Summary
这里介绍的是胶质瘤浸润外周血单核细胞的分离和流式细胞术分析能够产生在进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞的数目和激活状态依赖于时间的定量数据一个直接的方法。
Abstract
我们的实验室已最近表明，天然杀伤（NK）细胞能够颅内植入后CNS-1恶性胶质瘤很快消除原位移植小鼠GL26和大鼠如果癌细胞在它们的β半乳糖苷结合凝集素的galectin表达呈现缺陷的-1（加仑-1）。更近期的工作现在显示的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞群是这种效果的关键。为了更好地了解由NK细胞和骨髓细胞协作以赋予加仑-1缺失的肿瘤排斥我们已经开发了全面的协议用于分离和胶质瘤浸润外周血单核细胞（PBMC）的分析的机制。该方法是在这里证明了外周血单个核细胞浸润比较成的肿瘤微环境GAL-1表达GL26胶质瘤与那些通过shRNA的敲除呈现GAL-1缺失。该协议开始的描述如何培养并准备GL26 CELLS接种入同系的C57BL / 6J小鼠的大脑。然后，它解释了涉及从早期脑肿瘤微环境胶质瘤浸润的PBMC的分离和流式细胞术分析的步骤。该方法是适应若干体内 ，其中免疫渗入脑颞数据是必需的实验设计。该方法灵敏度高，重现性好，为神经胶质瘤浸润外周血单个核细胞可以从颅内肿瘤一旦被隔离24小时后移植瘤与时间点匹配的肿瘤遍布独立的实验中观察到类似的细胞计数。单个实验者可以从大脑收获执行该方法流胶质瘤浸润的PBMC的流式细胞术分析中大约4-6小时取决于待分析的样品的数目。替代胶质瘤模型和/或细胞特异性的检测抗体，也可以使用在实验者自行决定，以评估其它几个与免疫的渗透Ë细胞类型，而不需要改变对整体过程的兴趣。
Introduction
胶质瘤是一类从转化胶质中枢神经系统（CNS）内所产生的神经上皮脑癌。在所有的胶质瘤，世界卫生组织（WHO）Ⅳ级神经胶质瘤，或胶质母细胞瘤（GBM），是最常见和致命的1。 GBM是高度耐火到当前标准的转交它由肿瘤切除术，以随后辐射加伴随和辅助化疗与替莫唑胺2尽可能。这些致命的癌症随身携带的只有15〜18个月的生存率从最初诊断时，只有5％的患者生存的疾病预后极差5 年 1之后。
的血脑屏障（BBB）的存在，缺乏专业的抗原呈递细胞的（的APC），和脑4内的以前未知的存在真正的淋巴结构导致基底膜免疫特权的概念。然而，大量的研究现在SHO瓦特这些脑癌确实产生外周免疫细胞主要是粒细胞中的起源，其中包括单核细胞，巨噬细胞和髓源抑制细胞（肌源性干细胞）5的募集。 GBM还影响脑驻留小胶质细胞的活性而成为亲致瘤6,7。淋巴样细胞例如CD8 + T细胞8和CD56 +自然杀伤细胞9也是在肿瘤微环境中存在的，但在少得多的数量，想到了一个事实是由于策动胶质瘤衍生的因子对肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制功能（噬细胞）10。 CD4 + T细胞也存在于GBM，但许多这类人群也表达CD25和FoxP3的，免疫调节性T（ 调节性T细胞）11机。 GBM的整体免疫抑制状态的高潮在促进免疫逃逸和肿瘤进展12。
13-19。这项工作的高潮已经导致了旨在评估组合的细胞毒性和免疫刺激治疗的患者初诊GBM（ClinicalTrials.gov标识符：NCT01811992）临床试验。
我们最近的工作表明，小鼠GL26和大鼠CNS-1 GBM细胞通过产生大量的β半乳糖苷结合凝集素半乳糖凝集素1（GAL-1）20块抗肿瘤NK细胞的免疫监视。这证明通过抑制加仑-1在神经胶质瘤细胞使用shRNA介导的基因敲除的表达。 体外 experimenTS表明加仑-1缺失神经胶质瘤细胞中培养正常增殖，但颅内植入进同源的C57BL / 6J或RAG1之后不久进行快速排斥- / -小鼠 ，从而建立T-或B细胞的独立性对这种形式的肿瘤排斥。 NK细胞免疫耗竭具有抗唾液酸GM 1抗血清或导致颅内GAL-1缺失的脑胶质瘤生长完全恢复单克隆抗体NK1.1，建立NK细胞GAL-1缺失的神经胶质瘤抑制的作用。我们现在表明的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞的免疫耗竭足以防止加仑-1缺失胶质瘤排斥尽管NK细胞的存在，从而揭示在NK介导的伽援用于骨髓细胞一个不可或缺的辅助作用的-1缺陷型肿瘤溶解（未公布的数据）。这一出人意料的结果使我们制定一个全面的协议，用于外周血单核细胞的分离和分析（外周血单个核细胞），其渗透到脑肿瘤微环境很快颅内植入后，让我们可以更好地表征，上游GAL-1缺失的胶质瘤抑制免疫渗透活动。
