Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.
Introduction
Antrale ovociti completamente sviluppati (GV, vescicola germinale) isolati dal vano antrale dell'ovario sono abitualmente utilizzati per scopi diversi, come, per esempio, lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base maturazione in vitro fino metafase II.
Nonostante le loro bella apparenza oociti antrali più, ma non tutti, sono in grado di completare la meiosi e raggiungere lo stadio di blastocisti; infatti, in molte specie di mammiferi, compreso l'uomo 1,2, circa il 30% del loro arresto loro sviluppo nella fase 2 cellule, se avviene la fecondazione 3-5. Ad oggi, alcuni parametri sono utilizzati per distinguere tra gli ovociti in grado di sostenere lo sviluppo embrionale da quelli in grado di farlo.
Ad esempio, cresolo colorazione blu (BCB) è un valido metodo per ordinare gli ovociti basati sull'attività di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, sebbene l'utilità di questo metodo di ordinamento correlate a BCB + o colorazione è BCB-ancora dipendente 6-8 laboratorio.
Un altro metodo consolidato risiede nella loro organizzazione della cromatina: se macchiata di eventuali coloranti intercalanti del DNA (come Hoechst33342), il 70% degli ovociti antrali mostrano un anello colorante positivo attorno al nucleolo e sono chiamati Circondato Nucleolo (SN), mentre il restante 30% mostrare un segnali positivi più maculati e sono chiamate Non Circondato Nucleolo (NSN) 3-5. Recentemente abbiamo dimostrato che l'assenza di reticoli citoplasmatici 9 (CPL, siti di stoccaggio importanti per mRNA di origine materna e ribosomi sia in ovociti di mammiferi ed embrioni) 10 e la down-regolazione di MATER (essenziale per CPL formazione 11), unitamente alla presenza di gocce lipidiche nei loro cytoplasms 9,12, possono essere altre cause legate alla ovociti incapacità NSN a procedere oltre la fase 2 cellule.
Purtroppo, poche tecniche possono essere applicate per ordinare SN antrale e oociti NSN e,per questa ragione, lo sviluppo di un metodo meno invasivo (senza colorazione nucleare, le procedure di fissaggio o di manipolazione con pipette bocca) potrebbe diventare molto importante aumentare i tassi di entrambi sviluppo embrionale umano e animale.
In questo lavoro, abbiamo dettaglio il protocollo semplice e veloce utilizzato per isolare annuncio sorta SN e NSN oociti antrali di topi di sesso femminile e si rivolge a tutti gli scienziati interessati allo studio della gametogenesi femminile, la maturazione degli ovociti e sviluppo embrionale.
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Protocol
Questo protocollo è condotto in conformità con i principi ispiratori del Europea (UE 63/2010) e Italiano (26/2014) leggi che proteggono gli animali utilizzati per la ricerca scientifica. Cervicale dislocazione l'eutanasia viene utilizzato per l'isolamento ovaie ed è eseguita da esperti e soggetti elencati nel protocollo approvato che copre questo studio addestrato.
1. Gli animali
- Mantenere adulti da 3 a 6 settimane di età topi femmina in una stanza a temperatura e umidità controllate (con fasi di 12L: 12D e alimentati ad libitum).
- Iniettare topi per via intraperitoneale con 2.5 UI di gonadotropina del siero di cavalla incinta (PMSG) per stimolare la crescita follicolare imitando gli effetti dell'ormone follicolo-stimolante (FSH). Isolare le ovaie di ovociti antrali di raccolta 48 ore successive. Euthanize il mouse femminile precedentemente iniettato con PMSG, in base alle proprie linee guida istituzionali.
- Rimuovere rapidamente le ovaie dalla cavità del corpo e metterli nel piatto cont Petriaining M2 mezzo per successivo isolamento ovociti (vedi sezione 3).
- Effettuare un'incisione sulla pelle che copre la parete addominale seguita da un'incisione nel peritoneo utilizzando forbici dissezione sterili. Aprire l'incisione per esporre l'addome, spostare le viscere da una parte con una pinzetta sterile e localizzare i tubi uterine, formando una forma a V a partire dalla vescica.
