Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Induksjon av Maternal immunaktivering hos mus ved Mid-svangerskap scenen med Viral Mimic Poly (I: C)

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53643
Automatic Translation
*1, *1,2, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Introduction

Konseptet av mors immunaktivering (MIA) stammer fra epidemiologiske studier om sammenhengen mellom mors infeksjon med autisme og schizofreni en. På grunn av fravær av påvisbare replikerende retroviral patogener i placenta eller føtal hjerne etter maternal virusinfeksjon 2,3, blir virkningen av infeksjonen på avkommet antatt å være forårsaket av aktivering av morens immunsystemet i stedet for patogener selv .

Å belyse årsak-virkning forholdet mellom MIA og psykiatriske lidelser, injeksjon av kjemisk syntetisert, viral ligne dobbelttrådet RNA polyinosinic: polycytidylic syre (poly (I: C)) til gravide gnagere har blitt mye brukt som dyremodell for MIA 4,5. Poly (I: C) er anerkjent av toll-like receptor 3 (TLR3), og systemisk administrasjon av poly (I: C) induserer viruslignende akutt betennelsesreaksjon. En av de mekanismer som poly (I: C) produces unormal oppførsel og neuro-patologi hos avkommet er ved å forårsake en ubalanse i pro- og antiinflammatoriske cytokiner i mors-placenta-føtal akse 6. Flere grupper har tatt i MIA-modellen for å forstå etiologien av psykiatriske forstyrrelser 7, og på grunn av de forskjellige interesser blant forskergrupper har forskjellige tidspunkter for aktivering av immunsystemet blitt benyttet for å oppnå forskjellige perturbasjoner på utvikling av hjernen og atferd 7.

Paul H. Patterson laboratorium ved California Institute of Technology vedtar strategien med å injisere poly (I: C) i drektige mus på embryonale 12,5 dager (E12.5), som har bevist at MIA er i stand til å fremkalle atferds, nevrologiske, og immunologiske endringer i avkom som er forbundet med autisme og schizofreni 8-11. Våre tidligere verker viser at MIA avkom viser atferdsforstyrrelser (f.eks sosiale impairment, kommunikasjon underskudd, repeterende atferd, angst-lignende oppførsel, og latent hemning underskudd 8,10,12), immun feilregulering og cytokiner ubalanse 8,13,14, endring av fosterets hjerne genekspresjon 15, tap av Purkinje celle i lobule VII av cerebellum 11, endring av synaptiske eiendommer i hippocampus 9, gen x miljø samspill 13, endring av gut permeabilitet, og gut microbiota sammensetning 16. Videre er terapeutiske og forebyggende strategier også utviklet seg fra denne modellen systemet 13,16,17. Ved å fremkalle MIA E12.5, andre har vist at MIA produserer foster microglial aktivering og kolinerge utviklings endring i basale forhjerne 18, stammespesifikk interaksjon 19, hjernen cerebral synaptosomale ultra unormalt, cerebral mitokondrie respiratoriske kjeden hyper abnormalties, nedregulering av cerebral synaptosomale molekyler 17 ,depressiv-lignende atferd, svekkelse i kognisjon og hippocampus langsiktig (LTP), og underskudd på voksen hippocampus neurogenesis 20.

Her gir vi en detaljert metode for hvordan å indusere MIA E12.5 av poly (I: C), samt paradigmer av hvordan du skal bruke denne modellen til å studere etiologien av autisme og schizofreni. Det er viktig å merke seg at MIA er en risikofaktor for en rekke lidelser 4, og dens resultater er ekstremt følsomme for tiden og fremgangsmåte for induksjons samt oppdrett av gravide dammer. Som sådan, selv mindre uoverensstemmelser mellom laboratorier ofte resultere i lav reproduserbarhet og / eller forskjellige fenotyper hos avkommet. Vår metode er spesielt designet for de som er interessert i å studere MIA som miljø risikofaktor for autisme og schizofreni, og den detaljerte beskrivelsen som blir gitt vil hjelpe forskere bedre reproduserbarhet av sine data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller ble utført under godkjenning av California Institute of Technology Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Forberedelse til Tidsbestemt-parring Pairs

  1. Bruk minst 6 demninger for atferdseksperimenter og tre for genekspresjonsanalyse.
    MERK: Bruk doble antall estimerte hunnmus, ettersom bare 50% av musene blir plugget fra tidsbestemt-parring.
  2. Bruk hunnmus uten forutgående graviditet og ved 8-16 ukers alder.
    MERK: Kvinne mus som har før seksuell eksponering for hannmus, men har ikke vært gravid er akseptable.
  3. Huset den hunnmus sammen og plassere burene ved siden av hverandre for å synkronisere deres brunst. Bruke en standard mus bur med en høyde på mer enn 5,5 inches og en 75 kvadrattomme indre gulvet for å tillate huset av 5 voksne mus. Merk hver hunn mus bruker en øre slag.