该方法是这里演示用鼠标GL26胶质瘤细胞组成性表达mCitrine荧光蛋白，叫GL26-CIT，它通过荧光显微镜21个州允许直接肿瘤细胞的可视化。这些细胞被立体定位植入进同源C57BL / 6J小鼠的脑和被允许之前小鼠安乐死生长24，48，或72小时。胶质瘤浸润的PBMC，然后分离和免疫标记使用抗-CD45，-GR-1，-CD11b和-NK1.1细胞表面的抗体与细胞内的免疫标记为颗粒酶B（GZMB）。这种特异性抗体的组合允许肿瘤浸润的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞的鉴定和NK1.1 + NK细胞，细胞类型，我们有bEEN牵连GAL-1缺失的肿瘤排斥。的GAL-1缺失GL26-CIT胶质瘤免疫浸润轮廓，这里称为GL26-CIT-gal1i，然后比较该胶质瘤表达加仑-1称为GL26-CIT-NT的正常水平，包含一非易失的针对对照shRNA的发夹。该协议开始于上GL26-CIT胶质瘤如何来培养细胞的说明在体外 ，随后是关于如何原位嫁接这些细胞进同源C57BL / 6J小鼠的纹状体的解释。然后，它前进到枚举涉及分离和胶质瘤浸润的PBMC用于流式细胞术分析的免疫标记的步骤。协议结尾标准数据分析和图形表示的解释。
该演示可以发现，GR-1 + / CD11b的+骨髓细胞和NK1.1 + NK细胞优先积累在48中的GAL-1缺失的脑肿瘤微环境中小时肿瘤植入，因此这有助于解释为什么这些肿瘤迅速进行完整的肿瘤溶解大约一周后的肿瘤植入20。该方法是很容易适应一些，其中对免疫渗入脑颞数据，需要在体内不同的实验设计。单个实验者可以从大脑收获执行协议流胶质瘤浸润的PBMC的流式细胞术分析在约4-6小时取决于待分析的样品的数目。该方法还可以用实验的目的是表征循环的PBMC在荷瘤小鼠对与那些渗入脑如此识别由肿瘤微环境特异性诱导的免疫抑制的表型比较的信息相结合。这和类似的方法应用应有助于更好地理解所涉及的外周免疫细胞贩运到大脑肿瘤微环境的因素。
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Protocol
注意：请回顾之前进行实验的整个协议。批准对动物的使用和福利使用脊椎动物从适当的制度委员会前必须法律程序中获得。
1.准备肿瘤细胞颅内的植入
- 工作在一个第二类生物安全柜，由通过补充的500毫升瓶中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）与10％的无菌过滤热灭活的胎牛血清制备GL26-CIT-NT / gal1i细胞培养基启动（FBS ），2mM的L-谷氨酰胺，100U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素，600微克/毫升G418硫酸盐（用于选择的mCitrine表达载体）和嘌呤霉素二盐酸盐（3微克/毫升供选择的非对靶向或GAL-1特异性的shRNA）。
- 培养GL26-CIT-NT和/或GL26-CIT-gal1i 细胞 （图1A和1B 5％CO 2的1-2天前的肿瘤细胞植入过程，或直到烧瓶达到50-80％汇合。
- 在手术当天，从神经胶质瘤细胞用10 ml的血清吸液管和移液管枪除去细胞培养基，并丢弃媒体进入废物烧杯中。
- 顶面朝下倒置烧瓶中，并用10 ml的血清吸液管加入10 mL的DPBS在烧瓶的顶侧。慢慢地倒置瓶覆盖细胞的DPBS，然后小费瓶垂直，并删除和丢弃的DPBS进入废物烧杯中。
- 加3-4的非哺乳动物胰蛋白酶替代的DPBS用EDTA（见材料清单详细信息）给每个T75组织培养瓶毫升，并放置回组织培养柜2-5分钟。使用明场显微镜，检查所有的细胞都成为从底面程序之前分离。
- 禁止furthe通过稀释胰蛋白酶的替代用6ml的DPBSř酶活性。移液器上下用10 ml的血清吸管冲洗烧瓶底部表面和以机械地分离任何细胞聚集。吸出细胞，并放入分别标记的15ml离心管中。旋细胞向下在550×g离心（最大RCF）中5分钟，在4℃（ 图1C）。
- 去除上清，轻轻悬浮细胞用1ml未补充的DMEM。确保上下彻底吸取细胞有P-1000微量实现单细胞悬浮液。
- 使1:10稀释在1.6中产生的所得细胞悬浮液通过将18微升的未补充的DMEM成0.6毫升的锥形聚丙烯微型管，随后加入2微升的肿瘤细胞悬浮液。吸液管上下使用P-10微量彻底均化细胞。
- 加入10微升＆＃160;在1.7产生一个单独的0.6毫升的锥形聚丙烯微型管1:10肿瘤细胞稀释，然后加入10微升台盼蓝染色添加到管中。调匀用P-10微管，并添加下一个盖玻片放在血球注意不要引入气泡（ 图1D）的前10微升得到的肿瘤细胞/台盼蓝溶液中。
- 计数细胞，与使用根据与给定血细胞计数关联的特定协议的10X物镜明视场显微镜。可以肯定，在20倍稀释的原发肿瘤细胞悬浮液的细胞进行精确细胞估计在原来的1毫升一份制备期间所作的对因子。使用下面的公式来计算细胞的总数：细胞总数/毫升= [（（每平方Σcells计数）/＃计数平方）×20（即，稀释倍数）×10,000个细胞/毫升]。
- ð后etermining细胞在给定的实验中使用的每个细胞系的总数量，旋转下来，在550×g离心（最大RCF）中5分钟，在4℃。与未补充的DMEM中的适当体积除去上清液（S）和悬浮细胞，以达到3×10 4个细胞每1微升目标浓度对于每种细胞系，根据下列公式计算：（细胞总＃ / 30,000）。
- 将每个细胞系的成分别标0.6毫升锥形聚丙烯试管并置于冰上（图1E）的等效容积。一定要保存一些细胞继续繁殖每个细胞系，如果单独T75s以前没有接种。
2.程序的立体定向灌输胶质瘤细胞的成C57BL / 6J小鼠的纹状体
- 准备手术前工作的外科麻醉，镇痛，和麻醉逆转的解决方案如下：
