Introduction
Affections de la peau allant de la dermatite de contact, l'eczéma, le psoriasis, la cellulite, les infections fongiques et les abcès à des cancers de la peau non-mélanome ont été trouvés à être parmi les 50 maladies les plus répandues dans le monde, et la quatrième cause mondiale des maladies non mortelles en 2010 1. En conséquence, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents pathologies cutanées diverses est une zone nécessaire et actif de la recherche. Des modèles de rongeurs ont été remarquablement utiles pour la compréhension des maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique 2, 3 psoriasis, l'infection ou 4 Staphylococcus aureus. Protocoles peu coûteux, efficaces et simples pour la digestion enzymatique de tissu de la peau de la souris peuvent fournir des préparations de cellules qui peuvent être utilisés pour une variété d'applications en aval afin de mieux comprendre la physiopathologie de maladies de la peau. Ici, une méthode simple et économique est décrit par digestion enzymatique de la peau de souriset l'isolement des tissus cutanés leucocytes infiltrants qui peut être utilisé pour la culture cellulaire, le transfert adoptif in vivo, une analyse par cytométrie de flux et triage ou des études d'expression génique. L'objectif global de cette procédure est de préparer une suspension cellulaire unique de leucocytes infiltrant la peau avec la viabilité cellulaire élevée tout en minimisant les coûts généralement associés à des kits de réactifs personnalisé et dissociateurs mécaniques.
Existants tissu cutané méthodes de dissociation 5-7 peuvent donner lieu à l'intégrité du marqueur bas de la viabilité des cellules et de la surface, ou exiger des kits d'enzymes de mesure et des machines coûteuses de dissociation des tissus 8-11. Alors que la digestion des tissus de la peau de l'oreille de la souris est raisonnablement répandue 12-13, digérant tissu très kératinisée de la peau (par exemple, sur le flanc) peut entraîner des préparations de cellules contaminées avec de grandes quantités de débris non-cellulaire. Dans une étude récente, Zaid et collègues digérés peau du flanc de la souris pendant 90 min dans 2,5 mg / ml dispase, Follomené par 45 min dans 3 mg / ml de collagénase 7. Dans une autre étude, ces chercheurs ont utilisé plusieurs incubations avec une digestion totale de 2,5 h, y compris l'utilisation de trypsine / EDTA, la collagénase III, la dispase et 5. L'utilisation de la trypsine est déconseillé pour la digestion enzymatique de la peau, comme a été montré traitement à la trypsine provenant de différents fabricants pour affecter de manière mesurable l'intégrité des protéines de surface cellulaire sur des cellules de mammifère 14-15. En outre, la dispase peut avoir des effets importants sur la capacité de prolifération des cellules CD4 et CD8a T et affecter l'abondance de surface d'au moins 20 molécules, y compris les marqueurs d'activation des cellules T commun tels que CD62L 16. D'autres protocoles utilisent RPMI 1640 dans le milieu de digestion 6. Cependant, la présence de Mg2 + et Ca2 + dans du RPMI peut provoquer une agrégation de cellules 17 étendue.
Un protocole idéal pour la dissociation des tissus devrait viser pour la viabilité cellulaire élevée, faibleniveaux d'agrégation cellulaire, et un minimum de dommages à la cellule des protéines de surface. Préparations de cellules ganglionnaires du stroma de haute qualité ont été réalisés avec des protocoles qui utilisent plus courtes incubations enzymatiques, Ca 2+ et Mg 2+ médias libres, et d'éviter la trypsine et dispase 18. Cependant, les protocoles de ce type ont pas été établies pour la dissociation de la peau entière de la souris.