2. Sette opp Tidsbestemt-mating Pair

  1. Sett opp tidsbestemt-parring 0-2 timer før den mørke syklus starter. Plasser to hunnmus i hver merd. Ta ut mus og veie dem individuelt. Ta opp kroppsvekt av hvert hunnmus.
  2. Plasser en hannmus i hvert bur med to hunnmus. Bruk trio parring å minimere fars konfunderende effekt.

3. Vaginal Plug Check (E0.5)

  1. Sjekk hunnmus 0-4 timer etter den mørke syklus ender. Løft forsiktig hunnmus fra haleroten og la musa til å ta tak i ledningen rutenett, bur toppen, eller merdkanten.
  2. Etter tegn på vaginal plugg: vaginal plugg er en synlig hvitaktig masse i vaginalåpningen. Hvis støpselet er ikke opplagt, forsiktig sette inn en 200 mL pipette inn i skjedeåpningen. Motstand fra koagulasjon bekrefter vaginal plug formasjon. Sjekk vaginal plug gang per dag.
    MERK: Vaginal pluggen er bare en indikasjon på at parringen har skjedd, og derfor ikke guarantee graviditet. Vaginal plugg kan være vanskelig å identifisere i visse stammer av mus. Søk hjelp fra en erfaren mus omsorgsperson for å øke nøyaktigheten av plug identifikasjon.
  3. Flytt koblet mus til en ny bur og gruppe huse dem. Definer dag vaginal plug utseende som embryonale 0,5 dag (E0.5).

4. På E10.5-11.5, Se etter graviditet

  1. Løft forsiktig haleroten og la musa til å ta tak i ledningen rutenett, bur toppen, eller merdkanten. Observer magen området for å se etter tegn på graviditet, for eksempel, en bule i magen (figur 1).
    MERK: tegn på graviditet er alltid mer tydelig på E11.5 enn på E10.5.
  2. Vei mus for å bekrefte graviditeten. Den gravide mus vanligvis veier omtrent 20% tyngre ved E10.5 og 30% tyngre ved E12.5 forhold til en ikke-gravide mus (figur 2). Enebolig den gravide mus i rene bur.

5. 20 mg /kg Poly (I: C) Fremstilling

  1. Bruk minst 6 dammer per gruppe for atferdseksperimenter og tre per gruppe for genekspresjonsanalyse. Fremstille den tilsvarende mengden av poly (I: C) oppløsning.
  2. Veie poly (I: C) pulver i et 50 ml konisk rør for å lage en endelig konsentrasjon på 40 mg / ml. For å minimere og standardisere stress forårsaket av injeksjonsvolum, injiserer 5 ul av poly (I: C) løsning for hvert gram kroppsvekt mus (5 ul / g, eller 5 ml / kg). Å indusere MIA, injiserer vi 20 mg poly (I: C) per kg.
    MERK: Konsentrasjonen av poly (I: C) oppløsning som er nødvendig er (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Siden poly (I: C) pulver inneholder 10% poly (I: C), trenger vi å lage en endelig konsentrasjon på (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml poly (I: C) oppløsning.
    FORSIKTIG: poly (I: C) pulver er veldig lett. Vær forsiktig så du ikke mister noen pulver ved overføring fra slikkepott til konisk tube.
  3. Legge til den tilsvarende volum av 0,9% natriumklorid (saltoppløsning) inn i det koniske kare og lukke lokket. Oppløs pulveret av bølgende saltvann dråpe over poly (I: C) pulver inntil løsningen er klar. Sentrifuger konisk rør ved 800 xg i 1 min (figur 3C). Filtrering av poly (I: C) oppløsning av 0,22 um filter. Overfør poly (I: C) oppløsning til en 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør. Valgfritt: bruke et spektrofotometer for å måle 260/280 forholdet mellom poly (I: C) oppløsning. Sikre at forholdet er mellom 1,54 til 1,82 (figur 3) som beskrevet av fabrikanten. MERK: saltvann brukes til å løse opp poly (I: C) pulver og tjene som kontroll injeksjon bør være steril og farmasøytisk karakter.