- 对于氯胺酮/右美托咪小号urgical麻醉：从10毫升小瓶中的无菌的0.9％NaCl注射除去1.4毫升，并替换为600微升氯胺酮盐酸盐100mg / ml的储备液和800微升右美托咪盐酸盐的0.5毫克/毫升储液，得到盐酸氯胺酮（6毫克/毫升）和右旋美托咪盐酸盐（0.04毫克/毫升）的混合工作溶液。
- 丁丙诺啡镇痛：从10毫升小瓶中的无菌的0.9％NaCl注射除去1毫升，并与整个1毫升体积的单个0.3毫克/毫升的库存盐酸丁丙诺啡安瓿的替换，得到0.03毫克/毫升工作溶液。
- 对于阿替美唑外科麻醉逆转：从10毫升小瓶中的无菌的0.9％NaCl注射除去1毫升并用1毫升的阿替美唑盐酸盐的5毫克/毫升储液替换，得到0.5mg / ml的工作溶液。
- 工作在经批准的位置，鼠标生存小号urgery，开始通过设置蒸压或珠粒消毒手术器械和其它试剂如所示（图2A），然后获得足够的8-10周龄的雌性C57BL / 6J小鼠（同基因同GL26胶质瘤）所需的研究;确保他们连续获得食物和水。
- 通过提供75毫克/千克氯胺酮和0.5mg / kg的美托咪啶（约250微升的20克小鼠）的剂量麻醉第一鼠标与单次腹膜内（IP）注射的工作麻醉溶液。接着，得到5mg / kg的皮下（sc）注射卡布洛芬（大约100微升的20克小鼠）。确保鼠标无反应之前，诉讼脚趾和尾掐。
- 用手术剪，从头盖骨刮胡子的皮毛。应用碘伏消毒液剃光区域，擦洗用70％的异丙醇消毒片，然后重新申请碘伏消毒液。接下来，适用于少量免缝的勒凡士林眼药膏每只眼睛，以防止干燥。
- 根据以下方案固定头骨在立体定位框架：
- 小心地用一对弯曲解剖钳轻轻地拉出舌头，并移动到嘴，以防止窒息的一侧达成张开嘴。允许钳子缩回，而在嘴顶端2门牙传播颚开放和引导到立体定位框架上的齿杆的钥匙孔。从通过调整各自的螺钉水平或垂直枢转固定齿杆。确保鼠标的颅骨与台式水平。
- 将耳杆安全地对头盖骨小心，不要为了防止破碎申请在头骨太大的向内压力的眶后骨。
- 将鼻栏在口鼻部，并拧紧紧。检查存在的头部没有垂直/横向移动通过施加温和的压力用拇指和食指。甲鼠标正确放置到立体定位框架中示出（图2B）。
- 使用手术刀刀片，使1cm的中线切口在从额骨到枕骨颅内。收回的皮肤在使用科利柏拉钩切口。
- 降低微升注射器配备有附连到立体定位框架前囱的（图2C）的位置的正上方的竖直臂33克针。从那里，调整针0.5毫米AP的位置，2.5毫米ML到达目标部位为肿瘤植入。用1毫升的结核菌素注射器配备了一个＆G的针轻轻谴责某个骨膜，以纪念这个位置。
- 钻一个孔进入颅骨在靶部位直到使用装有1/32“（0.8mm）的比特的无绳精度电钻到达下层的硬脑膜。随钻，应用间歇压力接着除去DRI的从颅骨表面LL位，以避免过多的热量和力，可能会以其他方式导致钻头穿孔底层脑组织。
- 冲洗微升注射器用0.9％NaCl的1.7毫升的锥形聚丙烯微型管中，以确保针头未堵塞。轻轻振动含有肿瘤细胞数次以悬浮细胞的0.6毫升锥形聚丙烯微型管。
- 制定2微升细胞进入微升注射器确保没有气泡被导入注射器。分配1微升的细胞到70％异丙醇消毒片留下残留在注射器肿瘤细胞的完全1微升。
- 把针下去，直到它触及硬脑膜，介绍了针入脑-3.5毫米腹侧和+0.5毫米收回。缓慢，平稳地通过压下针筒柱塞超过1-2分钟的过程递送细胞。
- 允许细胞settlE在注射部位5分钟前，慢慢抽出针。擦拭任何凝结的血液或脑物质从针尖用干净的70％异丙醇消毒片。冲洗针并与0.9％的NaCl从步骤2.6注射器彻底，以确保针头未堵塞为下一次注射。
- 取出科利柏拉钩和缝合用三个3-0尼龙单丝缝合头皮。从立体定位框架移开鼠标和管理0.1毫克/千克丁丙诺啡盐酸皮下（SC）（约67微升0.03毫克/毫升的工作为20克小鼠溶液），随后加入2.5毫克/千克阿替美唑盐酸盐肌内（IM） （约100微升0.5毫克/毫升的工作为20克小鼠溶液），用于手术后的疼痛缓解和麻醉逆转。将手术后的小鼠回正在加热灯下恢复他们的笼子。
3.鼠标穿心Perfus离子的脑和收获
- 根据以下方案制备肝素化的台氏溶液：
- 把磁力搅拌棒为1升的玻璃螺丝帽储存瓶，并填写到体积超纯去离子水。上放置一个搅拌板的瓶子。
- 称量并添加以下化学品的玻璃瓶，边搅拌边来说：8g氯化钠（盐），0.264克氯化钙（氯化钙2•2H 2 O），0.05克磷酸二氢钠（氢化钠2 PO 4•2H 2 O）， 1.0的克D-葡萄糖（C 6 H 12 O 6），1.0克碳酸氢钠（ 碳酸氢钠 ），0.2克氯化钾（氯化钾）。让盐溶解，再加入肝素钠的1,000U /毫升原液到台氏液100微升。
- 从搅拌盘取出容器，并使用磁力棒提取搅拌棒。储存在4肝素台氏液C。
- 准备终端麻醉一个工作溶液，如下所示：
- 氯胺酮/赛拉嗪终端麻醉：从10毫升小瓶中的无菌的0.9％NaCl注射除去1360微升，并替换为1200微升氯胺酮盐酸盐100mg / ml的储备液和160微升甲苯噻嗪的100毫克/毫升储液盐酸盐，得到盐酸氯胺酮（12毫克/毫升）和甲苯噻嗪盐酸盐（1.6毫克/毫升）的混合工作溶液。
- 通过将90 ml的10倍的PBS中为264 ml的超纯去离子水（3.93x）在无菌的塑料容器准备密度离心媒体组合的解决方案。滴定至pH值为7.0-7.2，用HCl和过滤消毒用0.22微米的过滤器。保存在4℃。