Ici, un protocole est décrit à dissocier, isoler, et d'enrichir les leucocytes infiltrant la peau de la peau du flanc de la souris allergène en cause. Brièvement, peau excisée est pré-incubées dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du sérum fœtal bovin de 10% pendant 1 heure pour adoucir le tissu pour la digestion et éliminer tout excès de tissus morts peau ou gras. Ceci est suivi par une étape de digestion enzymatique de 30 min avec 0,7 mg / ml de collagénase D. collagénase D a des effets minimaux sur la densité de marqueurs de surface cellulaire, et aucun effet sur la prolifération des cellules T in vitro 16,18, ce qui rendtrès convenable pour des applications impliquant la caractérisation des protéines de surface. Après digestion enzymatique, discontinue centrifugation en gradient de densité a été utilisé pour éliminer les cellules epitheliales et les débris de la suspension à cellule unique et un enrichissement en cellules hématopoïétiques. Surtout, cette procédure évite des coûteuses cellulaires magnétique réactifs de séparation à base de colonnes et machines de dissociation des tissus 8-11, et peut être réalisé avec l'équipement et de matériaux trouvés dans un laboratoire de recherche biomédicale fondamentale. Ici, ce protocole a été utilisé pour isoler les leucocytes à partir de la peau du flanc contestées trois fois avec de l'oxazolone haptène (Ox) chez des souris suisses précédemment sensibilisées ND4 (adapté à partir de 19). Les cellules ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux multi-paramétrique. Cette technique a donné une suspension de cellules avec un minimum de débris et> 95% de viabilité des lymphocytes isolés qui ont été analysés par écoulement multi-paramétrique cytométrie de mesurer l'infiltration de lymphocytes T et des neutrophiles dans le sk affectéedans.
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Protocol
Remarque: souris 8-12 semaine vieille femme ND4 Swiss Webster, classiquement hébergés avec un accès libre à la nourriture et de l'eau, ont été utilisées pour ces études Le protocole expérimental utilisé (B13S1) a été approuvé par IACUC de Macalester College..
1. Sensibilisation et Challenge Oxazolone
- Jour 0
- Préparer chambre anesthésie par addition de 3 ml d'isoflurane serviettes absorbantes placées sous maille au fond d'un couvercle 4 bocal en verre G. Pour la souris femelles ND4 utilisé ici, le temps dans la chambre est de 30 à 60 secondes jusqu'à ce que le sujet est correctement anesthésiés; optimiser l'administration d'anesthésiques pour la souche de souris utilisée.
- Rasez le dos de chaque souris anesthésiée et le flanc en utilisant une tondeuse pour poils d'animaux.
- Jour 1
- Ajouter une solution à 2% de 4-éthoxyméthylène-2-phényl-2-oxazoline-5-one (Ox) dans de l'éthanol absolu, et incuber à 50 ° C pendant 15 min sur une plaque en rotation dans un incubateur.
- Anesthésier brefsouris en utilisant l'isoflurane comme décrit dans 1.1.1 et applique 100 pi de 2% Ox au dos rasé dans plusieurs applications en série d'environ 20 pi de chacun. Attendez 5-10 secondes entre les applications de série pour la solution à sécher.
- Prenez soin d'éviter de renverser la solution à 2% Ox sur les régions autres que l'arrière, et d'attendre que la solution à sécher entre les applications.
- 5-7 jours
- Préparer une solution à 1% de (Ox) dans de l'éthanol absolu, et incuber à 50 ° C pendant 15 min sur une plaque en rotation dans un incubateur.
- Doucement mais immobiliser fermement la souris à la peau du cou et de la queue base avec l'abdomen vers le haut et le cou légèrement incliné vers le bas (semblable à une attente pour une injection intrapéritonéale) et appliquer 100 pi de 1% Ox au flanc rasé dans plusieurs applications en série et prendre le temps de sécher la peau après que décrit ci-dessus.
- Pour les souris de contrôle, applique 100 pl de véhicule de l'éthanol absolu pour le flan raséek.
2. Flanc peau récolte
- Euthanasier la souris en utilisant du dioxyde de carbone par inhalation, et exciser soigneusement la zone souhaitée de la peau du flanc (~ 25 mm x 25 mm de la peau) avec 10 cm ciseaux chirurgicaux.
- En utilisant une lame chirurgicale propre, nette, gratter l'excès de graisse et du tissu conjonctif de la peau de flanc.