6. Saline eller Poly (I: C) Injeksjon på E12.5

  1. Vei musen på skalaen og sette den tilbake i buret. Bruk følgende formel for å beregne volumet av injeksjon for både saltvann og poly (I: C) mus: kroppsvekt (g) multiplisert med 5 = ønsket injeksjonsvolum (ul). Bruk en 0,3 ml Insuli sprøyten for å trekke opp den beregnede volum av saltoppløsning eller 20 mg / kg poly (I: C) løsning, f.eks, 150 ul av en 30 g mus.
  2. Forsiktig plukke opp musen ved haleroten og plassere den på toppen av buret. Håndtak musen forsiktig for å unngå konfunderende effekter forårsaket av stress. Sett nålen, med skrå opp, på omtrent 20 ° i forhold til muse inn i midten av de to øverste niplene (figur 4), og injisere saltløsning eller poly (I: C) oppløsning. MERK: Nålen bør byttes ut for hver mus etter injeksjon.
  3. Plasser musen tilbake til sitt hjem buret. Plasser merdene i et rolig, lite trafikk rom for å unngå de andre konfunderende effekter.

7. Day After Poly (I: C) Injeksjon (E13.5)

  1. Sjekk de injiserte mus på morgenen. Bruke en skala for å måle kroppsvekt.
    MERK: Poly (I: C) injisert drektige mus vanligvis få mindre vekt enn saltvann injisert mus dagen etter injection.
  2. Ikke forstyrr mus til avkommet blir født.

8. Gauge av MIA Avkom

  1. For å minimere konfunderende effekter av MIA induksjon, følge retningslinjene nedenfor for å måle bruken av MIA avkom.
    1. Ekskluder kullene fra tidlig eller forsinket fødsel, eller om kullstørrelse er mindre enn 5.
    2. Avlive overdreven valpene av CO 2 dersom kullstørrelse er større enn 10.