- 结合18毫升密度离心媒体组合的解决方案，30密度离心媒体毫升准备70％密度梯度离心介质（请参阅材料清单的细节）在50ml聚丙烯离心管中。储存在4℃，但在使用前带来至RT。
- 通过组合9.6毫升的DPBS与10.4毫升70％的密度离心分离介质在50ml离心管中制备37％的密度离心的介质。储存在4℃，但在使用前带来至RT。
- 通过将500微升的FBS到50ml DPBS（〜1％FBS）的50毫升离心管中制备流缓冲器。在店中店在4℃
- 填写一个4.5升聚氨酯冰桶与冰块的能力。
- 使1毫克/毫升胶原酶和1毫克/毫升DNA酶予以足够的量为每脑样品1毫升在研究中的组合溶液通过稀释10mg / ml的DNase的余原液1:10，50毫克/毫升胶原酶原液1:50无菌DPBS中一个15毫升的聚丙烯离心管中。轻轻地混合解决方案移液器向上和向下一个P-1000微量。储存在冰中polyurethANE水桶从步骤3.7。
- 获得两块7毫升玻璃的Dounce组织研磨。标记1“NT”，而另一个“gal1i”。将组织研磨在冰桶，并添加1 ml的DPBS的每个。
- 获得足够的15ml离心管中，从每个鼠标在研究发生在冰桶收集大脑的事。
- 广场〜150毫升的DPBS在三个50ml离心管放入冰桶。
- 获得足够的聚苯乙烯六角形称量皿（顶端内径（ID）115毫米，据点ID 85毫米，203 ml的体积）每只小鼠在研究中。一套完整的开解剖和小鼠大脑研磨所示（图3A）
- 在选定的时间点，使用单一腹腔注射150mg的麻醉第一荷瘤小鼠中的研究/千克氯胺酮盐酸盐和20mg / kg的甲苯噻嗪盐酸盐（约250微升组合12毫克/毫升氯胺酮/ 1.6米克/毫升的甲苯噻嗪工作液为20 G鼠标）来诱导深度麻醉。确保鼠标无反应到脚趾和尾巴捏之前继续。
- 检索预先制备的台氏液，并放入一个层流罩专用于终端动物外科手术。将连接到卡波罐入台氏液不透气的聚合物管。打开罐阀，以允许95％ 的 O 2/5％CO 2的卡波金连续气泡到溶液中。
- 附加一个20G的铝轴套钝针的额外不透气聚合物管连接到蠕动泵的结束。将管在蠕动泵入台氏溶液的另一端，并打开，以允许管，以填补氧化和肝素台氏液的泵。的设置为鼠标穿心灌注示于（图3B）。
- 采用四＆G针，牵制麻醉小鼠腹侧由覆盖有在层流罩处置吸收剂毛巾挤出聚苯乙烯泡沫块上的前部和后爪。
- 掌握上述腹膜腔皮肤使用一对钝器解剖钳，并采用了大量对解剖剪刀通过穿透腹膜壁，切割cephalically穿刺隔膜，然后分叉在胸骨终止在使“Y”切口左，右腋下。
- 用止血钳胸骨，反映了肋骨上鼠标的左肩膀。随着对钝性分离钳取出心包。
- 打开蠕动泵开始的氧化和肝素台氏液（约2.3-2.5毫升/分钟）的稳定滴水。
- 将钝针头插入心脏的左心室。用一把小剪刀剥离给剪断右心房允许放血（ 图3C）。
- 使台氏液彻底灌注小鼠循环系统直到肝和肺已经完全由于缺乏血液热烫。确保无毛量的血液继续退出右心房之前从左心室除去20G的铝轴套钝针。
- 取消固定鼠标的挤塑聚苯乙烯泡沫塑料块，把鼠标腹侧下来。采用大一对夹层的剪刀，分离从身体的其他部分的头部在颈部的水平。
- 用一把小剪刀清扫的，切开头皮开始在枕骨工作迈向口鼻，以露出头骨中线。
- 缩回使用拇指和食指放在颅两侧的皮肤和保持颅骨牢固。使用一对骨骨钳通开始在枕骨颅骨破裂而努力着完全露出背面和侧面大脑的表面。要小心，尽量减少损害大脑。
- 一旦颅骨已被删除，转动的小鼠腹侧的头部，并使用一对小解剖剪刀切割颅神经在大脑底部以从头骨中解脱出来。
4.隔离胶质瘤浸润外周血单个核细胞的
- 使用干净单刃刀片，分离含有肿瘤通过使一个矢状切下来的脑平分两个半球的中心的大脑区域。转同侧半球内侧下来，使2冠状削减在小脑和嗅球以分离含有肿瘤植入物（ 图4A）的靶组织的水平。对侧半球的等效部分也被分离并用作阴性对照。
- 放置在目标组织成含有1ml的分别标玻璃的Dounce组织研磨机; DPBS中，推动柱塞一路下跌，并扭转7次初步破坏组织。解除柱塞，以允许液体沉降回到所述组织研磨器的底部。重复此步骤三次;然而，只有最后一个重复过程中扭动活塞在接下来的两个重复4次和3次，以避免过度捣碎的组织。
- 使用P-1000微量，顺序地施加3 1 ml的体积的冰冷的DPBS（在3.11的方法制备）沿着所述柱塞的两侧，以冲洗进组织研磨机。
- 移液器向上悬浮研制脑物质和向下，并放入冰上标记的15ml离心管中。冲洗的Dounce组织研磨机的侧面与冰冷的DPBS 1附加毫升，并加入到相同的15ml离心管中。含有保持在冰上研磨脑质试管直至所有样本都被处理。
- 每只小鼠在研究重复步骤3.13-3.25和4.1-4.4。
- 一旦所有样品公顷已经被处理时，在15ml离心管中，在740×g离心（最大RCF）为20分钟，在4℃下降速研制脑物质。
- 用10毫升血清移液器和枪去除上清，重悬沉淀脑质1毫升事先准备好的胶原酶/ DNA酶-I消化使用P-1000酶。放置15ml离心管放入试管架并置于37℃水浴15分钟。
- 轻轻地由轻弹管，以方便组织分解搅动样品两次在整个孵化期。