- Placer 3 morceaux de peau de flanc de 3 souris dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de HBSS RT [avec rouge de phénol, sans calcium ou magnésium, 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 10 mM, 4- (2-hydroxyéthyl) -1- piperazineethanesulfonic acide (HEPES), et 10% de sérum bovin fœtal (FBS)].
Laver des tissus 3. Pré-digestion
- Placer le tube contenant des fragments de peau sur un plateau tournant pendant 30 min dans un incubateur sec non gazé maintenu à 37 ° C.
- Vortex vigoureusement pendant 10 s à la fin de la période d'incubation.
- Filtrer le contenu du tube à travers une 70 umFiltre à jeter le tampon de lavage et de recueillir le tissu. Un seul filtre peut être réutilisé tout au long de la procédure entière dans un groupe de traitement biologique.
- En utilisant une paire de pinces, transférer la peau du flanc de la crépine dans un nouveau 50 ml tube conique contenant 10 ml de frais, RT HBSS médias (contenant de l'EDTA, HEPES, et FBS comme décrit ci-dessus).
- Avec une participation de 12,5 cm paire de ciseaux chirurgicaux de dissection immergés dans le tube, émincer chaque morceau de peau de flanc de sorte que le moyen à la pièce de tissu est d'environ 2,2 mm x 2,2 mm dans la zone.
- Placer le tube contenant des fragments de peau sur un plateau tournant pendant 30 min dans un incubateur sec non gazé maintenu à 37 ° C.
- Vortex vigoureusement pendant 10 s à la fin de l'incubation,
4. digestion à la collagénase de la peau
- Filtrer le contenu du tube à travers une passoire 70 um, de collecter et de transférer les morceaux de peau de flanc dans un nouveau 50 ml tube conique contenant 10 ml fresh, RT HBSS médias complété avec 0,7 mg / ml collagénase D.
- Placer le tube contenant du milieu de digestion et de fragments de peau sur un plateau tournant pendant 30 min dans un incubateur sec non gazé maintenu à 37 ° C.
- Vortex contenu des tubes vigoureusement pendant 10 s à la fin de l'incubation.
- Filtrer le contenu de tube à travers une passoire 70 um dans un nouveau 50 ml tube conique; garder l'écoulement contenant le tissu digéré et jeter le filtre et le flanc débris de peau.
- Laver la accréditives dans 50 ml de milieu HBSS, centrifugeuse pendant 5 min à 350 g, et décanter le surnageant.
5. Densité centrifugation en gradient
- En utilisant une pipette sérologique, ajouter 3 ml de 67% RT gradient de densité de support de centrifugation dans une solution saline tamponnée phosphate 1X (PBS) dans un nouveau tube conique de 15 ml pour chaque échantillon.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de 44% RT densité milieux de centrifugation en gradient dans du HBSS avec du rouge de phénol.
- Gentlemanly couche 5 ml de gradient de densité de support de centrifugation 44% contenant les cellules sur le dessus de la centrifugation en gradient de densité de médias échantillon de 67% en utilisant une pipette sérologique. Veillez à régler la pipette à la vitesse la plus lente, et placez la pipette le long de la paroi du tube conique. Soyez prudent de ne pas secouer, perturber ou inverser le dégradé.
- Réglez l'accélération à la position la plus basse, desserrer le frein, et centrifuger le gradient à 931 g pendant 20 min à température ambiante en veillant à ce que la centrifugeuse est équilibrée.
- Après centrifugation, retirer délicatement le gradient de la centrifugeuse, et transporter doucement vers la paillasse tenant le tube vertical. Utilisation d'un transfert de 5 ml en plastique pipette, retirer la couche de cellules à l'interface du gradient de densité médias et le transfert de centrifugation de 44% et 67% à un nouveau tube de 15 ml conique. Si l'interface est pas visible, il suffit de retirer environ 2 ml de liquide à 67% -44% frontière.
- Remplir le tube conique contenant des cellules de la porcelainerface avec 2% de FBS dans 1X PBS glacé, des cellules de centrifugation pendant 5 min à 350 x g, et décanter le surnageant.