9. Valgfritt: Undersøk Akutt inflammatorisk respons Etter MIA

  1. Ofre drektige mus tre timer etter saltvann eller poly (I: C) injeksjon ved hjelp av metoden beskrevet i institusjonens Animal Care komité-godkjent protokoll.
    MERK: Livmorhals forvridning er ofte foretrukket fordi det reduserer effekten av CO 2 / eutanasi narkotika på demningen og embryo.
  2. Samle milten fra de voksne gravide mus og isolere morkaken og foster BHinn under stereomikroskop.
    1. For milt samling, lå musen på disseksjon plate og spray 70% etanol på mageregionen av de gravide mus. Bruke et par av steril saks for å lage et vertikalt snitt i midten av mageområdet under brystkasse gjennom huden.
    2. Milten sitter i venstre overlegen abdominal kvadrant. Bruk pinsett til å isolere milten. Rull milten på delikat oppgave vindusviskere for å fjerne fettvev rundt orgelet. Samle omtrent 50 mg av miltvevet og plassere dem enkeltvis i Eppendorf-rør med 500 mL RNA stabil buffer eller TRIzol å hindre nukleinsyre degradering. Oppbevar prøvene ved -80 ° C fryser inntil bruk.
    3. For placenta samling, trekk forsiktig ut livmor horn fra kroppen. Plasser livmorhornene i en petriskål fylt med Autoclaved fosfatbufret saltvann (PBS) og la formen på is. Bruk to pinsett til å rive åpne livmorveggen og avsløre fostersekken.
      1. bruke nøye pinsett for å åpne fostersekken uten å skade morkaken og fosteret. Separer placenta fra fosteret og kutte navlestrengen så nær placenta som mulig. Fjern fostersekken rusk fra morkaken. Plasser placenta individuelt i Eppendorf-rør med 500 mL RNA stabiliserer buffer eller TRIzol. Oppbevar prøven ved -80 ° C fryser inntil bruk.
    4. For fosterets hjerne samling, lagre fosteret i RNA stabil buffer fra trinn 9.2.2 til disseksjon. Tease av pial membranen fra ventrikkel i hjernen ved hjelp av delikate # 5 tang under stereomikroskop. fjerne all membranen forsiktig fra fosterets hjerne. Plasser fosterets hjerne individuelt i Eppendorf-rør med 500 mL RNA stabiliserer buffer eller TRIzol. Oppbevar prøven ved -80 ° C fryser inntil bruk.
  3. Ekstrahere RNA fra vev og omdanne RNA til cDNA. Analyser IL6 genuttrykk i cDNA ved real-time PCR.
  4. Ekstrahere RNA fra vev ved å følge den protokoll fremstilling av TRIzol. Hvis vevet blir lagret i RNA stabilisering buffer. Tine prøven og spinne ned bufferen. Overfør vevet ved spissen til en annen Eppendorf med 500 mL TRIzol og fortsette RNA ekstraksjon.
  5. Bruke et spektrofotometer for å måle konsentrasjonen, 260/280 og 260/230 forholdet av RNA. Sørg for at forholdene er over 2,0.
  6. Eliminere DNA-kontaminering ved behandling av RNA med DNase I. Mix 1 ug RNA, 1 ul 10X reaksjonsbuffer, 1 ul RNase-fri DNase, og nuklease-fritt vann til et sluttvolum på 10 pl. Inkuber konsentrat-blanding ved 37 ° C i 30 min. Tilsett 1 mL DNase stopp løsning for å avslutte reaksjonen. Inkuber blandingen ved 65 ° C i 10 min.
  7. Omvendt transkribere RNA til cDNA. Bruke 20 ul reaksjoner, og opp til 1 ug total RNA pr reaksjon. Bland 4 pl 5X revers transkripsjon (RT) reaksjonsblandingen buffer, 1 ul revErse transkriptase, til 11 ul RNA-templat etter behandling med DNase I og 4 pl nuklease-fri H 2 O foreta en avsluttende 20 ul oppløsning. Programmere termosykler vilkår for RT. En generisk tilstand omfatte: Trinn 1: 25 ° C i 5 minutter; Trinn 2: 42 ° C i 30 minutter; Trinn 3: 85 ° C i 5 min; Trinn 4: hold ved 4 ° C. Fortynn cDNA 5 ganger. For kortvarig lagring, lagre cDNA ved 4 ° C. For langtidslagring, fryse cDNA ved -20 ° C.
  8. Analyser IL6 genuttrykk i cDNA ved real-time PCR og normalisere IL6 genuttrykk p-aktin genuttrykk.
    1. Lag en master mix for IL6 og β-aktin gjenkjenning. Bruk 25 mL reaksjon, master mix for hvert gen omfatter 12,5 mL SYBR Grønn Mix, 0,5 mL av 10 mm forover primer, 0,5 mL av 10 mm revers primer og 6,5 mL nukleasefritt H 2 O.
    2. Plasser 5 mL 5x fortynnet cDNA ent bunnen av brønnen ved optisk 96-brønners reaksjonsplate. Pipetter 20 mL av master-mix til hver brønn for å ta en endelig 25 ul PCR mix. Triplikate hvert gen for hver prøve. Tett plate ved hjelp av optisk selvklebende film. Spinne ned platen ved 800 x g i 3 minutter ved 4 ° C bruke et standardprogram for real-time PCR: Trinn 1: 50 ° C i 2 minutter; Trinn 2: 95 ° C i 10 min; Trinn 3: 40 sykluser med 95 ° C i 15 sek og temperatur 60 ° C i 1 min. Legg et ekstra trinn for dissosiasjon kurve.

10. Undersøk unormal oppførsel i MIA Voksen Offspring (valgfritt):

  1. Utfør adferdstester på alderen 8-12 uker. Endre buret sengetøy minst 3 dager før testen. Akklimatisere musene til adferdstesting rommet i minst 30 minutter før testen.
  2. For prepulse inhibering (PPI), beherske musene i plexiglass sylinder med en piezo-elektrisk sensor under den. Akklimatisere musene til PPIkammer i 5 min. Expose musene med 6 studier med 120 dB hvit støy (skremme).
  3. Deretter utsette musene med randomiserte blandinger av 14 studier med bakgrunnsstøy, 14 studier med Sjokk, 14 studier av prepulse 5 dB (5 dB høyere enn bakgrunnsstøy) + Sjokk (PPI5), og 14 studier med prepulse 15 dB (15 dB høyere enn bakgrunnsstøy + Sjokk (PPI15).
  4. Gjennomsnittlig skremmeeffekt for de første 6 studier med 120 dB prøvelser. Gjennomsnittlig skremmeeffekt for de andre individuelle stimuleringer. Covert verdien til prepulse hemming (Sjokk - PPI5 eller PPI15) / Sjokk.
  5. For open-field test, plasserer du muse i hjørnet av en åpen plass arena (50 x 50 x 50 cm 3). Ta opp banen til mus i 10 minutter gjennom en takmontert kamera. Definere midt av arenaen som midtsonen (17 x 17 cm 2). Kvantifisere distanse, sentrum sone oppføringer, og tid tilbrakt i sentrumsonen manuelt eller ved bildebasert automatisk analyse programvare. For marmor begrave test, akklimatisere musen til en test bur med komprimert 5cm dyp, ren, Aspen furu sengetøy for 10 min. Returner musen til sin homecage. plassere 20 marineblå 1,5 cm diameter glass kuler forsiktig i mote av 4 x 5 arrangement. Plassere musen tilbake til test buret med kulene i 10 min. Tell kulene som har blitt begravd i 10 min testing varighet.