- 加入6毫升冰冷的DPBS用10 ml的血清吸液管，每管以稀释消化酶。移液器上下重悬，并通过无菌70微米尼龙网过滤器的总体积的渗入在冰上新标记的15ml离心管中。
- 旋脑细胞悬浮液倒在740×g离心（最大RCF）为20分钟，在4℃下，实现了单细胞沉淀（图4B）。从离心机取出15ml试管之后将它们放置在冰上，增加温度在准备下一个步骤在离心机设定至约21℃。
- 完全从含有脑细胞每管除去上清液和重悬最初粒料在1毫升70％的密度离心媒体利用P-1000微量。然后用10 ml的血清吸液管添加70％的密度离心媒体4附加毫升到每个管中。螺丝帽上的安全，轻轻翻转，以铝管几次均匀的细胞悬液。
- 除去含有再悬浮于冰冷的70％密度离心介质，并置于在RT试管架的脑细胞的15ml离心管中。一次一个，小心覆盖2 ml的37密度离心介质溶液的％到5毫升70％的密度离心媒体有P-1000微量，形成交流两个密度离心介质层（图4C）之间瘦的界面。
- 使用细尖标记指示界面的位置，因此它可以在离心后很容易地确定，当区别变得不那么明显。
- 降速15ml离心管中，在740×g离心（最大RCF）20分钟在RT没有断点，以避免扰乱的接口。
- 离心后，收集通过引入的P-200微管为沿着其侧的管，小心地绕过脂质层已经积累在两种密度离心介质层（图4D）之间的界面的PBMC。
- 一旦在PBMC频带的电平，慢慢地从70％密度离心介质层的表面提取200微升，并放入在冰上分别标聚丙烯FACS管。重复一次，每个样品加入400μl的总体积。
- 加入3毫升流缓冲器到含有400微升的PBMC的充分稀释密度离心媒体，然后在4℃旋转细胞向下在660×g离心（最大RCF）20分钟每FACS管。
5.免疫标记胶质瘤浸润外周血单个核细胞的
- 先于分析任何实验PBMC样品中，执行一个单一的，独立的，细胞表面同种型对照实验，以建立基线门要与根据一组固定的PMT电压的内流式细胞数据分析模板专用于神经胶质瘤浸润的PBMC的评估相关的以下协议：
- 灌输1 C57BL / 6J小鼠用GL26-CIT-gal1i和另一个具有GL26-CIT-NT根据在第2节中概述72小时后的肿瘤生长的方法，安乐死小鼠和按照程序隔离肿瘤浸润的PBMC整个第3及4中概述。
- 两者结合起来PBMC样品（NT一第二gal1i）到一个体积（即100微升），然后进一步均匀划分样品在三个FACS管（即每管33.3微升） 标记为“CD45同种型”，“GR-1 / CD11b的同种型”和“NK 1。 1同型“。添加以下抗体（各以1：100稀释和稀释至200μl的流动缓冲器的总体积）与分别标FACS管：“CD45同种型”：的Alexa Fluor 700缀合的鼠的IgG2b，κ（克隆：RTK4530 ）;“的Gr-1 / CD11b的同种型”：的Alexa Fluor 700缀合的大鼠抗小鼠CD45（克隆：30-F11），PE缀合的鼠的IgG2b，κ（克隆：eB149 / 10H5），和PerCP /经Cy5.5共轭鼠的IgG2b，κ（克隆：RTK4530）;“NK1.1同种型”：的Alexa Fluor 700缀合的大鼠抗小鼠CD45（克隆：30-F11），PE缀合的大鼠抗小鼠的Gr-1（克隆： RB6-8C5），PerCP /经Cy5.5标记的大鼠抗小鼠CD11b的（克隆：M1 / 70）和APC-连接词轭小鼠IgG2a，κ（克隆：eBM2a）。
- 允许的PBMC以immunolabel在冰上于黑暗中20分钟。振动小管，一旦中途潜伏期轻轻拌匀。用1ml缓冲流洗，降速在660×g离心（最大RCF）进行10分钟，在4℃下重悬含有的PBMC用200μl流动缓冲每个FACS管。
- 使用流式细胞仪配备有85微米的集成喷嘴，分析了“CD45同种型”管先以建立基线CD45间隔栅极。接下来，运行“GR-1 / CD11b的同型”管只使用真正的CD45 +细胞的输入，建立一个基线GR-1 / CD11b的象限门。最后，运行“NK1.1同型”管只使用真正的CD45 + / GR-1 的低 / CD11b的+/-细胞的输入，以建立基线NK1.1间隔门。
- 使用以下过程为所有未来实验的alysis：
- 制成1足够量：100稀释的细胞表面抗体在流缓冲器达到每样本200μl的体积（加1为GZMB同种型）：的Alexa Fluor 700缀合的大鼠抗小鼠CD45（克隆：30-F11 ），PE缀合的大鼠抗小鼠的Gr-1（克隆：RB6-8C5），PerCP /经Cy5.5标记的大鼠抗小鼠CD11b的（克隆：M1 / 70），APC标记的小鼠抗小鼠NK1.1 （克隆：PK136）。
- 小心地从4.15取出离心下来的PBMC的上清液直至弯液面只是每个FACS管（约50微升），以避免细胞损失的底部的上方。使用剩余流量缓冲器有P-200微量重悬在每个FACS管中的PBMC和从每个FACS管除去（样品1 /＃）值得的体积和合并成一个新的FACS管标记为“汇集同种型”。
- 加入200μl准备5.2.1每个样品PBMC细胞表面的抗体混合物。允许的PBMC以immunolabel在冰上于黑暗中20分钟。弗里克吨他铝管一旦通过潜伏期中途轻轻拌匀。
- 用1ml流缓冲器洗净;降速在660 XG（最大RCF）×10分钟，在4℃。