- Osservare le ovaie si trovano al di sotto dei reni. Tenere ogni tubo con pinzetta sterile e fare una piccola incisione nella parte inferiore delle ovaie a rilasciarli. Trasferire entrambe le ovaie nella parte inferiore di una piastra di Petri contenenti terreno pre-equilibrata.
2. Ormone Preparazione
- Diluire PMSG (disponibile in diverse concentrazioni archivi) con soluzione salina isotonica sterile per ottenere una concentrazione di lavoro di 2,5 UI di ormone per 0,1 ml di un volume di iniezione appropriata.
NOTA: Le soluzioni di ormoni devono essere aliquotati in provette da 0,5 ml e conservati a -20 ° C fino al giorno di utilizzo. Non tenere aliquote diluito superiori a tre mesi a -20 ° C. Una volta scongelato, se si eseguono iniezioni seriali, memorizzare le aliquote delle soluzioni ormonali a +4 ° C e utilizzare entro 4 giorni.
Isolamento 3. Antral Ovociti
Per un corretto isolamento ovociti:
- Equilibrare M2 medio 13 (M2) al 5% di CO 2 e 37 ° C per almeno 1 ora prima di avviare la procedura di isolamento oociti. Preparare due piastre di Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 ml di m2 per punzonamento ovaie e la seconda con piccole gocce (20 ml) di M2 coperto con olio minerale (~ 1,5 ml) per il trasferimento ovociti dopo isolamento dal ovaia (vedi 3,4-3,6). Tenere entrambe le capsule di Petri in incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C fino al momento di essere utilizzati.
- Utilizzare uno stereomicroscopio durante le procedure di isolamento ovociti.
- Preparare sottili pipette di vetro bocca per raccogliere gli ovociti stetchhing pipette Pasteur in vetro tenute orizzontalmente (tenendo le estremità della pipetta con entrambe le mani), a fiamma verticale proveniente dal bruciatore Bunsen (Figura 1).
- Una volta che il vetro inizia a fondere, prendere la pipetta della fiamma ed eseguire un movimento di trazione rapido avere la pipetta desiderata. Saldamente tagliare il vetro in eccesso vicino al punto stretto della pipetta con unghie per regolare la lunghezza e il diametro interno del capillare. Assicurarsi che il sottile capillare ha un diametro interno di ~ 100 micron, leggermente maggiore del diametro del ovocita (~ 80 micron).
- Per bocca pipetta, collegare un'estremità del tubo di aspirazione alla pipetta tirato utilizzando una punta appropriata e posizionare l'altra estremità in bocca, fissandolo con i denti.
- Raccogliere ovaie usando pinzette sterili e depositarli sul fondo di un piatto di coltura cellulare di Petri (35 mm x 10 mm). Coprire con 1 ml di M2 precedentemente equilibrata a 37 ° Ce 5% CO 2 (Figura 2).
- Forare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie con un ago sterile siringa da insulina per liberare oociti antrali a M2 (Figura 3).
- Delicatamente bocca pipettare gli ovociti attraverso uno stretto pipetta Pasteur per rimuovere le cellule follicolari e qualsiasi altri detriti tessuto possibile (Figura 4A) e poi depositarsi sul fondo di piccole gocce (20 mL) di M2 coperti con olio minerale adatto a cultura dell'embrione (precedentemente preparati; Figura 4B).
NOTA: E 'importante rimuovere tutte le cellule del cumulo collegati alla zona pellucida degli ovociti pipettando continuo attraverso diversi e diverse gocce di M2. Eseguire questo passaggio il più velocemente possibile per evitare alterazioni del pH del mezzo.
4. Antral ovociti colorazione con Hoechst33342
NOTA: ovociti Antral può essere distinta in SN (Circondato Nucleolo), NSN (Non Circondato Nucleolo) oin qualsiasi altra forma intermedia, in base alla loro organizzazione della cromatina dopo colorazione con concentrazione sopravitale di Hoechst33342 (o qualsiasi altro marker specifici per le basi AT) 14. In effetti, gli ovociti SN mostrano un anello Hoechst-positivo attorno al nucleolo mentre la NSN non lo fanno, da qui il suo nome.
