Summary
Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.
Introduction
Antrais oócitos GV (totalmente crescidas, vesícula germinal) isolados a partir do compartimento do antro do ovário são rotineiramente usadas para diferentes fins, tais como, por exemplo, no estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes a maturação in vitro até estádio de metáfase II.
Apesar de suas aparência bonita oócitos mais antrais, mas não todos, são capazes de completar a meiose e atingir o estágio de blastocisto; De facto, em muitas espécies de mamíferos, incluindo seres humanos 1,2, cerca de 30% deles deter o seu desenvolvimento na fase de 2 células, se ocorre a fertilização 3-5. Até à data, alguns parâmetros são usados para distinguir entre oócitos capazes de sustentar o desenvolvimento embrionário de pessoas incapazes de fazê-lo.
Por exemplo, coloração com azul de Cresyl (BCB) é um método válido para classificar os oócitos com base na actividade da glucose-6-fosfato-desidrogenase, embora a utilidade deste método de classificação relacionada com BC + ou coloração é BCB-Ainda laboratório dependentes 6-8.
Outro método bem estabelecido reside na sua organização da cromatina: se coradas com quaisquer corantes intercalantes de ADN (como Hoechst33342), 70% dos oócitos antrais mostrar um anel de corante-positiva em torno do núcleo e são chamados rodeado nucléolo (SN), enquanto que os restantes 30% mostrar um mais manchado sinais positivos e são chamados Não Rodeado nucléolo (NSN) 3-5. Recentemente, mostrou que a ausência de reticulados citoplasmáticos 9 (CPLs, locais de armazenagem importantes para ARNm de origem materna e ribossomas em ambos os oócitos de mamíferos e embriões) 10 e a sub-regulação de MATER (essencial para a formação CPLs 11), juntamente com a presença de gotículas lipídicas em seus citoplasmas 9,12, pode haver outras causas relacionadas com a incapacidade NSN oócitos de proceder para além do estádio de 2 células.
Infelizmente, algumas técnicas podem ser aplicadas para classificar SN antral e oócitos e NSN,Por esta razão, o desenvolvimento de um método menos invasivo (sem coloração nuclear, os processos de fixação ou manipulação com pipetas de boca) pode tornar-se muito importante para aumentar as taxas de desenvolvimento embrionário, tanto humana e animal.
Neste artigo, detalhamos o protocolo simples e rápida usada para isolar anúncio SN tipo e NSN oócitos antrais de camundongos fêmeas e é dirigida a todos os cientistas interessados no estudo da gametogênese do sexo feminino, a maturação eo desenvolvimento do embrião.
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Protocol
Este protocolo é realizado em conformidade com os princípios orientadores da Europeia (UE) e 63/2010 (26/2014) leis italianas que protegem animais usados para pesquisa científica. Cervical eutanásia deslocamento é utilizado para isolamento e ovários é realizada por peritos e indivíduos listados no protocolo aprovado cobrindo este estudo treinado.
1. Os animais
- Manter adulto de 3 a 6 semanas de idade ratos fêmeas em uma sala com temperatura e umidade controladas (com fases de 12L: 12E e alimentados ad libitum).
- Injetar camundongos por via intraperitoneal com 2,5 UI de gonadotrofina de égua prenhe (PMSG) para estimular o crescimento folicular, imitando os efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH). Isolar os ovários para oócitos antrais 48hrs coleção posteriores. Euthanize o mouse fêmea anteriormente injectados com PMSG, de acordo com suas diretrizes institucionais.
- Remover rapidamente os ovários da cavidade do corpo e colocá-los para o cont placa de Petriaining meio M2, para posterior isolamento oócitos (ver secção 3).
- Realizar uma incisão na pele que cobre a parede abdominal, seguida por uma incisão no peritoneu utilizando tesouras de dissecação estéreis. Abra a incisão para expor o abdómen, mover os intestinos de um lado usando pinças estéreis e localizar os tubos uterinos, formando uma forma em V a partir da bexiga.