11. Undersøk Cerebellar nevropatologi i MIA Voksen Offspring (valgfritt):

  1. Avlive saltvann og MIA voksen avkom av bedøvelse. Perfuse musen med 50 ml PBS og deretter 50 ml 4% paraformaldehyd gjennom det kardiovaskulære systemet.
  2. Fjern hjernen forsiktig og postfix hjernen i 4% paraformaldehyde natten ved 4 ° C. Skyll hjernen med PBS tre ganger, og lagrer hjernen i PBS med 0,02% natriumazid i et 4 ° C kjøleskap til de skal brukes.
    MERK: Stilte hjernen kan lagres i PBS med 0,02% torvium azid i kjøleskapet i opptil en måned.
  3. § hjernen til 50 mikrometer tynne skiver sagittally hjelp vibratome. Samle hjernedelene med en myk børste penn. Avslutte den endogen peroksydase-aktivitet ved inkubering av delene i 0,6% hydrogenperoksid i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Inkuber delene i anti-calbindin antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (10% geiteserum med 0,1% Triton X-100 og 0,02% natriumazid i PBS) over natten ved romtemperatur. Deretter inkuberes seksjonene i tilsvarende biotinylert sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer i 2 timer ved romtemperatur.
  5. Inkuber delene avidin DH - Biotinylert peroksydase H komplekset buffer for å påvise biotin i 1 time ved romtemperatur. Utvikle seksjonene ved hjelp av peroksydasesubstrat å visualisere antigenet. Vask seksjonene med PBS tre ganger i mellom trinnene. Monter delene på objektglass. Bilde seksjonene under mikroskop.

    6. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Injeksjon av 20 mg / kg poly (I: C) ved E12.5 kunne fremkalle en akutt inflammatorisk reaksjon i morens-placenta-føtal akse og utfelle en kronisk effekt til utvikling av hjernen og atferdsmessige fenotyper 12,13. Forhøyede nivåer av et proinflammatorisk cytokin interleukin (IL) -6, er en pålitelig indikator på akutt inflammatorisk respons etter MIA. Den beste årstiden for IL6 genuttrykk i morkaken og fosterets hjerne er på 3 timer etter poly (I: C) injeksjon 12,13. Vi har vist at poly (I: C) induserer høyere IL6 genekspresjon over mors milt-placenta-fosterets hjerne (figur 5) (Data tilpasset fra Wu et al, 2015). 13. Forskere kan kombinere dette paradigmet med annen behandling for å studere hvilke faktorer som kan endre akutt betennelsesreaksjon etter MIA, for eksempel mors kosthold, genetisk mutante mus, anti-inflammatoriske medisiner, osv.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> På den annen side, atferdsendringer er også kjennetegn på MIA modellen Flere atferdstester kan gjennomføres på MIA voksen avkom å demonstrere forskjellige autistisk og schizofren-lignende. atferd. Vanligvis, når sammenlignet med saltvann avkom, MIA avkom vise færre sentrum soneringer og kortere sentrum sone varighet tilbrakt i open-felttest. De viser også hyppigere begrave atferd i marmor begrave test og lavere PPI (figur 6) (data tilpasset fra Wu et al., 2015) 13. Tap av Purkinje celler i lillehjernen lobule VII er et annet kjennetegn på MIA avkom (Shi et al., 2009). Når farget med calbindin antistoff, det er færre calbindin-positive Purkinje celler i lillehjernen lobule VII av MIA avkom sammenlignet med saltvannskontroll avkom (figur 7).