Note: Ceci est la première fois que les cellules peuvent être refroidis / conservés au froid depuis étapes de la digestion sont à 37 ° C et les étapes de médias gradient de densité de centrifugation sont à la température ambiante. Les cellules peuvent être remises en suspension dans un rapport 1: 1 Trypan dilution bleu et comtes et des informations sur la viabilité peut être obtenue à ce stade.
6. Blocage et coloration pour l'analyse par cytométrie en flux
- Bloquer FcyRII / récepteurs III sur les cellules pour éviter les taches d'anticorps non spécifique. Pour les expériences décrites ici, faire des maîtres d'anticorps mélanges dans du PBS avec 2% de FBS contenant dilution 1: 100 d'anticorps non conjugué contre le CD16 / 32 (2.4G2) pour lier et bloquer FcyRII / III récepteurs.
- Incuber les cellules bloqués avec des mélanges maîtres appropriées d'anticorps contre CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (de 53 à 6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), et Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), ainsi que Brilliant Violet 510 en direct tache / morts pour identifier les cellules mortes. Utilisez tous les anticorps soit à la dilution recommandée par les fabricants ou préalablement optimisé par des chercheurs. Pour les expériences décrites ici, utiliser tous les anticorps au 1: 100 dilution.
- Laver les cellules et remettre en suspension dans 50 ul de tampon de coloration avec du PBS 1X 2% de FBS. Garder sur la glace jusqu'à ce que les données de fluorescence peuvent être acquis sur un cytomètre de flux.
Remarque: Il est important d'avoir des paramètres de compensation pré-optimisés avec un tissu lymphoïde et un antigène de surface de cellule commune (comme CD4 ou CD8) avant l'acquisition des données de fluorescence. - Pour augmenter le nombre de cellules pour analyse par cytométrie en flux en aval, acquérir des données à partir d'échantillons entières de cellules colorées.
7. Analyser cytométrie en flux de données utilisant des méthodes standard pour accomplir les étapes ci-dessous
- Premièrement, porte sur la région de lymphocytes de la diffusion vers l'avant(région) par diffusion latérale (région) intrigue.
- Ensuite, sélectionnez les cellules simples en utilisant la dispersion vers l'avant (largeur) par diffusion latérale (largeur), pour éviter d'analyser doublets. Cela peut également être réalisé avec une hauteur de diffusion vers l'avant par parcelle de la hauteur de la dispersion latérale.
- Ensuite, porte sur la filiation (CD11b, CD11c, et CD45R / B220) séronégatifs et CD3 positive des événements, d'exclure les macrophages, les cellules des cellules dendritiques, et B, respectivement, et confine analyses pour le compartiment des cellules T, si l'objectif est, comme ici, pour évaluer l'infiltration des lymphocytes T.
- Ensuite, porte sur des cellules vivantes qui excluent la tache en direct / morts.
- Enfin, porte sur la population de cellules d'intérêt (voir la section des résultats représentatifs).
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Representative Results
La collagénase D splénocytes traités présentent des niveaux similaires de CD4 et CD8 α sur les cellules T par rapport aux témoins traités médias
Tout d'abord, les effets potentiels de la collagénase D sur la fréquence et la surface de la lignée et l'abondance des marqueurs d'activation sur des sous-ensembles de cellules T ont été évalués en utilisant le tissu lymphoïde secondaire en tant que témoin. Une suspension de splénocytes a été obtenu à partir de souris ND4 et lavé pendant 1 heure avec du HBSS médias. Ensuite, la moitié des cellules soumises à 0,7 mg / ml de collagénase D (comme décrit au paragraphe 4 ci-dessus). Les cellules restantes ont été remises en suspension dans le contrôle du milieu HBSS. Ensuite, les deux fractions de splénocytes ont été traitées en utilisant un gradient de centrifugation de densité tel que décrit dans la section 5 ci-dessus. Les cellules ont ensuite été colorées avec des anticorps contre la surface CD4 et CD8a, et analysés sur le cytomètre de flux. Simple, direct, CD45 +, non-lignée T - (B220 - CD11b -CD11c -), les cellules CD3ɛ + ont été fermée pour l'analyse, d'exclure les cellules B, les macrophages, les cellules dendritiques. Protéines CD4 et CD8a ont été également détectés sur la surface de splénocytes qui ont été soumis à une collagénase D digestion et ceux n'a pas été exposé à l'enzyme à environ 60% CD4 + CD8a - cellules et 30% CD4 - CD8a + cellules