- Observar os ovários localizados abaixo dos rins. Mantenha cada tubo com pinça estéril e fazer uma pequena incisão na parte inferior dos ovários a libertá-los. Transferir ambos os ovários, na parte inferior de uma placa de Petri contendo meio de pré-equilibrada.
2. Preparação Hormone
- Diluir PMSG (disponível em diferentes concentrações de estoque) com solução salina isotónica estéril para se obter uma concentração de trabalho de 2,5 UI por hormona de 0,1 ml para um volume de injecção apropriado.
NOTA: As soluções da hormona deve ser dividido em alíquotas em tubos de 0,5 ml e armazenados a -20 ° C até ao dia da utilização. Não manter partes aliquotas diluídas com mais de três meses a -20 ° C. Uma vez descongelado, se injecções são realizadas em série, armazenar as alíquotas de soluções de hormonas a +4 ° C e utilizá-los dentro de 4 dias.
3. Antral Oócitos Isolamento
Para o isolamento de oócitos adequada:
- Equilibrar meio M2 13 (M2) com 5% de CO 2 e 37 ° C durante pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento de isolamento de oócitos. Preparar duas placas de Petri (35 mm x 10 mm), um deles com 1 ml de M2 para perfurar ovário e o segundo com pequenas gotas (20 ul) de M2 coberta com óleo mineral (~ 1,5 ml) para transferência de oócitos após isolamento a partir da ovário (ver 3.4-3.6). Manter ambos os pratos de Petri em incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C até estar pronto para ser utilizado.
- Use um microscópio estereoscópico durante procedimentos de isolamento oócitos.
- Prepare finas pipetas de vidro boca para recolher os ovócitos com fitahing pipetas de Pasteur de vidro mantido na horizontal (segurando as extremidades da pipeta com as duas mãos), ao longo de um vertical da chama proveniente do bico de Bunsen (Figura 1).
- Uma vez que o vidro começa a derreter, pegue a pipeta para fora da chama e realizar um movimento de puxar rápido para obter a pipeta desejado. Firmemente cortar o vidro em excesso perto do ponto estreito da pipeta com unhas para ajustar o comprimento e o diâmetro interno do capilar. Assegure-se que a fina capilar tem um diâmetro interno de ~ 100 pm, ligeiramente maior do que o diâmetro do oócito (~ 80? M).
- Para boca pipeta, ligar-se uma extremidade do tubo de aspiração para a pipeta puxado utilizando uma ponta apropriada e colocar a outra extremidade na boca, prendendo-o com os dentes.
- Recolher os ovários usando pinças estéreis e depositá-los na parte inferior de um prato de cultura de células de petri (35 mm x 10 mm). Cobri-los com 1 ml de M2, previamente equilibrada a 37 ° Ce 5% de CO 2 (Figura 2).
- Suavemente perfurar os folículos antrais dos ovários com uma agulha de seringa estéril para libertar insulina oócitos antrais em M2 (Figura 3).
- Suavemente boca pipetar os oócitos através de uma pipeta de Pasteur estreita para remover as células foliculares e qualquer outro restos de tecido possível (Figura 4A) e em seguida resolver-los na parte inferior de pequenas gotas (20 ul) de m2 de área coberta com óleo mineral adequado para a cultura de embriões (anteriormente preparados; A Figura 4B).
NOTA: É importante remover todas as células de cumulus ligados à zona pelúcida dos oócitos por pipetagem contínua através de vários e diferentes gotas de M2. Execute esta etapa o mais rápido possível para evitar alterações no pH do meio.
4. Antral Oócitos Coloração com Hoechst33342
NOTA: ovócitos antrais podem ser distinguidos na SN (Cercado nucléolo), NSN (Não Rodeado nucléolo) ouem qualquer outra forma intermédia, com base na sua organização da cromatina após coloração com concentração de Hoechst33342 supravital (ou quaisquer outros marcadores específicos de bases AT 14). Na verdade, os oócitos SN mostrar um anel Hoechst-positiva em torno do nucléolo enquanto a NSN não, daí o seu nome.