3643 / 53643fig1.jpg "/>
Figur 1. Tegnet av gravide mus. Midt-svangerskap mus kan identifiseres ved bule i buken området (pil). Innavlet C57BL / 6 mus belastning brukes her som et eksempel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Body vektendring hos gravide C57BL / 6N mus fra embryonale (E) 0.5-12.5 dager. Ved sammenligning av gravide og ikke-gravide mus med vaginal plugger stede på E0.5, den (A) kroppsvekt, og (b) prosentandel av kroppsvekten undergår en dramatisk økning i E10.5 hos gravide mus. Gravid n = 10, ikke-gravide n = 5. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE. *** P <0,001, ****p <0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Absorbance måling av poly (I: C).. Løsning Kontroller at 260/280 forholdet er mellom 1,54 til 1,82 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Poly (I: C) injeksjon på embryonale (E) 12,5 dager Scruff den gravide mus forsiktig.. Injeksjonsstedet ligger ved midtpunktet av de øvre brystvortene. Injiser nålen, med skrå opp, ved omtrent 20 ° vinkel i forhold til mus. innavlet C57BL / 6 mus belastning brukes her som et eksempel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Poly (I: C) injeksjon øker IL6 genuttrykk i milt-placenta-fosterets hjerne aksen av demningen Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM.. * P <0,05, ** p <0,01 (Dataene er opprinnelig fra Wu et al., 2015 og modifisert for artikkel 13). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. & #160;. MIA voksen avkom utviser unormal oppførsel knyttet til endophenotypes av autisme og schizofreni I den åpne felttest, MIA avkom (A) går inn i midtsonen sjeldnere og (B) bruke mindre tid i sentrum sone. (C) i marmorgravlegging testen, MIA avkom begrave flere kuler enn saltvann kontroll avkom. MIA avkom vise prepulse hemming (PPI) underskudd i (D) prepulse 5 dB og (E) prepulse 15 dB. Gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Dataene er opprinnelig fra Wu et al., 2015 og modifisert for artikkel 13). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. MIA voksen avkom oppviser nevropatologiske abnormiteter forbundet med endophenotypes av autisme. Tap av Purkinje-celler i lobule VII er blitt vist i MIA voksen avkom. Arrow: Calbindin + Purkinje celler. ML: molekylært lag, GCL: granule celle laget, PCL. Purkinje celle laget Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MIA induksjon ved forskjellige tidsvinduer perturbs ulike hjernens utvikling hendelser i gnagere, og dermed fører til ulike atferdsmessige abnormiteter og neuro-patologi hos avkommet. Her beskrev vi en protokoll for å indusere MIA i mus med poly (I: C) injeksjon ved E12.5. Denne metoden for MIA induksjon fører til atferds, nevrologiske, immunologiske og gastrointestinale misdannelser assosiert med autisme og schizofreni hos avkommet 8,10,11,16. Det er viktig å merke seg at, fordi MIA er en miljømessig risikofaktor, er fenotypen av avkommet forventes å ha høyere variasjon enn den til mus fra genetiske modeller av nevrologiske lidelser. Derfor, for å nøyaktig og konsekvent generere autisme og schizofrenirelaterte fenotyper gjennom MIA, er det spesielt viktig å minimalisere ytterligere variabler som kan forvirre resultatene.

Tidslinjen er beskrevet i protokollen bør følges tettly. Riktig injeksjonstidsvinduet vil sikre at MIA perturbs avkommet hjernens utvikling på ønsket tidspunkt. Induksjon av MIA E12.5 i mus tilsvarer perturbasjoner nær slutten av den første trimester av svangerskapet hos mennesker 21 - en periode hvor betydelig utvikling av hjernen oppstår, inkludert utvikling av Purkinje celler og caudatus putamen, og nevrogenesen i det kortikale lag. Videre undersøkelser vil være nødvendig for å bevise sammenhengen mellom tap av Purkinje celler i MIA lillehjernen og den tidlige forstyrrelse av hjernens utvikling.

Mens konsistent behandling, undersøkelse, og selv oppdrett av dammer vil minimere effekten av mors stress på avkommet fenotype, inneholder vår protokoll fortsatt begrensninger som forskere bør være klar over. For eksempel, singel vi hus demningene dagen før injeksjonen av poly (I: C), og gjennom resten av svangerskapet. Vår strategi er å la den gravide mus i en undisturbed miljø. Imidlertid kan denne handlingen forårsake stress respons i mors miljø. Selv om vi ikke vet om dette isolert sett-indusert stressrespons forstyrrer utviklingen av avkommet, kan MIA effekt observeres ved å følge vår prosedyre.