détectées avec soit un traitement ( La figure 1A). Par conséquent, la collagénase D digest n'a pas affecté la fréquence relative des CD4 et CD8a. Les intensités de surface CD4 et CD8a moyenne géométrique unités de fluorescence (GMFI) sur ces sous-ensembles étaient également comparables entre les deux traitements; GMFI valeurs pour CD4 étaient respectivement de 2,271 traitée avec des enzymes et 2243 pour des splénocytes de commande, et les valeurs pour GMFI CD8a étaient de 536 et traitée avec des enzymes pour 520 splénocytes de contrôle. Traitement enzymatique a également eu aucun effet sur la densité surfacique des activation des cellules T C les marqueursD44 ou CD62L sur les cellules T CD4 + (figure 1B). Valeurs d'intensité de fluorescence moyenne géométrique pour CD44 ont été de 669 et traitée avec des enzymes pour 654 splénocytes de commande; valeurs GMFI pour CD62L étaient 1523 traitée avec des enzymes et 1517 pour splénocytes de contrôle. Comme la collagénase D digestion préserve l'intégrité des protéines de surface sur des cellules isolées, le protocole décrit ici peut être utilisé en toute confiance pour analyse par cytométrie en flux en aval.
Digestion enzymatique et la purification de la peau gradient de flanc cellules résultats dans la viabilité cellulaire élevée
Le rendement en pour cent cellulaire et la viabilité de la suspension cellulaire obtenue ci-dessus ont été évalués en utilisant l'exclusion au bleu Trypan 20 colorant. Ce protocole de gradient et la séparation digestion a donné environ 250 cellules immunitaires viables par mm 2 de tissu de flanc des souris Ox-contestées et environ 4 cellules immunitaires viables par mm 2 de tissu chez la souris avec le véhicule en causequi ont été préalablement sensibilisées avec Ox (tableau 1).
Digestion enzymatique et la purification de la peau gradient de flanc cellules résulte en reprise robuste de cellules immunitaires
Ensuite, l'étendue de l'infiltration immunitaire dans la peau a été déterminée en analysant l'abondance des protéines de surface CD45 sur des cellules isolées à partir du flanc de Ox-contestée et les souris témoins pour évaluer la récupération de cellules immunitaires infiltrant la peau en utilisant les procédés décrits ici. CD45 est une lignée marqueur pan-hématopoïétique 21. 95% des bas avant et dispersion latérale, des cellules individuelles (gating non représenté) chez la souris Ox-contestées et 71% de ces cellules dans les contrôles de véhicules contesté étaient CD45 + cellules en direct (Figure 2). A ~ 67 fois plus de cellules infiltrant CD45 + immunitaires a été détecté dans la peau du flanc après 3 défis Ox quotidiens en utilisant la procédure décrite ici (tableau 1).
Trois défis flanc Ox résultat de l'infiltration prononcée des cellules T et des neutrophiles
Notre technique a abouti à une population de cellules de peau de flanc qui pourrait être utilisé pour détecter une variété de sous-ensembles myéloïdes et des cellules lymphoïdes telles que Gr-1 +, des cellules neutrophiles 22 et les cellules T CD4 T CD8a. Nous avons observé ~ 6 fois, ~ 7 fois, et augmente ~ 73 fois dans les neutrophiles, les cellules T CD4 et les cellules CD8a T, respectivement, à la suite 3 défis Ox quotidiens (tableau 1). Nous avons calculé ces augmentations en multipliant le nombre total de cellules viables obtenues (comptées en utilisant l'exclusion au bleu Trypan) par le pour cent du fragment de cellule immunitaire donnée sur la grille de cellules viables lors de l'analyse par cytométrie en flux. Nous avons ensuite divisé le nombre de cellules immunitaires viables totales, Gr-1 +, CD4 + ou CD8a + cellules chez les souris Ox-traités par les chiffres correspondants pour les souris de contrôle du véhicule, nous donnantfold augmentation des sous-ensembles de lymphocytes. Gr-1 + neutrophiles représentaient 42% de la seule, CD45 + en direct B220 - CD11b - CD11c - cellules chez les souris Ox-traités et 10% de cette population dans les souris traitées EtOH (Figure 2B). Chez les souris Ox-traités, ~ 52% des cellules T CD3 + gated étaient CD8a + et ~ 34% étaient CD4 +, tandis que dans les contrôles de véhicules, ~ 9% des cellules T étaient CD8a + et 57% étaient des CD4 + (figure 2C) . Par conséquent, avec la technique décrite ici, la peau allergique et non allergique flanc peut être traité pour donner des suspensions de cellules simples adaptés à haute résolution cytométrie de flux caractérisation des sous-ensembles d'infiltration de cellules immunitaires.