Para a coloração oócitos adequada:
- Transferir os oócitos utilizando uma pipeta de boca em gotas de Hoechst33342 (20 ul), diluído em M2 na concentração supravital de 50 ng / mL durante 10 min no escuro.
- Após a incubação com Hoechst33342, transferir cada um único oócito com uma pipeta de boca na parte inferior de pequenas gotas (5 ul) de m2 de área coberta com óleo mineral, para classificação com base na organização da cromatina (SN ou NSN). Use qualquer microscópio de fluorescência equipado com filtro Hoechst33342 (comprimento de onda de emissão 486 nm) para visualizar a configuração da cromatina dos oócitos.
NOTA: Dependendo do tipo de microscópio de fluorescência usado, it pode tornar-se imperativa a utilização de vidro de fundo placa de Petri para aquisição de imagem. A microscopia confocal Olympus Fluoview FV10i quando equipado com um pegador de amostra para 35 milímetros prato requer apenas com fundo de vidro-pratos para aquisição de imagem, com uma espessura padrão de 0,17 milímetros e um intervalo de 0,13 a 0,21 milímetros aceitáveis. - Excitar os oócitos durante não mais do que 5-10 seg, provavelmente tempo suficiente para visualizar a presença ou a ausência de um anel em torno do nucléolo (Figura 5).
- Após a separação, a cultura SN antral e oócitos NSN em M2 em 5% de CO 2 e 37 ° C, para induzir a maturação in vitro ou mantê-los em tampões apropriados para análises moleculares ou celulares.
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Representative Results
As imagens seguintes mostram o método usado para isolar oócitos antrais a partir de ovários de rato, a partir de pipetas preparação para triagem dos ovócitos por meio de Hoechst33342. Este método é muito simples e pode ser realizado em qualquer laboratório equipado com uma incubadora de CO 2, um estereomicroscópio e um microscópio de fluorescência equipado com o filtro correcta para a observação do Hoechst33342 Figura 1 mostra a primeira etapa de preparação pipeta:. Como o vidro começa a derreter e tornar-se macio, ambas as extremidades da pipeta devem ser separados e, ao mesmo tempo, a pipeta tem de ser retirado da chama. Alternativamente, capilar de vidro pode ser puxado da mesma forma ou de um puxador de micropipeta utilizando, se adequadamente calibrado. Este é um passo crucial porque é muito importante ter a pipeta boca certo com o diâmetro capilar direita: se for muito fina, os oócitos podem ser fragmentado dentro da pequena tampaIllary e morrem em poucos minutos, se for demasiado grande, uma sucção adequada do meio que contém os oócitos podem ser perdido quando se deslocam os oócitos, por exemplo, a partir de uma gota para o outro. As figuras 2 e 3 mostram o isolamento mecânico de oócitos antrais a partir de folículos antrais, utilizando uma agulha estéril de insulina. É bastante fácil de reconhecer estes folículos porque eles são caracterizados por uma cavidade ou antro contendo um fluido, que é o meio no qual as células da granulosa e oócito são encontrados e através do qual moléculas diferentes podem ser trocadas para e a partir do ambiente externo. , Oócitos antrais Uma vez isolado deve ser transferida a partir de uma gota para o outro de meio M2 para remover as células somáticas que rodeiam os oócitos, tal como mostrado nas Figuras 4A e B. Uma vez que "desnudada", oócitos antrais estão prontas para classificação. A Figura 5 mostra o último passo deste protocolo, que é a coloração dos oócitos antrais isolados com Hoechst33342 fou uma triagem rápida com base na sua organização da cromatina. Este marcador manchas células vivas muito mais rapidamente do que DAPI, por exemplo, e deve ser utilizado numa concentração supravital (50 ng / mL) para preservar a viabilidade celular. A coloração celular para organização da cromatina é provavelmente a etapa mais crítica deste protocolo: se os oócitos são animado muito tempo eles podem ser danificados e se tornar inutilizável para ensaios futuros. No geral, se aplicado a oócitos de camundongos, este é um método simples que não exigem precauções específicas (exceto aqueles indicados na secção método). Todos os passos podem ser realizados à temperatura ambiente.