- 重悬含有在200μl市售福尔马林系固定剂的外周血单个核细胞（见材料清单的细节）15分钟在冰上黑暗中所有FACS管。振动小管，一旦中途潜伏期轻轻拌匀。
- 用1毫升市售1X通透/洗涤缓冲液（见材料清单的详细信息）冲洗和自旋向下在660 XG（最大RCF）为10分钟，在4℃。
- 同时的PBMC停转，制备1的足够量：100稀释太平洋蓝共轭的小鼠抗小鼠GZMB的（克隆：GB11）在1×透/洗涤缓冲液胞内抗体来实现，每个样品200μl的体积。
- 在一个单独的试管中，准备了1单200微升体积：100稀释太平洋蓝-CON的jugated小鼠IgG1，κ（克隆：MOPC-21）同型对照抗体。
- 重悬每一实验PBMC样品的用200μl的1：100稀释的抗小鼠GZMB抗体，重悬单FACS管标记为“汇集同种型”与1的200微升体积：100稀释的同种型抗体。
- 允许所有PBMC样品到immunolabel在冰上于黑暗中20分钟。振动小管，一旦中途潜伏期轻轻拌匀。
- 用1ml流缓冲器洗净;降速在660×g离心（最大RCF）进行10分钟，在4℃下，重悬的PBMC用200μl流动缓冲以供分析。
- 流量cytometrically分析使用85微米的喷嘴集成之前在5.1节22建立胶质瘤浸润外周血单个核细胞和盖茨和PMT电压。一定要运行对流动每个样品的总体积流式细胞仪，以确保胶质瘤infilt总数的公平比较评级的PBMC每个样品中。
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Representative Results
下面浇注策略用于一个典型的实验：FSC-A对SSC-A→SSC-H与SSC-W→FSC-H与FSC-W→CD45与数→GR-1与CD11b的→ NK1.1与计数。盖茨放置的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞和NK1.1 + NK细胞，然后分层基于GZMB表达（图5A）。 Backgating那些鉴定为NK1.1 + NK细胞和Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞在我们的实验上的FSC-A对SSC-A确认NK细胞的小尺寸淋巴和骨髓细胞的相对大尺寸（细胞图5B）。原始数据文件（ 即 ，FCS文件）市售流式细胞仪数据分析软件进行分析，如的FlowJo。
总共18只C57BL / 6J小鼠用于证实这种方法。九（9）被移植了GL26-CIT-NT和9被移植了GL26-CIT-gal1i上的同一个D唉使用细胞（3×10 4）的当量数。三只小鼠每组安乐死在24，48和72小时后的肿瘤植入。数据表明，植入GL26-CIT-gal1i胶质瘤细胞进同源C57BL / 6J小鼠的大脑迅速诱导CD45 + PBMC中（图6A）的募集。基于在演示中使用特异性抗体鸡尾酒它可以进一步表明的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞和NK1.1 + NK细胞特异性内48小时肿瘤植入的（图输入 伽-1缺失肿瘤微图6B和6C）;胶质瘤浸润骨髓细胞远胜NK细胞的然而总数。
图1：GL26-CIT细胞颅内准备定植（A。）代表10X明场和GL26-CIT-NT（左图像）和GL26-CIT-gal1i（右图像）在培养细胞表面荧光显微照片。 （B）GL26-CIT-NT（左线）和GL26-CIT-gal1i（右线）全细胞裂解液的Western印迹。伽马微管蛋白（γ-浴盆。）显示为上样对照。 （C）的GL26-CIT小区从约50％汇合的T75组织培养瓶离心在550×g离心（最大RCF）中5分钟，在4℃下后沉淀。 （D）的含GL26-CIT细胞（白点）血细胞计数器的明视场视图1:1稀释用台盼蓝评估细胞数目和生存力。细胞应> 90％存活，以确保重现性肿瘤的生长。应取自标记为1到5的平方的细胞计数的平均值，以增加细胞数估计的准确度。在未补充的DMEM重悬在3×10 4个/微升颅内impla（E）GL26-CIT细胞ntation。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：立体定向灌输胶质瘤细胞的成C57BL / 6J小鼠的纹状体（A）外科手术室布局，可以显示所需要的手术器械和试剂。 （ 二）特写图一C57BL / 6J小鼠利用，在立体定位框架与合适的针安置在0.5毫米AP，2.5毫米ML和-3.0毫米DV相对于前囟门。 （ 三）背鼠标颅骨呈现前囟门的位置和靶位点的肿瘤细胞植入的看法。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：鼠标穿心灌注（A）进行解剖，研磨和小鼠脑组织的酶消化所需的试剂。 （二）在层流罩，致力于终端的鼠标外科手术穿心灌注氧合和肝素台氏的解决方案表示需要鼠标的仪器和试剂的布局。 （C）的心脏显示出正确的仪器及所需的穿心灌注展示位置示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：脑胶质瘤浸润的隔离外周血单个核细胞（一）战略包含早期原位胶质瘤植入小鼠脑组织的解剖。