| Cellules sous-ensembles de la peau du flanc de la souris | Ox / Ox (3) | Ox / EtOH (3) | Pliez Expansion (Ox / ETHANOL) |
| par mm 2 tissus | |||
| Nombre total de cellules | 262,7 | 5.3 | 49,3 |
| Les cellules CD45 + de immunitaires | 250,7 | 3.8 | 66,7 |
| CD4 + CD8 - cellules | 6.5 | 0,9 | 7.2 |
| CD4 - cellules CD8 + | 10,6 | 0,1 | 72,9 |
| Les neutrophiles | 8.6 | 1.5 | 5.6 |
Tableau 1. Téléphones rendements de la peau de flanc allergique chez les souris femelles ND4. Les cellules viables isolées à partir de peau de flanc ont été comptés en utilisant l'exclusion au bleu Trypan, et normalisée aux cellules / mm 2 tissus sur la base de la zone de peau isolé et le nombre de souris mis en commun par tispoursuivre la préparation. Nous avons calculé le rendement total des cellules immunitaires sur la base de la détection de l'antigène CD45 sur la surface hématopoïétique cellulaire, lymphocytes et les rendements de sous-ensembles sur la base de marqueurs de surface spécifiques à la lignée. Nous avons ensuite divisé le nombre de cellules dans des souris Ox-traités par les numéros pour les souris de contrôle du véhicule, nous donnant fois plus important sous-ensembles de lymphocytes. Les données présentées représentent les données regroupées 2-3 souris par traitement, et sont représentatifs de deux expériences indépendantes.
Figure 1. Enzyme de digestion et le gradient purification de splénocytes à préserver les sous-ensembles de lymphocytes et des marqueurs d'activation des cellules. Les splénocytes lavée pendant 1 heure avec des milieux HBSS, incubées avec soit la collagénase D ou médias HBSS seul et purifié en utilisant un gradient de densité pour éliminer les débris et les globules rouges. Les cellules T ont été identifiés comme direct, CD45 +, de la lignée (B220, CD11b, CD11c) <sup> -, et CD3ɛ +. La fréquence des cellules CD4 et CD8a T n'a pas changé après digestion enzymatique (A). Densité de surface de CD44 et CD62L sur les cellules T CD4 + n'a pas changé après la digestion enzymatique (B). Les données présentées représentent les données compilées 2-3 souris par traitement à partir d'une seule expérience. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Enzyme la digestion et la purification gradient de cellules de la peau révèlent infiltration immunitaire distincte dans le contrôle contre la peau du flanc de la souris allergène en cause. Trois défis flanc Ox produisent une augmentation de ~ 67 fois dans les cellules immunitaires infiltrant la peau chez la souris ND4 suisses préalablement sensibilisés ( A). Trois défis Ox prov aussioked une augmentation de ~ 6 fois dans Gr-1 + neutrophiles (B), et ~ ~ 73- et 7 fois plus de cellules CD8a + et T CD4 +, respectivement (C). CD45 + en direct les cellules immunitaires sont déclenchés à partir de cellules de dispersion simples, faibles avant et latérales; neutrophiles et les cellules T gated du B220 - CD11b - CD11c - cellules individuelles vivantes. Comptages ont été effectués en utilisant un mélange 1: 1 bleu Trypan dilution après la séparation de gradient de densité. Les données présentées représente les données compilées 2-3 souris dans chaque groupe de traitement, et sont représentatifs de deux expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La caractérisation des changements dans les leucocytes de la peau résident dans des modèles de rongeurs de maladies de peau telles que la dermatite atopique ou le psoriasis est important pour la