Per una corretta colorazione ovociti:
- Trasferire gli ovociti usando una pipetta bocca in gocce di Hoechst33342 (20 ml) diluito in M2 alla concentrazione sopravitale di 50 ng / ml per 10 min in scuro.
- Dopo l'incubazione con Hoechst33342, trasferire ogni singolo ovocita con una pipetta a bocca in fondo piccole gocce (5 mL) di M2 coperti con olio minerale, per l'ordinamento basato su organizzazione della cromatina (SN o NSN). Utilizzare qualsiasi microscopio a fluorescenza dotato di filtro Hoechst33342 (lunghezza d'onda di emissione 486 nm) per visualizzare la configurazione della cromatina degli ovociti.
NOTA: A seconda del tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, it può diventare indispensabile utilizzare vetro Petri fondo per l'acquisizione delle immagini. La microscopia confocale Olympus Fluoview Fv10i quando dotata di supporto del campione per 35 millimetri piatto richiede solo vetro bottom-piatti per l'acquisizione di immagini, con spessore standard 0,17 millimetri e un range da 0,13 a 0,21 millimetri accettabili. - Eccitare gli ovociti per non più di 5-10 sec, probabilmente abbastanza tempo per visualizzare la presenza o l'assenza di un anello attorno al nucleolo (Figura 5).
- Dopo la cernita, la cultura SN antrale e ovociti NSN in M2 al 5% di CO 2 e 37 ° C per indurre la maturazione in vitro o tenerli in buffer appropriate per analisi molecolari e cellulari.
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Representative Results
Le seguenti immagini mostrano il metodo utilizzato per isolare oociti antrali da ovaie di topo, a partire dalle pipette preparazione alla selezione degli ovociti 'per mezzo di Hoechst33342. Questo metodo è molto semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio dotato di CO 2 incubatore, uno stereomicroscopio e un microscopio a fluorescenza equipaggiato con il filtro corretto per l'osservazione del Hoechst33342 Figura 1 mostra la fase iniziale di preparazione pipetta:. Come il vetro inizia a fondere e diventare morbido, entrambe le estremità della pipetta devono essere separati e, allo stesso tempo, la pipetta deve essere preso dalla fiamma. In alternativa, capillare di vetro può essere tirato nello stesso modo o con un estrattore micropipetta, se opportunamente calibrata. Questo è un passo fondamentale, perché è molto importante avere la giusta pipetta bocca con il diametro capillare destra: se è troppo sottile, gli ovociti possono essere frammentati all'interno del piccolo tappoIllary e muoiono in pochi minuti, se è troppo grande, una corretta aspirazione del supporto contenente gli ovociti può essere persa quando si spostano gli ovociti, per esempio, da una goccia all'altro. figure 2 e 3 mostrano l'isolamento meccanico di oociti antrali da follicoli antrali con un ago da insulina sterile. E 'abbastanza facile riconoscere questi follicoli perché sono caratterizzati da una cavità o antro contenente un fluido, che è il mezzo in cui le cellule della granulosa e ovocita si trovano e attraverso cui diverse molecole possono essere scambiati da e verso l'ambiente esterno. Una volta isolato, oociti antrali devono essere trasferiti da una goccia all'altro di M2 mezzo per rimuovere le cellule somatiche che circondano gli ovociti, come mostrato nelle figure 4A e B. Una volta "spogliate", oociti antrali sono pronti per la classificazione. La figura 5 mostra l'ultimo passo di questo protocollo, che è la colorazione dei isolate oociti antrali con Hoechst33342 fo una rapida selezione basata sulla loro organizzazione della cromatina. Questo marcatore macchie cellule viventi molto più rapidamente DAPI, per esempio, e deve essere utilizzato a concentrazioni sopravitale (50 ng / ml) per preservare la vitalità cellulare. Colorazione delle cellule per l'organizzazione della cromatina è probabilmente la fase più critica di questo protocollo: se gli ovociti sono eccitati troppo tempo possono essere danneggiati e diventano inutilizzabili per la saggistica futuri. In generale, se applicato a ovociti di topo, questo è un metodo semplice che non richiedono particolari precauzioni (ad eccezione di quelli indicati nella sezione Metodo). Tutte le operazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente.
