010).
- Ma, W., Viveiros, M. M. Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization. Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).
- Bouniol-Baly, C., et al. Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes. Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).
- De La Fuente, R., Eppig, J. J. Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling. Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).
- Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes. Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).
- De La Fuente, R. Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes. Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).
- Svoboda, P.
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