compréhension de connexions mécaniques entre les afflux de cellules inflammatoires et la pathologie de la maladie. Nous décrivons ici une technique économique pour isoler des leucocytes à partir du tissu de la peau avec l'équipement de base dans la plupart des laboratoires de recherche biomédicale. Cette technique relativement rapide évite l'utilisation de tissus coûteux machines de dissociation et des tubes de mesure et les réactifs, en aidant à conserver les ressources tout en minimisant les temps sur les mains à la table de laboratoire. Enzymatique brise digérer et séparation en gradient discontinu éliminer la majorité des cellules et des débris épithéliales et les cellules isolées peuvent être utilisées pour une variété d'applications en aval, y compris une analyse par cytométrie de flux, le tri cellulaire, le transfert, la culture cellulaire et dans des dosages de stimulation in vitro. Digestion enzymatique avec de la collagénase D n'a aucun effet sur l'intégrité de T marqueur de surface cellulaire, et conserves viabilité cellulaire. Ce protocole peut être facilement modifié pour traiter la peau d'autres régions que le flanc.
Les étapes les plus critiques de cette procédure sont: 1) enlever soigneusement tout le tissu adipeux et conjonctif tout en récoltant la peau, 2) la manutention et le tissu de traitement rapide pour maximiser l'infiltration rendement des cellules tout en minimisant la mort cellulaire, 3) la superposition doucement la pente, et 4) avec précaution l'extraction de l'interface du gradient. Avant de commencer une expérience à grande échelle, il est important de pratiquer centrifugation en gradient de densité superposition des médias et l'élimination de l'interface. On peut pratiquer la récolte de cellules à partir d'un gradient de densité discontinu en écrasant toute une rate murine à travers une passoire 70 um dans le tampon de coloration PBS 1X et effectuer le gradient de densité tel que décrit ci-dessus à l'étape 5. Il est beaucoup plus facile à voir et à extraire l'interface entre le 44% des médias gradient de densité de centrifugation et les médias 67% gradient de densité de centrifugation en utilisant splenocytes, en raison du grand nombre de cellules immunitaires présentes.
Lorsque vous travaillez avec des gradients de densité, les bulles doivent être évités lors du pipetage, et les perturbations de gradient doivent être minimisées. Le tube conique contenant le gradient doit être manipulé doucement et en position verticale en tout temps. Solutions médias de centrifugation de gradient de densité doivent toujours être à la température ambiante, pipettes sérologiques définis à la vitesse la plus lente de sortie possible, la centrifugeuse maintenu à RT, mis à bas l'accélération avec le frein désengagé, et soigneusement équilibrés avant de tourner. Lorsque l'on travaille avec des préparations pour la peau qui produisent un petit nombre de leucocytes infiltrants, les cellules ne sont pas toujours visible à l'interface du gradient. Ainsi, il est important de faire la densité support de centrifugation en gradient de 44% avec du HBSS contenant du rouge de phénol de sorte que l'interface peut être facilement visualisé quand même une couche de cellules ne peut pas être discernée. En outre, il est important d'être doux, mais rapide lors de l'extraction, lave-et le traitement de tissus de la peau pour éviter la mort des cellules avant que la peau est placé dans le support du HBSS.