Figura 1. Preparazione di una pipetta bocca con pipette Pasteur di vetro e di un becco Bunsen. Cliccate qui per vedere una versione più grande di This figura.
Figura 2. ovaie intatte nella capsula di Petri pieno di pre-riscaldato ed equilibrato medio M2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. isolamento iniziale di oociti antrali di follicoli antrali per mezzo di un ago sterile. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Trasferimento degli ovociti appena isolatecon una pipetta bocca dal capsula di Petri (A) per una capsula di Petri diverso contenente piccole gocce di pre-riscaldato ed equilibrato M2medium (B) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. ovociti macchiati e ordinate con Hoechst33342. Immagini singole di NSN e SN ovociti prelevati al microscopio confocale Olympus Fluoview Fv10i (ingrandimento 60X; bar: 10 micron; PhC: contrasto di fase). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive il metodo utilizzato per isolare e classificare il mouse antrali GV ovociti. Non vi sono particolari passaggi critici per sottolineare, con poche eccezioni. Primo: questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile: a) mantenere la vitalità degli ovociti e b) evitare variazioni di pH del mezzo utilizzato. Secondo: gli ovociti devono essere brevemente eccitato (5-10 sec) per Hoechst33342 per evitare danni cromatina e la successiva morte degli ovociti, soprattutto se IVM e IVF sono le seguenti passaggi. Fino ad oggi, questo è il modo più rapido per ordinare SN e NSN topo oociti antrali.
Hochest33342 ha dimostrato di essere un modo efficace per caratterizzare SN e NSN ovociti in topi di sesso femminile (e altri modelli di laboratorio di mammiferi), ma non può essere, purtroppo, usato per ordinare oociti antrali negli esseri umani a fini di fertilità.
Tuttavia, poiché la maturazione in vitro degli ovociti immaturi viene solitamente usata anche sull'uomo, esso woULD essere estremamente importante trovare un modo non invasivo per distinguere gli ovociti "buoni" (cioè, SN) da quelli "cattivi" (cioè, NSN) per aumentare il successo della fecondazione in vitro e successivo sviluppo potenziali embrioni. Inoltre, l'isolamento e la coltura di ovociti SN dal tessuto ovarico potrebbero essere utilizzati per la conservazione della fertilità nelle donne sottoposte a trattamenti contro il cancro o che soffrono di patologie ovariche.
Sfruttando questo fenomeno naturale, i dati importanti potrebbero essere previste per la comprensione del naturale dell'embrione preimpianto perdite che parla non solo a coloro che sono interessati nella biologia di base dello sviluppo degli ovociti, ma anche per i medici di fecondazione in vitro umana e animale.
Le implicazioni di questa tecnica per la salute umana, biopolitica di embrioni e riproduzione animale sono significativi 15. Essere in grado di identificare ed eliminare ovociti "incompatibile-vita" sarebbenotevolmente aumentare il livello effettivo delle tecniche di fecondazione in vitro, che porta a soluzioni all'avanguardia per importanti esigenze cliniche ancora insoddisfatte.
In realtà, la comunità scientifica internazionale di biologi di gameti potrebbe contribuire a cercare i miglioramenti critici necessari per applicare questo protocollo per le procedure di fecondazione in vitro umani. Anche se il protocollo non può essere applicata agli esseri umani (per ragioni di sicurezza chiare), mantiene ancora una grande capacità di migliorare la conoscenza del legame tra l'organizzazione della cromatina (cioè, l'architettura genoma) e l'espressione genica durante le fasi finali della maturazione antrale , uno dei temi caldi di riproduzione umana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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