顶部面板演示同侧半球矢状平分远离对侧大脑半球。底部面板演示需要分离含有肿瘤植入物（紫色突出显示）目标组织的两个附加冠状削减。 （B）的单细胞脑组织沉淀（白色箭头）酶消化后，通过70微米的尼龙网和离心过滤。 （三）妥善堆积密度离心媒体之前离心梯度。白色箭头指示两个密度离心介质层之间形成的干净的界面。 （D）的离心表明形成在37％密度离心介质层白色箭头顶部的脂质层）和PBMC频带后密度离心分离介质梯度（由第概述Ë黑色虚线），在这两个层之间的接口。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：流式细胞门控策略用于识别胶质瘤浸润的Gr-1 + / CD11b的+髓系细胞及NK细胞（A）的步骤1：总免疫标记的细胞从一个密度离心媒体梯度的PBMC频带分离被选通到排除细胞碎片（FSC-A小于〜50 K）。步骤2和3：双峰歧视选通过滤出细胞聚集。步骤4：CD45的门，以确定胶质瘤浸润免疫细胞。同种型对照显示为灰色的剪影。第5步：CD45 +细胞分层基于GR-1和CD11b。同种型对照为GR-1和CD部11b重叠在情节和由金圆包围。红色圆圈表示GR-1 + / CD11b的+骨髓细胞。第5步“：GR-1 + / CD11b的+分层的基础上GZMB表达髓样细胞。作为前提，这些细胞不标注有防GZMB抗体在同型对照（灰色剪影）。第6步：GR-1 的低电池由黑色矩形在步骤5中所列的分层基于NK1.1表达。同种型对照显示为灰色的剪影。第6步“：基于GZMB表达NK1.1 高细胞分层。这些细胞确实标注有防GZMB抗体高于同型对照（灰色剪影）。的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞（B）的Backgating到FSC-A对SSC-甲证明，认为NK细胞具有较小的淋巴尺寸相比，较大尺寸的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞。“_blank”>点击此处查看该图的放大版本。
图6：外周血单个核细胞浸润比较入GL26-CIT-NT与GL26-CIT-gal1i肿瘤微环境在颅内肿瘤生长的前三天（A）总 CD45 +免疫细胞。 （B）CD45 + / GR-1 + / CD11b的+骨髓细胞。 （C），CD45 + /NK1.1 + NK细胞。从PBMC中从GL26-CIT-gal1i胶质瘤分离数据点由线条流畅连接，田地那些从GL26-CIT-NT胶质瘤分离由虚线连接。从三只小鼠胶质瘤浸润的PBMC每肿瘤类型在每个时间点进行分析。与上GL26-CIT-gal1i曲线的每一个数据点相关联的数字代表的褶皱感应特定的外周血单个核细胞类型的过度GL26慈叔NT在指定小时后肿瘤植入（HPI）。数据代表计数±平均值（SEM）的标准误差的免疫细胞的平均数。由2路方差分析进行统计分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议描述一种可再生的方法的PBMC的分离和流式细胞仪分析已渗入早期鼠脑肿瘤微环境。在由被立体定位植入到小鼠脑的纹状体的实验者指定的浓度产生神经胶质瘤细胞悬浮液。小鼠然后安乐死在由实验设计指定的预定的时间点和他们的大脑收获和加工以分离这些免疫标记与荧光标记的初级抗体的组合胶质瘤浸润的PBMC;免疫标记细胞，然后通过流式细胞术进行定量。虽然这里给出的示范着重于早期时间点，神经胶质瘤浸润的PBMC可在任何时间点后的肿瘤细胞植入直至鼠标濒死进行评估。该方法是高度模块化作为任意数量的不同抗体的组合可以被用于检查感兴趣我免疫细胞ncluding T细胞，B细胞，NK细胞，单核细胞和巨噬细胞。请注意，协议进行了优化与雌性C57BL / 6J小鼠8-10周龄使用。此年龄范围之外的小鼠可能改变循环的PBMC，这可能会导致细胞计数在等效时间点不属于代表此处呈现的数据的百分比。也可能需要表征实验如果替代肿瘤模型使用或如果小鼠比对B6背景其它用于由于这样的事实，菌株可在不同的PBMC型材（Jaxpheno6;小鼠Phenome数据库; Jackson实验室）。性别与环境条件下也能PBMC的频率和百分比之间的差距的来源。
此方法已被使用四种细胞表面的抗体，使检测的组合表现出的Gr-1 + / CD11b的+髓样细胞和NK1.1 + NK细胞，细胞类型牵连ガ的排斥升-1缺失神经胶质瘤。列入细胞内GZMB抗体的进一步使细胞毒性潜力的NK细胞亚群的检测。提供代表结果的免疫细胞浸润到初GL26-CIT胶质瘤在同系的C57BL / 6J小鼠，要么表达加仑-1的正常水平或已减少了因的shRNA介导的基因敲低的水平。示范通过表明胶质瘤浸润的PBMC可再现地分离，并尽快后24小时肿瘤植入定量表现出技术的灵敏度和重现性。除了 揭示肿瘤浸润GR-1 的高 /的CD11b +髓样细胞群，演示也揭示了GR-1 INT 人口/的CD11b +细胞 ，其身份目前是不确定的。另外的实验是必要的，以进一步破译该细胞群的特征。我们还注意到，我们没有发现CD45的容易区分人口