Si la viabilité cellulaire ou la pureté est faible, plus courte (~ 20 min) temps de digestion, des concentrations légèrement inférieures de la collagénase D (~ 0,5 mg / ml), ou hacher le tissu plus finement pourrait être utile. Parce que plus-digestion et la dégradation des tissus peut contribuer à la mort cellulaire, les enquêteurs auront besoin pour optimiser le temps de digestion minime qui fournit une assez grande taille de l'échantillon de la cellule 17. Le processus nécessitera probablement plusieurs cycles de l'optimisation dans les mains des enquêteurs individuels de normaliser la technique. Collagénase niveau d'activité D peut également varier entre les lots de fabrication et les ajustements aux temps de digestion devra être faite pour chaque lot d'enzyme utilisée. Lors de l'optimisation, il est important de suspensions de cellules de référence (par exemple les taches de rate) purifiés avec ou sans une étape de digestion enzymatique avec un colorant Vivant / Mort fiables ainsi que des cellules immunitaires linmarqueurs de EAGE (par exemple CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.) pour vous assurer que les populations de cellules et des marqueurs de surface d'intérêt sont conservés à travers le processus de la digestion du tissu. Si possible, il est utile d'effectuer des optimisations sur un cytomètre de flux qui permet de mesurer l'avant et la largeur de la dispersion latérale ou la hauteur ainsi que la zone, afin d'exclure des agrégats de cellules. Enfin, les suspensions de cellules doivent être examinées au microscope optique pour l'évaluation visuelle de la viabilité cellulaire et morphologie générale. Les cellules peuvent être comptées manuellement à l'aide de 0,4% au bleu Trypan exclusion de colorant sous un microscope optique ou sur un cytomètre en flux en utilisant des billes de comptage. Pour les études qui nécessitent une quantification plus rigoureuse des types de cellules spécifiques dans le tissu excisé, les chercheurs peuvent peser ou mesurer le volume de fragments de tissu avant et après la digestion, et en utilisant l'étendue de la digestion à estimer plus précisément le nombre de sous-ensembles de cellules présents dans l'être tissulaire analyser.
Une limitation de cetteprotocole est qu'il est particulièrement adapté à la purification des cellules immunitaires. Si on est intéressé par l'isolement, la purification et l'analyse d'une autre population cellulaire (par exemple la peau des cellules épithéliales), le gradient de densité set-up et de la digestion enzymatique protocole permettra à la fois besoin susceptible d'être modifiée et optimisée pour isoler au mieux les cellules d'intérêt. Cependant, ce protocole permet un isolement et la purification des deux sous-ensembles de cellules lymphoïdes et myéloïdes et peut donc être adapté à la plupart des applications immunologiques. Une autre limitation est que ce protocole ne peut pas être utilisé pour différencier les populations de cellules infiltrant le derme contre l'épiderme de la peau. Pour atteindre ce niveau de la différenciation, ce protocole devrait être adapté en outre avec des étapes supplémentaires pour séparer les enzymatique derme et l'épiderme avant ou à la place des étapes décrites ici. Ici, les échantillons sont mis en commun à partir de ~ 3 souris afin de faciliter l'analyse multi-paramètre de cytométrie de flux qui rend difficile ladétecter la variabilité entre les réplicats biologiques. Toutefois, en fonction de l'application en aval de choix, ce protocole peut être facilement modifié pour produire et utiliser des échantillons provenant de sujets simples. Enfin, le protocole présenté ici pour les jeunes, peut-être besoin d'être modifié pour les souris de différents âges, le sexe ou souches selon les besoins des chercheurs souris femelles ND4.
En résumé, cette combinaison de enzymatique douce digérer et la séparation de gradient discontinu fournit une méthode simple, efficace et économique de purifier les cellules immunitaires de lésions inflammatoires de la peau chez la souris. Il peut être utilisé et adapté globalement dans un large éventail de modèles de rongeurs de pathologies cutanées comme un outil pratique pour évaluer l'infiltration immunitaire et isoler une population pure, de leucocytes viables pour les applications en aval.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier ou autre à divulguer.
Acknowledgments
Le National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 à DC), l'Association nationale Vulvodynia (prix à DC), et Macalester College soutenu ce travail. CB a reçu une bourse du Programme de Beckman Scholars Macalester College, financé par la Fondation Arnold et Mabel Beckman. BTF et TM sont pris en charge par la FRDJ 2-2011-662. Nous remercions le Dr Jason Schenkel et le Dr Juliana Lewis pour obtenir des conseils techniques, et tous les membres actuels et anciens du laboratoire Chatterjea pour leur aide et leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8α-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
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