I tillegg er stammen og genetisk bakgrunn av musene må velges og testes grundig for MIA induksjon. Så langt er effekten av MIA stort sett kopiert i villtype C57BL / 6N mus 8,10,13,16. Andre har også observert MIA effekt i BTBR musestamme 19. Det har vist seg at poly (I: C) kunne utløse forskjellige immunresponser i genetisk modifiserte mus 13,22-24, som kan innføre ytterligere kompliserende effekter til avkommet.

I forhold til antall biologiske replikater, bruker vi minst 6 kull per gruppe for atferds eller fysiologiske analyser og 3 kull per gruppe for genekspresjon, protein, eller immunohistokjemi tilnærminger. Vi tester alle avkom innenfor et kull i stedet for ved hjelp av en eller to avkom innenfor et kull for å unngå eksperimentelle skjevhet. Vi har i gjennomsnitt også dataene for alle avkom i et kull, og bruke det gjennomsnittet som ett datapunkt (slik at n = antall kull) for å unngå upassende statistikk 13. Dataene fra hvert kjønn er også slått sammen fordi ingen åpenbare kjønnsforskjellen har blitt observert i MIA modell 13.

Begrunnelsen for å måle MIA avkom av kullstørrelse er å minimere variasjonen forårsaket av mors sykepleier og omsorg. Kullstørrelse har vist seg å korrelere med stereotype atferd i C57BL / 6 mus 25. Vi spekulerer i at dette kan være på grunn av tildelingen av ressurser under morens sykepleie og omsorg. For å unngå dette forvirrende effekt, er vår standard ønsket kullstørrelse 6-10 for C57BL / 6 mus.

Selv når du følger protokollen nøye, eksperimentator kan nomotvirke en altfor svak eller overdrevent potent immunrespons hos gravide mus etter poly (I: C) injeksjon. For å unngå dette, er det viktig å validere den pyrogene og cytokinogenic aktivitet av forskjellige satser av poly (I: C). Ulike grupper og massevis av poly (I: C) fra samme selskap kan føre til ulike nivåer av betennelsesreaksjon i mus; påfallende, injisere identiske doser av poly (I: C) fra forskjellige partier kan resultere i opp til 10 ganger forskjellen i plasma IL-6 nivåer 26. Avgjøre dosering og batch av poly (I: C) for videre MIA eksperiment ved lesing av ikke-gravid kvinne IL-6 måling kan bidra til å redusere variasjonen i effekt fra MIA induksjon.

Hvis det er nødvendig å modifisere doseringen for bestemte grupper av poly (I: C), er det også viktig å modifisere konsentrasjonen av poly (I: C) oppløsning for injeksjon slik at volumet injiseres forblir omtrent 5 mL per gram mus vekt. For eksempel, i henhold til fremstilliacturer prosedyre, poly (I: C) er visstnok rekonstitueres ved ~ 10 mg / ml vann for å gi et polynukleotid i fysiologisk fosfat-bufret oppløsning. Sammenlignet med vår 40 mg / ml oppløsning, vil den lavere konsentrasjon øke volumet av injeksjons ved 4 folder. For gravide mus, kan et stort volum av buffer injeksjon potensielt øke presset på embryoene og innføre uønsket, konfunderende effekter på avkommet. Derfor velger vi å løse opp poly (I: C) pulver i 0,09% natriumklorid med en høyere endelig konsentrasjon for å redusere volumet av injeksjon.

IL-6 er valgt til å være markør for akutte betennelsesrespons fordi tidligere forskning har identifisert IL-6 signalering som en kritisk faktor i å mediere virkningene av MIA for utvikling av hjernen og oppførsel. Etter poly (I: C) behandling, IL-6 er den mest oppregulert cytokin i mors blod og morkake 10,12. Viktigst, Smith et al. viste at flere avsterkt oppregulert cytokiner, bare IL-6 utstilt både nødvendighet og tilstrekkelighet for induksjon av MIA-forbundet hjernen og atferdsmessige abnormiteter. Det vil si, mors injeksjon av anti-IL-6 effektivt kan hindre unormale adferds og transcriptomic unormalt i MIA avkom, mens nøytraliser andre cytokiner gjorde ikke 10. Videre maternal injeksjon av rekombinant IL-6 alene (uten poly (I: C)) gjengir MIA-assosiert transkripsjons- og unormal oppførsel sett i MIA føtal hjerne og avkom 12,15.