Figura 1. Preparação de uma pipeta de boca utilizando pipetas de Pasteur de vidro e um bico de Bunsen. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.
Figura 2. ovários intactos em placa de petri preenchida com meio M2 pré-aquecido e equilibrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. isolamento inicial de ovócitos antrais de folículos antrais por meio de uma agulha estéril. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A transferência dos oócitos recentemente isoladascom uma pipeta boca da placa de petri (A) para uma placa de Petri contendo diferentes pequenas gotas de pré-aquecido e equilibrada M2medium (B) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Os oócitos manchado e classificadas com Hoechst33342. Imagens individuais da NSN e SN oócitos tiradas no microscópio confocal Olympus Fluoview FV10i (ampliação de 60X; bar: 10 m; PhC: contraste de fase). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve o método usado para isolar e classificar rato antrais oócitos GV. Não há passos críticos particular, sublinhar, com poucas exceções. Primeiro: este procedimento deve ser realizado o mais rapidamente possível: a) manter a vitalidade dos oócitos e b) evitar mudanças de pH no meio utilizado. Segunda: oócitos deve ser animado brevemente (5-10 s) a Hoechst33342 para evitar danos da cromatina e a posterior morte dos oócitos, especialmente se IVM e FIV são os seguintes passos. Até à data, esta é a maneira mais rápida de resolver oócitos antrais SN e NSN do mouse.
Hochest33342 foi provado ser uma maneira eficiente para caracterizar SN e NSN oócitos em ratos fêmeas (e outros modelos de laboratório de mamíferos), mas ele não pode ser, infelizmente, usado para classificar oócitos antrais em seres humanos para fins de fertilidade.
No entanto, uma vez que a maturação in vitro de oócitos imaturos é rotineiramente utilizada em seres humanos também, would ser extremamente importante encontrar uma forma não-invasiva para distinguir as "boas" oócitos (ou seja, Sn) a partir dos "maus" (ou seja, NSN) para aumentar o sucesso da fertilização in vitro e subsequente desenvolvimento de embriões em perspectiva. Além disso, o isolamento e cultura de oócitos a partir de tecido do ovário SN poderiam ser utilizadas para a preservação da fertilidade em mulheres submetidas a tratamentos contra o cancro ou que sofrem de patologias do ovário.
Ao explorar este fenômeno natural, dados importantes poderiam ser fornecidos para a compreensão do que ocorre naturalmente perdas pré-implantação de embriões que fala não só para aqueles interessados na biologia básica do desenvolvimento do oócito, mas também para os médicos de fertilização in vitro humanos e animais.
As implicações desta técnica para a saúde humana, a biopolítica de embriões e reprodução animal são significativos 15. Ser capaz de identificar e eliminar os oócitos "incompatíveis da vida" seriaelevar muito o nível efetivo de técnicas de fertilização in vitro, levando a soluções de ponta para necessidades clínicas não satisfeitas importantes.
Na verdade, a comunidade científica internacional de biólogos de gametas pode contribuir para buscar as melhorias críticas necessárias para aplicar este protocolo para procedimentos de fertilização in vitro humanos. Mesmo que o protocolo não pode ser aplicada a seres humanos (por razões de segurança claras), que ainda mantém uma enorme capacidade para melhorar o conhecimento da relação entre a organização da cromatina (isto é, a arquitectura genoma) e a expressão do gene durante as fases finais de maturação antral , um dos temas quentes em reprodução humana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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