抗Gr-1抗体识别两者Ly6G和的Ly6C细胞表面蛋白所特有的多形和单核骨髓细胞， 分别为25。使用抗GR-1 antibodIES从而排除了这两种细胞群之间的区别。在我们的实验室的初步结果现在开始揭示早期GR-1 + / CD11b的+细胞浸润GAL-1缺失的神经胶质瘤微环境中更准确的描述光。 （：1A8克隆）和抗的Ly6C（克隆：AL-21）结合的抗Ly6G实验用抗CCR2抗体抗体一起现在表明的Gr-1 高 / CD11b的+细胞浸润初期加仑-1缺失肿瘤微（数据未显示）与高的Ly6C / CCR2 高炎性单核细胞相一致，尽管进一步的实验都必须确认此结果。
由于细胞失去期间参与分离胶质瘤浸润的PBMC重复离心和再悬浮的步骤可能发生，很可能观察到细胞计数实际上比什么都实际存在于完整的脑。然而，电子之间的差异xperimental组应如果七十○分之三十七密度离心媒体接口的等效体积的提取和如果每个样品的整个体积由流式细胞仪进行分析。如果不遵守这些步骤将导致样品之间的不公平比较，将妨碍公正的分析。量化进入大脑肿瘤微环境的PBMC的确切数目不能不是限制特定于此协议。替代方法，如免疫组织细胞计数策略也受到错误，由于基于体视计数和等效图像阈值对组织切片的显微照片的要求总细胞数的推断，其可以不同的背景染色的水平，从而可能导致假阴性或假阳性信号。然而，不同的分析方法之间的时程分析的比较应该显示类似的整体造型与时间相关的免疫涌入曲线。一个另外的缺点，以免疫组化方法是有效的流式细胞术结合在福尔马林固定的脑组织切片的上下文等同抗原性表位的某些抗体的无力。
还有在这个协议可以作为那些不熟悉其方法的局限性的几个关键步骤。一个这样的步骤是从颅骨大脑的收获而不损坏它。我们建议练的技术多次运行适当的实验之前。然而，由于大脑将最终被研磨，到大脑的浅层轻微损坏可能无关紧要胶质瘤浸润的PBMC的准确定量。没有经验的研究者可以最初发现难以第二步骤是密度离心媒体梯度的倾倒。该实验家“，形成一个简洁的界面，而覆盖在上面2毫升37％密度离心媒体的能力在70％的层是至关重要的PBMC可重放隔离。虽然这一步可能最初证明具有挑战性的，它极大地丰富的PBMC和大大降低的时间段另有要求试样分析如果全脑组织其中待cytometrically分析流动。 PBMC富集也减少了由流式细胞仪捕获的，因而减少.fcs文件大小和帮助解决稀有脑浸润免疫细胞群的事件的总数。为了建立一个干净的密度梯度离心接口，建议使用具有平滑柱塞作用的P-1000微量浇37％密度离心媒体的最佳效果。角度的15ml离心管中约有20-30度高于台面。休息微量的尖端上的管3-5毫升标记的70％密度离心介质层的表面上方的一侧。倒入平稳，慢慢等，以最大限度地减少37％，密度离心媒体，因为它extru的公开向外势头从宫为了微量移液器尖端，以避免干扰底层70％密度离心媒体。最后，一个事实，即脑组织结构在分离的过程中必然破坏神经胶质瘤浸润的PBMC意味着额外的小鼠将需要获得时间点匹配的组织学数据。
通过注入的致癌基因的质粒DNA进入正常啮齿动物大脑中产生较新的神经胶质瘤模型已开发近年来26-32。这些“内生”肿瘤模型规避造成立体定向移植体外癌细胞，更加紧密地模仿的临床神经胶质瘤的组织学特点的潜在假象。本文所描述的方法是非常适合于表征这些更临床相关的模型系统免疫浸润事件的研究。研究在新生小鼠免疫涌入也可以使用这种方法虽然新生儿备忘录的密度进行Ë脑小于成年人，这可能需要的酶消化步骤的优化，以防止过度的脑组织消化。该技术的其它应用包括调查关于替代类的炎性脑疾病除了恶性肿瘤如实验性变应性脑脊髓炎（EAE）和免疫反应的病毒感染。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是支持的美国国立卫生研究院神经疾病和中风（NIH / NINDS）授予R01-NS074387，R01-NS057711和R21-NS091555到的MGC /研究所; NIH / NINDS授予R01-NS061107，R01-NS076991，R01-NS082311和R21-NS084275到PRL;从利亚的快乐心助学金，密歇根大学综合癌症中心颁发给MGC和PRL大学;神经外科，医学密歇根大学的大学部;密歇根州的临床规范研究所与健康研究，由美国国立卫生研究院资助2UL1-TR000433支持;由NIH / NCI（国家癌症研究所）资助T32-CA009676支持的密歇根大学癌症生物学培训资助;密歇根培训的大学临床和基础神经科学由美国国立卫生研究院/ NINDS支持授予T32-NS007222;和密歇根大学医学院科学家培训项目的大学由美国国立卫生研究院/ NIGMS（通用医学科学研究所）的支持给予T32-GM007863。作者一再次感谢来自卡琳Muraszko博士和神经外科接收的学术领导和支持;到M.达尔格伦，D TomFord的，和S. Napolitan高超的行政支持;以M. Dzaman优秀的技术援助;和菲尔楼詹金斯向购买蔡司3D扫描电子显微镜的慷慨支持。我们也承认Kuchroo实验室在哈佛医学院从脑单个核细胞分离的密度离心媒体介导的战略的修改后的版本被吸引。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
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