Sammenlignet med andre metoder for å indusere MIA (f.eks lipopolysakkarid (LPS) eller influensa), poly (I: C) er relativt trygt og gir en enkel måte å styre intensiteten av immunresponsen. Selv om den inflammatoriske respons utløst av mors poly (I: C) administrasjonen er akutt og forbigående, dens effekt på avkom atferd og hjernens utvikling er dyp. Totalt sett, når teknikken for å indusere MIA through poly (I: C) injeksjon ved E12.5 er mestret, kan man deretter fortsette å utføre ulike atferdsmessige og biologiske analyser for å undersøke effekten av denne miljørisikoen på avkommet. På samme tid, kan man også kombinere fremgangsmåten med genetiske modifikasjoner eller annen behandling før, under eller etter graviditet for å undersøke årsakene og mulige terapeutiske tilnærminger til autisme og schizofreni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi ønsker å hedre den avdøde Dr. Paul H. Patterson for hans bidrag til utviklingen av MIA modell, autisme og schizofreni forskning. Vi erkjenner Sarkis K. Mazmanian for sin store støtte på denne protokollen; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni, og Leslie A. Neumann for administrativ bistand; Ali Khoshnan og Jan C. Ko for assistanse på filming; Elaine Y. Hsiao og Natalia Malkova for deres råd om MIA induksjon; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, og Natalie A. Verduzco for deres ekspert dyrehold. Dette arbeidet ble støttet av NIH Conte Senter Award (NIH 5P50MH086383-04, Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, til Paul H. Patterson); Simons Foundation (# 322839, til Sarkis K. Mazmanian); NIH Trening Grant (NIH / NRSA T32GM07616 til K.-HC); Caltech Sommer Undergraduate stipend (SURF) (til ZY); Amgen Scholars Program ved Caltech (til ZY); og postdoktorstipend from National Science Council, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, til W.-LW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt SIGMA P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP HOSPIRA NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" COVIDIEN 8881600145
50 ml conical screw cap tubes USA SCIENTIFIC 1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC 1000 Optional
Stereomicroscope Wild Heerbrugg M5A Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm Roboz RS-5045 Optional
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76104 Optional
TRIzol reagent Life Technologies 15596-026  Optional
RQ1 Rnase-free DNase Promega M610A Optional
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8891 Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX  Roche 4913922001 Optional
Real-time PCR ABI 7300 Optional
Primer: Il6 forward Life Technologies TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Optional
Primer: Il6 Reverse Life Technologies TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC Optional
Primer: beta-actin forward Life Technologies AGAGGGAAATCGTGCGTGAC Optional
Primer: beta-actin Reverse Life Technologies CAATAGTGATGACCTGGCCGT Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate Life Technologies 4306737 Optionl
MicroAmp optical adhesive film  Life Technologies 4311971 Optionl
EthoVision Noldus EthoVision Optionl
SR-LAB apparatus (PPI) San Diego Instruments  SR-LAB Optionl
Marbles PENN-PLAX Blue gem stones marbles Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Life Technologies 21600-069 Optionl
Paraformaldehyde MACRON 2621-59 Optionl
Vibratome Leica VT1000 S Optionl
Sodium azide Sigma S2002 Optionl
Triton x-100 Sigma X100 Optionl
Hydrogen peroxide solution Sigma 18312 Optionl
Goat serum Vector Laboratories S-1000 Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody Abcam ab11426 Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody Vector Laboratories BA-1000 Optionl
VECTASTAIN ABC Kit Vector Laboratories PK-4000 Optionl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

Tags

Immunologi Maternal infeksjon mors immunaktivering (MIA) Polyinosinic: polycytidylic syre (Poly (I: C)) Embryonic 12,5 dager (E12.5) interleukin-6 (IL-6) Maternal-placental- foster aksen Cerebellar Purkinje celler hindbrain autisme schizofreni atferdsmessige abnormiteter
Induksjon av Maternal immunaktivering hos mus ved Mid-svangerskap scenen med Viral Mimic Poly (I: C)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L.… More

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C). J. Vis. Exp. (109), e53643, doi:10.3791/53643 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter